金君 孫仁華 呼邦傳

[摘要] 血流感染是指病原微生物進入血液循環(huán)并生長繁殖，產(chǎn)生毒素、代謝產(chǎn)物，導致全身炎癥反應(yīng)的感染性疾病，是當前全世界臨床醫(yī)生面臨的重大挑戰(zhàn)之一。早期診斷并使用有效的抗感染方案能縮短抗生素使用時長、降低患者死亡率。血培養(yǎng)及藥物敏感試驗是目前臨床診斷血流感染的金標準，但其存在病原學檢測結(jié)果時間長、陽性率低等缺點，不能滿足血流感染危重患者快速及精準治療的需求。近年來隨著分子檢測技術(shù)的發(fā)展，涌現(xiàn)出DNA微陣列、質(zhì)譜分析、數(shù)字PCR、二代高通量測序等分子診斷技術(shù)，較血培養(yǎng)能更快速地識別病原菌及耐藥基因、提高檢測的陽性率，指導臨床醫(yī)師早期進行目標抗生素干預，對改善血流感染患者臨床預后具有潛在價值，并可降低病原菌耐藥性。

[關(guān)鍵詞] 血流感染;血培養(yǎng);分子診斷技術(shù);研究進展

[中圖分類號] R631? ? ? ? ? [文獻標識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-9701（2020）36-0182-06

[Abstract] Bloodstream infection is an infectious disease in which pathogenic microorganisms enter the blood circulation， and grow and multiply， producing toxins and metabolites leading to systemic inflammation. It is one of the major challenges faced by clinicians all over the world. Early diagnosis and effective anti-infection regimens can shorten the duration of antibiotic use and reduce the mortality of patients. Blood culture and drug sensitivity test are the gold standards for clinical diagnosis of bloodstream infection， but they have disadvantages such as the time-consuming detection results of etiology and the low positive rate， which cannot meet the needs of rapid and precise treatment for critically ill patients with bloodstream infection. In recent years， with the development of molecular detection technology， DNA microarray， mass spectrometry， digital PCR， second-generation high-throughput sequencing and other molecular diagnostic technologies have emerged. Compared with blood culture， these techniques can quickly identify pathogenic bacteria and drug-resistant genes， improve the positive detection rate， guide clinicians to conduct targeted antibiotic intervention in the early stage， and have potential value in improving the clinical prognosis of patients with bloodstream infection， and in the long run， reduce the resistance of pathogenic bacteria. Therefore， this paper reviews the research progress of molecular diagnostic techniques for bloodstream infection.

[Key words] Bloodstream infection; Blood culture; Molecular diagnostic technique; Research progress

近年來，血流感染（Bloodstream infection，BSI）的發(fā)病率呈上升趨勢，這與重癥病房侵入性操作多、廣譜抗生素使用不合理、多重耐藥菌的增多及人口老齡化等因素相關(guān)。Lamy等[1]的調(diào)查研究數(shù)據(jù)顯示，全球每年BSI患者高達3150萬人，BSI已成為歐洲和北美國家人群的七大死因之一。近20年來，發(fā)達國家的BSI患病率達334/10 000～571/10 000，死亡率高達27%～36%[2]。美國流行病調(diào)查數(shù)據(jù)顯示，2010年～2015年美國因BSI入院患者的比例從3.9%上升至9.4%，并導致每年近8萬人死亡;歐洲報道每年有近120萬例BSI發(fā)生，可導致15.7萬患者死亡。Zhou等[3]對2017年北京公共衛(wèi)生信息中心數(shù)據(jù)庫的調(diào)查研究顯示，當年BSI在北京的發(fā)病率達461/100 000，死亡率為79/100 000，根據(jù)當年全國人口推算，全國每年新發(fā)BSI例數(shù)達486萬人，死亡例數(shù)為83萬人。相較于普通病房，BSI在ICU中的發(fā)病率及病死率顯著增加。謝劍鋒等[4]對全國ICU患者的BSI流行病學進行調(diào)查分析，研究顯示BSI發(fā)病率在ICU中高達20.6%，形勢非常嚴峻。

早期檢測致病菌、合理使用抗菌藥物，能顯著改善BSI患者的預后。研究顯示，膿毒癥患者每延遲目標抗生素治療1 h，死亡率增加7.6%;而延遲抗生素治療6 h，死亡率增加58%[5]。在入住ICU未接受有效抗生素治療的BSI患者中，其60 d死亡率高達88%[6]。盡管目前BSI診斷的金標準為血培養(yǎng)和藥敏試驗，但其仍存在較多的局限性，如檢出陽性率低，報告結(jié)果時間長達24～72 h。此外，對多種病原菌混合感染進行血培養(yǎng)時，還額外需要24 h進行亞培養(yǎng)。研究顯示，對BSI患者采用經(jīng)驗性抗菌治療策略，可能導致多重耐藥病原體的選擇和傳播，并增加侵襲性真菌感染的發(fā)生率[7]。因血培養(yǎng)很難對BSI進行早期診斷，常會導致診斷錯誤或抗生素治療強度不足，對一些疑似BSI的患者而言可能致命[8]。因此，需要建立一種快速提供病原菌及耐藥信息的檢測方法，為目標抗生素治療方案提供實驗室依據(jù)，從而達到精準治療的效果。近年來，隨著分子檢測手段的發(fā)展，用于快速診斷BSI病原菌的方法層出不窮，這些分子診斷技術(shù)被用于補充血培養(yǎng)的不足，可分為基于陽性血培養(yǎng)樣本病原菌檢測和全血中直接檢測病原菌的檢測方法。前者包括基質(zhì)輔助激光解吸/電離飛行時間質(zhì)譜分析、熒光原位雜交技術(shù)、多重PCR技術(shù)、DNA微陣列技術(shù)等;后者包括實時定量PCR、二代測序技術(shù)、T2磁共振檢測技術(shù)、數(shù)字PCR技術(shù)等。

1 基于陽性血培養(yǎng)樣本的檢測方法

1.1 基質(zhì)輔助激光解吸/電離飛行時間質(zhì)譜分析（Matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry，MALDI-TOF MS）

MALDI-TOF MS運用不同細菌、真菌間存在特異性蛋白質(zhì)譜峰的原理鑒定病原菌，該技術(shù)將待測樣本轉(zhuǎn)化為運動的離子，在磁場作用下這些離子因不同的質(zhì)荷比分離，檢測儀記錄這些電離的強度并形成特異性質(zhì)譜圖，與數(shù)據(jù)庫匹配后得到檢測結(jié)果。該技術(shù)在血液培養(yǎng)陽性后進行檢測，可檢測包括革蘭陽性菌、革蘭陰性菌、厭氧菌及真菌在內(nèi)的多種微生物，一般較常規(guī)血培養(yǎng)結(jié)果早18～48 h，同時還可檢測超廣譜β-內(nèi)酰胺酶和碳青酶烯類耐藥基因[9]，基于該法的VITEK MS系統(tǒng)還可用于鑒別諾卡菌、分枝桿菌和絲狀真菌。該技術(shù)方法可靠，能快速診斷單種菌陽性血培養(yǎng)瓶中的病原菌，準確率達71%～96%[10-11]。眾多研究顯示，利用MALDI-TOF MS技術(shù)可快速提供有效的微生物學信息，對病原菌進行快速診斷，據(jù)此，臨床醫(yī)師能更早地調(diào)整抗生素方案，可使患者的住院時間縮短2～6 d，死亡率降低4%～9%[12-14]。但該技術(shù)仍存在局限性，針對多菌感染的研究顯示，該法能檢測85.7%的病原菌[15]，不能鑒定混合培養(yǎng)基中的所有微生物，這可能與同一選擇性培養(yǎng)基生長的不同微生物量較少有關(guān)，其對真菌及鏈球菌檢測的效果較差，且抗生素應(yīng)用會影響其鑒定的準確性。此外，該技術(shù)鑒定微生物依賴已知的數(shù)據(jù)庫，檢測的準確性受其數(shù)據(jù)庫影響，但隨著數(shù)據(jù)庫的不斷完善，更多微生物及細菌耐藥性將被識別，該技術(shù)的臨床診療價值也會隨之增加。

1.2 熒光原位雜交技術(shù)（Fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH）

熒光原位雜交是通過熒光素標記的寡核苷酸探針特異性結(jié)合靶病原體基因組中的核糖體DNA（rDNA）區(qū)域，即細菌的16S rDNA基因或真菌的18S rDNA基因，通過熒光顯微鏡觀察探針和互補序列之間特異性結(jié)合，獲得細胞核內(nèi)染色體或基因信息的技術(shù)，不依賴病原物質(zhì)的擴增。肽核酸熒光原位雜交（Peptide nucleic fluorescent in situ hybridization，PNA-FISH）是利用肽核酸探針（PNA）與生物特異性rRNA雜交，并通過熒光顯微鏡進行檢測，直接從陽性血培養(yǎng)瓶中檢測常見的病原菌，其根據(jù)革蘭染色結(jié)果選擇特異性探針，包括葡萄球菌探針（金黃色葡萄球菌、CoNS）、腸球菌探針（糞腸球菌、屎腸球菌）、革蘭陰性細菌探針（大腸埃希菌、銅綠假單胞菌、肺炎克雷伯菌）和酵母探針（白色念珠菌、光滑念珠菌、副念珠菌、假絲酵母菌）。該技術(shù)常用Accelerate pheno system，該系統(tǒng)能在7 h內(nèi)全自動地從陽性血培養(yǎng)樣本中快速識別病原菌及耐藥信息，診斷準確率達88.7%～100.0%[16]。有研究顯示，該技術(shù)聯(lián)合抗生素管理方案時，能明顯降低BSI患者的住院時間及住院死亡率，在無明確的抗生素管理方案時，則可能掩蓋快速診斷帶來的優(yōu)勢，導致上述臨床指標沒有明顯改善[17]。PNA-FISH的缺點是檢測依賴較高的病原數(shù)，檢測限達105 CFU/mL，血液中病原菌數(shù)量較少時不易檢出。快速熒光原位雜交技術(shù)（QuickFISH assay）是多色質(zhì)核酸雜交技術(shù)，檢測速度較PNA-FISH更快，操作更簡便快速，大大提高了檢測效率，其敏感性高達97.1%～100.0%，特異性為89.5%～100.0%[18-20]。Koncelik等[18-20]利用QuickFISH在30 min內(nèi)鑒別金黃色葡萄球菌和凝固酶陰性葡萄球菌，平均檢出時間、BSI患者住院時間、萬古霉素使用時間均較血培養(yǎng)顯著縮短，并且接受QuickFISH檢測的患者還可節(jié)省總體住院費用，提示其在金黃色葡萄球菌感染鑒定中具有價值。此外，QuickFISH在鑒別不同真菌感染中也具有重要意義，能鑒別最常見的白念珠菌、副念珠菌及光滑念珠菌[21]。該技術(shù)仍存在一些局限，由于探針數(shù)量限制，只能識別常見病原菌，不能識別所有病原菌，且其不能提供藥敏信息，限制了其在臨床上的應(yīng)用。

1.3多重PCR技術(shù)

多重PCR技術(shù)是指在同一PCR反應(yīng)體系中加上多對引物，同時擴增出多個核酸片段的反應(yīng)，該技術(shù)鑒別速度快，可在同一反應(yīng)內(nèi)同時檢測多種致病菌及耐藥基因，可識別24種病原菌，包括19種細菌、5種念珠菌，能檢測出甲氧西林（mecA）、萬古霉素（vanA/B）和碳青霉烯（blaKPC）耐藥基因。FilmArray blood culture identification（BCID）是自動化多重PCR平臺，集核酸提取、純化擴增、檢測和分析為一體，可以在1 h內(nèi)從血培養(yǎng)陽性的血樣本中識別病原菌，覆蓋90%以上的BSI致病菌。多項隨機對照研究顯示，應(yīng)用該系統(tǒng)較血培養(yǎng)能更早獲得病原學信息，可更早對疑似BSI患者進行目標性抗菌治療，但其對臨床預后如死亡率、住院時間的改善不明顯[22-23]。Kang等[24]的研究結(jié)果顯示，該系統(tǒng)鑒定BSI病原菌總體敏感性可高達94.6%，在多重感染中敏感性則降至78.6%，提示其識別多重菌感染的敏感性不高，不能獲得所有病原菌信息。該技術(shù)對金黃色葡萄球菌、凝固酶陰性葡萄球菌的mecA基因檢測容易產(chǎn)生假陽性的結(jié)果，各項診斷研究中針對念珠菌感染的樣本較少，故需要更多大樣本研究以驗證其價值。

1.4 DNA微陣列

DNA微陣列利用光導化學合成、固相表面化學合成等技術(shù)，在固相表面形成成千上萬個寡核苷酸探針，與放射性同位素或熒光標記的DNA或cDNA雜交，可識別目的基因及檢測基因表達水平，能同時檢測多個病原體及耐藥基因。目前臨床已使用Verigene BC-GP、Verigene BC-GN核酸檢測技術(shù)，分別檢測革蘭陽性菌和革蘭陰性菌。BC-GP可檢測出12種革蘭陽性菌和3個耐藥基因，靈敏度達97.1%，特異度達100.0%;BC-GN能識別9種革蘭陰性菌和6種耐藥基因，靈敏度達98.0%，特異度達100.0%，兩者檢測時間僅需2.5 h。已有研究顯示，該技術(shù)能使疑似BSI的患者更早接受有效及最佳治療，縮短住院時間、降低住院死亡率[25]。有研究采用2 d抗生素變化率指標衡量該技術(shù)對BSI患者的臨床效益，提示該法能快速提供病原信息、提供抗生素更改依據(jù)，在BSI患者抗生素方案指導上有重要意義[26]。該技術(shù)的局限是對混合菌感染檢測效果不佳，其主要原因為靶病原菌數(shù)量不足。且該技術(shù)依賴準確的革蘭染色結(jié)果，如染色結(jié)果不準確導致選擇了不對應(yīng)的系統(tǒng)，則會出現(xiàn)假陰性結(jié)果。

2 基于全血直接檢測的方法

2.1 實時定量PCR（Real-time PCR，qPCR）

實時定量PCR技術(shù)可直接在全血中檢測病原菌，免去血液培養(yǎng)這一耗時步驟，常見的如SeptiFast系統(tǒng)，使用針對細菌16S rDNA和真菌18S rDNA區(qū)域的通用引物進行廣譜核酸擴增，然后對來自陽性血樣本的擴增產(chǎn)物進行測序，能在6 h內(nèi)檢測出包括6種真菌在內(nèi)的25種病原體，同時還可檢測mecA耐藥基因，該技術(shù)可檢測小于1 mL的血標本，避免了血培養(yǎng)需大量采集血液的缺點，對真菌的檢出限為100 CFU/mL，細菌的檢出限達3～30 CFU/mL[27]。研究顯示，SeptiFast系統(tǒng)較血培養(yǎng)陽性檢出率高13倍，且不受抗生素應(yīng)用的影響，對多種微生物感染的鑒定較血培養(yǎng)更有優(yōu)勢[28]。該法雖有減少檢出時間等優(yōu)勢，但其整體敏感性不高，在大樣本研究中，其敏感性僅有50%[29-30]，可能與血液中病原菌低于檢測限、靶DNA序列變異有關(guān)。既往隨機對照研究顯示，基于SeptiFast檢測的患者抗生素方案調(diào)整更迅速，能夠縮短抗菌藥物使用時間，但對患者的生存預后并無顯著改善，且不能獲得除mecA以外的耐藥基因信息，因此該法在臨床上的應(yīng)用仍存在局限[31]。Xpert MRSA/SA也是基于該技術(shù)的系統(tǒng)，主要通過檢測spa基因、mecA基因及金黃色葡萄球菌盒式染色體（SCCmec）在金黃色葡萄球菌的插入位點來鑒別MASA，其缺陷為引物和探針結(jié)合區(qū)存在突變或多態(tài)性可能會影響鑒定準確性。研究顯示，該系統(tǒng)檢測能降低患者住院時間，但對降低患者住院死亡率證據(jù)不足?？紤]到目前研究的樣本量有限，仍需進一步進行大型多中心研究明確該方法帶來的臨床效益。

2.2二代測序技術(shù)（Next-generation sequencing technology，NGS）

NGS也被稱為高通量并行測序，可快速對樣本中全部DNA或RNA進行測序，能一次性對多個靶基因進行檢測，具有敏感性及特異性高、所需樣本量小等優(yōu)勢。目前認為NGS作為一種新的BSI致病微生物檢測方法，Horiba等[32]的研究顯示，NGS能在BSI發(fā)病前7 d檢測到血液中的致病菌，提示該方法能夠提前預測患者發(fā)生BSI的潛力。另有小樣本研究提示，NGS技術(shù)檢測陽性率是血培養(yǎng)的6倍，可致53%抗生素方案改變，即使不能獲得耐藥信息，也能帶來臨床獲益，如縮短患者住院時間、降低患者住院死亡率等[33]。同樣，NGS也存在局限性，如檢測費用高、周期相對長、不能檢測耐藥基因、需要專業(yè)團隊等，尤其是檢測報告時間常需要2～3 d，但其對臨床少見菌的鑒定和新菌種的發(fā)現(xiàn)方面更具優(yōu)勢。

2.3 T2磁共振檢測（T2 magnetic resonance，T2MR）

T2MR是利用核磁共振（NMR）技術(shù)直接檢測全血中的病原菌，其原理是對病原體進行特異性核酸擴增，然后將擴增產(chǎn)物與富含探針的超順磁性納米顆粒雜交，雜交會導致納米粒子聚集，如檢測到樣本的T2MR信號變化，提示存在待檢測的病原菌。所有步驟包括細胞裂解、靶DNA擴增、擴增產(chǎn)物T2MR檢測，均由T2Dx儀器自動完成，該技術(shù)具有較高的臨床敏感性，能檢測到樣本中極少量的靶核酸，檢出限達1～3 CFU/mL，優(yōu)于PCR技術(shù)。一項納入140例疑似BSI患者血標本的研究[34]比較了血培養(yǎng)和T2MR檢測方法，結(jié)果顯示，T2MR技術(shù)檢測敏感性和特異性分別為83.3%和97.6%，報告結(jié)果時間僅需4～7 h，明顯優(yōu)于血培養(yǎng)。該技術(shù)除能檢測5種最常見的BSI細菌（大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、銅綠假單胞菌和糞腸球菌）外，基于該技術(shù)的T2Candida還能檢測5種念珠菌（白色念珠菌、光滑念珠菌、副念珠菌、熱帶念珠菌和假絲酵母菌）。DIRECT2試驗提示其靈敏度達89%，且不易受抗真菌治療的影響，該方法對縮短念珠菌檢測、菌種鑒定時間及改善真菌感染患者預后有重要意義[35]。但該技術(shù)存在局限，如檢測到病原菌種類較少、不能提供藥敏信息，且檢測費用昂貴，導致其臨床應(yīng)用困難，未來仍需更多研究克服上述局限性，發(fā)現(xiàn)改善BSI患者臨床預后的潛力。

2.4 滴液數(shù)字PCR技術(shù)

滴液數(shù)字聚合酶鏈反應(yīng)（Droplet digital PCR，ddPCR）是不依賴額外標準曲線對目標序列進行絕對定量的分子診斷技術(shù)。ddPCR技術(shù)將樣本分割成數(shù)萬個微滴，利用微滴分析儀對每一個擴增后的微滴進行檢測，通過記錄的熒光信號幅度判斷微滴是否含待檢測的核酸靶分子，從而實現(xiàn)核酸靶分子的絕對定量。Wouters等[36]通過ddPCR技術(shù)檢測疑似BSI患者的血液樣本，發(fā)現(xiàn)該技術(shù)能在4 h內(nèi)鑒別陰性或陽性細菌、真菌，且認為ddPCR較其他分子診斷技術(shù)如SepsiTest具有更高的敏感性，適合極低含量目標片段定量或定性檢測。但該技術(shù)鑒別真菌的敏感性相對較低，且該研究采用泛細菌、真菌引物，因此未能確定具體菌屬及藥敏信息。Zeng等[37]使用ddPCR技術(shù)，通過對引物的設(shè)計可進一步確定菌屬及耐藥信息;通過設(shè)計針對CpsE基因的ddPCR引物識別無乳鏈球菌，發(fā)現(xiàn)ddPCR具有高度敏感性、特異性及良好的重復性。Abram等[38]研發(fā)了名為IC3D的快速診斷系統(tǒng)，集合了ddPCR檢測技術(shù)和高通量三維粒子計數(shù)系統(tǒng)，可在1 h內(nèi)對全血標本進行細菌鑒定和藥敏分析，檢出限達10 CFU/mL，對比報道中的qPCR檢出限1000 CFU/mL，具有更高的敏感度。該方法存在一定的局限性，如ddPCR檢測基于熒光探針，對引物特異性較高，且選擇不同的靶基因會影響檢測有效性，其高敏感度可能造成假陽性結(jié)果，且目前仍需大型研究將ddPCR技術(shù)應(yīng)用到臨床BSI抗生素管理中，以明確其潛在的臨床價值。

綜上所述，當前BSI的高發(fā)生率和高死亡率已得到廣泛關(guān)注。就診斷而言，血培養(yǎng)仍是診斷BSI的金標準，但血培養(yǎng)在快速診斷和檢測陽性率低方面仍存在局限性。目前研究顯示，分子診斷對BSI病原學診斷具有較大潛力，隨著對微生物基因組學的深入了解和分子診斷技術(shù)的發(fā)展，相信未來人們能夠在數(shù)小時內(nèi)同步快速識別病原體及其耐藥基因。多種檢測技術(shù)聯(lián)合應(yīng)用，可以提供可靠的BSI診斷結(jié)果，有效指導臨床合理用藥、及時診治、早期精準地優(yōu)化抗感染方案、有效提高BSI患者的生存率。分子技術(shù)將成為BSI診治必不可少的重要工具。

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（收稿日期：2020-10-10）