高衛(wèi)安 黃烈平 吳金華

[摘要] 目的 探討兒童免疫力與維生素D受體基因（Vitamin D receptor，VDR）的相關(guān)性，揭示VDR基因多態(tài)性和兒童免疫力的相關(guān)性，并研究其在免疫力低下發(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)制。 方法 選取2018年1月～2020年1月在我院進(jìn)行檢查的0～14歲兒童80例，根據(jù)T淋巴細(xì)胞亞群檢測(cè)，將兒童分為研究組（免疫力低下）和對(duì)照組（健康），每組各40例。收集各組兒童的年齡、身高等臨床資料及外周血標(biāo)本，運(yùn)用化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)其血清中維生素D（VD）的濃度。設(shè)計(jì)引物用位點(diǎn)阻滯法，進(jìn)行VDR多態(tài)性位點(diǎn)Apa I、Bsm I、Taq I、Fok I的檢測(cè)。 結(jié)果 兩組VDR多態(tài)性位點(diǎn)Bsm I、Taq I、Fok I基因型比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）;兩組Apa I基因型的分布比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。研究組外周血清中25-OH VD水平低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。研究組感冒次數(shù)多于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），且感冒次數(shù)與VD水平呈負(fù)相關(guān)。 結(jié)論 Apa Ⅰ基因多態(tài)性可能在免疫力低下的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮作用，Bsm I、Taq I、Fok I基因多態(tài)性則與其無(wú)關(guān)。研究組VD水平低于對(duì)照組，提示血清VD水平可能對(duì)免疫力有增強(qiáng)作用。

[關(guān)鍵詞] 維生素D受體;基因多態(tài)性;兒童;免疫力

[中圖分類號(hào)] R729? ? ? ? ? [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A? ? ? ? ? [文章編號(hào)] 1673-9701（2020）32-0015-05

[Abstract] Objective To explore the correlation between child immunity and vitamin D receptor gene（vitamin D receptor， VDR）， to reveal the correlation between VDR gene polymorphism and child immunity， and to study its mechanism in development in the development of low immunity. Methods A total of 80 children aged 0-14 were selected from January 2018 to January 2020 in our hospital， according to the detection of T lymphocyte subsets， they were divided into research group（immunocompromised） and control group（healthy） with 40 children in each group. And the clinical data such as age and height， and the peripheral blood samples of children were collected. The concentration of vitamin D（VD） in serum was detected using chemiluminescence method. The VDR polymorphism sites Apa I， Bsm I， Taq I， Fok I were detected by site block method for primer design. Results There were no significant differences in the Bsm I， Taq I and Fok I genotypes of VDR polymorphism sites between the study group and the control group（P>0.05）. The distribution of Apa I genotype in the two groups was statistically different（P<0.01）. The 25-OH VD level in the peripheral serum of the study group was lower than that of the control group， and the difference was statistically significant（P<0.05）. The number of colds in the study group was higher than that in the control group， and the difference was statistically significant（P<0.05）. The number of colds and VD levels had a negative correlation trend. Conclusion The polymorphism of Apa I gene may play a role in the pathogenesis of immunocompromise， but the polymorphism of Bsm I， Taq I， and Fok I genes has nothing to do with it. The level of VD in the study group was lower than that in the control group， suggesting that the level of serum VD may enhance immunity.

[Key words] Vitamin D receptor; Gene polymorphism; Children; Immunity

維生素D（Vitamin D，VD）是一種擁有廣泛生理功能的激素和營(yíng)養(yǎng)素，不僅影響鈣磷代謝和骨組織礦化，還與糖尿病、心血管疾病、免疫性疾病及腫瘤等密切相關(guān)[1]。大量流行病學(xué)研究顯示，VD缺乏在兒童中普遍發(fā)生，30%～40%的兒童存在不同程度的VD缺乏[2-6]。這不僅影響兒童的生長(zhǎng)發(fā)育，且可能影響其未來(lái)的健康狀況。免疫力是兒童抵御疾病的基本能力，免疫是維持機(jī)體免受感染性疾病感染的穩(wěn)定狀態(tài)，它是一套復(fù)雜的生理機(jī)制，可讓機(jī)體識(shí)別、中和、消除異物。其中T淋巴細(xì)胞亞群在機(jī)體免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用，CD4+具有增強(qiáng)吞噬細(xì)胞的抗感染免疫功能，CD3+為外周血成熟T細(xì)胞，其濃度的降低提示T細(xì)胞免疫功能低下。CD8+在細(xì)胞調(diào)節(jié)及免疫功能中具有抑制作用。CD4+/CD8+比值是反映機(jī)體免疫系統(tǒng)內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的一個(gè)重要指標(biāo)，CD4+/CD8+比值降低提示機(jī)體免疫功能受到抑制，以此作為免疫功能的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)。

學(xué)齡前是兒童生長(zhǎng)發(fā)育的關(guān)鍵時(shí)期，該時(shí)期的兒童免疫功能差，易發(fā)生疾病，而感染是兒童發(fā)病和死亡的主要原因[7-8]。多項(xiàng)研究表明，VD可提高兒童自身免疫功能，減少微生物病原體的感染[9-13]。呼吸系統(tǒng)是兒童最易受到侵犯的系統(tǒng)，江笑文[14]發(fā)現(xiàn)，反復(fù)呼吸道感染患兒存在嚴(yán)重的VD缺乏和免疫力低下的情況，表明VD缺乏可能會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞免疫功能異常，從而增加呼吸道反復(fù)感染的風(fēng)險(xiǎn)。李微娜等[15]對(duì)呼吸道反復(fù)感染的患兒采用VD聯(lián)合治療，結(jié)果顯示VD可有效改善患兒的臨床癥狀，減少感染次數(shù)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，VD可以通過多種機(jī)制影響感染的易感性和嚴(yán)重程度，它通過影響抗菌肽Cathelicidin的產(chǎn)生[16-17]，增加機(jī)體對(duì)病毒和細(xì)菌的敏感性，并通過特異性和非特異性免疫系統(tǒng)及NF-κB途徑影響感染過程中的細(xì)胞因子譜。VD的作用由胞質(zhì)維生素D受體（VDR）介導(dǎo)，25-羥維生素D3經(jīng)肝腎代謝產(chǎn)生后結(jié)合VDR，進(jìn)入細(xì)胞核，作為配體激活的轉(zhuǎn)錄因子并激活基因表達(dá)。VDR基因位于12q13.1號(hào)染色體上，具有多個(gè)多態(tài)性區(qū)域，其中一些與某些疾病的易感性有關(guān)[18]。這意味著VD敏感性存在巨大的個(gè)體間差異，且VD缺乏還會(huì)導(dǎo)致患病風(fēng)險(xiǎn)增加。因此，本研究通過探討兒童免疫力低下與VD水平及VDR基因多態(tài)性表達(dá)的相關(guān)性，以揭示VD在免疫力低下發(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2018年1月～2020年1月在我院進(jìn)行系統(tǒng)保健和正常體檢的寧波地區(qū)0～14歲兒童80例作為研究對(duì)象。納入標(biāo)準(zhǔn)：根據(jù)T淋巴細(xì)胞亞群檢測(cè)[19]的正常值參考范圍[CD4+：（410～1590）/μL，CD8+：（190～1140）/μL]，將兒童分為研究組（免疫力低下）和對(duì)照組（健康），每組各40例。采集兩組兒童的外周血標(biāo)本，并收集其年齡、身高等臨床資料。研究組中，男22例，女18例;平均年齡（6.41±2.02）歲。對(duì)照組中，男21例，女19例;平均年齡（6.03±1.89）歲。兩組的性別、年齡比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），具有可比性。排除標(biāo)準(zhǔn)[20]：排除合并心、肝、腎等器質(zhì)性病變或惡性腫瘤者、合并免疫相關(guān)疾病者及入組前有服用VD補(bǔ)充劑史的兒童。本研究經(jīng)我院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者及家屬簽署知情同意書。

1.2 方法與觀察指標(biāo)

所有的實(shí)驗(yàn)均單獨(dú)重復(fù)3次。采用全血DNA小量試劑盒（3001250，杭州新景生物）、總VD測(cè)定試劑盒（化學(xué)發(fā)光法）、NovoStartR SYBR qPCR SuperMix Plus（E096，上海近岸蛋白）、7500 FAST實(shí)時(shí)熒光PCR儀進(jìn)行檢測(cè)，引物由蘇州金唯智生物科技有限公司合成。見表1。

1.2.1全血DNA提取? 采集各組患兒外周血標(biāo)本，分裝于EDTA-K2抗凝管和普通干燥管中，使用全血DNA小量試劑盒，按照說(shuō)明書進(jìn)行全血DNA提取。并利用微量分光光度計(jì)對(duì)其濃度及純度進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.2 qPCR基因分型? 將提取的DNA作為擴(kuò)增反應(yīng)模板，加入NovoStartR SYBR qPCR SuperMix Plus和相應(yīng)的引物，采用傳統(tǒng)的三步法對(duì)VDR SNPs進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR分型。每例DNA模板同時(shí)在兩個(gè)反應(yīng)管中進(jìn)行，分別用引物對(duì)上游引物/野生型下游引物和引物對(duì)上游引物/突變型下游引物進(jìn)行擴(kuò)增，設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，利用擴(kuò)增阻滯突變系統(tǒng)法進(jìn)行基因分型。

1.2.3 25-羥維生素D3水平檢測(cè)? 檢測(cè)血清25-羥維生素D3水平，采用總VD體外診斷免疫試劑盒測(cè)定分析，利用ADVIA Centaur全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光免疫分析儀，確定VD水平。

1.2.4 T淋巴細(xì)胞亞群檢測(cè)? 使用流式細(xì)胞儀對(duì)T淋巴細(xì)胞亞群水平進(jìn)行測(cè)定，T淋巴細(xì)胞亞群檢測(cè)項(xiàng)目包括CD3+、CD4+、CD8+及CD4+/CD8+。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料用（x±s）表示，采用t檢驗(yàn);計(jì)數(shù)資料用[n（%）]表示，采用χ2檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 VDR多態(tài)性位點(diǎn)檢測(cè)方法可行性

通過前期實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，以VDR基因的rs2228570、rs1544410、rs7975232三個(gè)SNP位點(diǎn)的突變堿基，利用所設(shè)計(jì)的特異性引物對(duì)全血DNA進(jìn)行SNP位點(diǎn)特異性擴(kuò)增，根據(jù)7500 FAST實(shí)時(shí)熒光PCR儀的分析結(jié)果得到基因型，與測(cè)序結(jié)果比對(duì)后發(fā)現(xiàn)，11個(gè)樣本采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法基因分型結(jié)果與測(cè)序結(jié)果均一致。證明該方法特異性高、重復(fù)性高，操作方便快捷，可以為本研究提供檢測(cè)技術(shù)支持。

2.2兩組VDR多態(tài)性位點(diǎn)比較

2.2.1 兩組Bsm I檢測(cè)結(jié)果比較? Bsm I（rs1544410）基因序列的野生基因型為GG，突變基因型為AG和AA，研究組和對(duì)照組均未檢測(cè)到另一突變基因型AA。兩個(gè)不同分組基因頻率分布經(jīng)Hardy-Weinberg平衡定律（H-W test）檢測(cè)，顯示均符合H-W分布（P>0.05）。檢測(cè)到的基因型GG和AG在兩組中的分布比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見表2。

2.2.2 兩組Fok I檢測(cè)結(jié)果比較? Fok I（rs2228570）基因序列的野生基因型為CC，突變基因型是CT、TT，符合H-W分布（P>0.05）。此三種基因型在研究組和對(duì)照組中的分布比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見表3。

2.2.3 兩組Taq I檢測(cè)結(jié)果比較? Taq I（rs731236）基因序列的野生基因型為TT，突變基因型為CT和CC，研究組與對(duì)照組均未檢測(cè)到突變型基因CC，符合H-W分布（P>0.05）?；蛐蚑T、CT在兩組中的分布比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見表4。

2.2.4 兩組Apa I檢測(cè)結(jié)果比較? Apa I（rs7975232）基因序列的野生基因型為CC，突變基因型為CA、AA，符合H-W分布（P>0.05）。三種基因型在兩組的分布比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見表5。

2.2.5 兩組外周血清中25-羥維生素D3水平比較? 研究組25-羥維生素D3水平為（45.51±5.20）nmol/L，低于對(duì)照組的（60.25±4.60）nmol/L，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。見表6、圖1。

2.2.6 兩組VD水平與臨床特征相關(guān)性? 研究組近一年感冒次數(shù)為（10.12±2.30）次，高于對(duì)照組的（4.07±1.30）次，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見圖2。感冒次數(shù)與25-羥維生素D3水平呈負(fù)相關(guān)，即血清中25-羥維生素D3水平越高，感冒次數(shù)越少。見圖3。

3討論

先天免疫力是病原體入侵之后人體的第一道防線，其中最重要的是先天免疫細(xì)胞。當(dāng)出現(xiàn)諸如昆蟲叮咬等微環(huán)境損傷時(shí)，最先出現(xiàn)的是中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞。它們分泌具有高度破壞性的物質(zhì)，包括各種活性酶和化學(xué)成分，吞噬并消化受損的物質(zhì)。當(dāng)兩種細(xì)胞的作用未奏效時(shí)，感染就引起了淋巴細(xì)胞的注意，淋巴細(xì)胞具有特異性識(shí)別和記憶功能，使免疫系統(tǒng)能夠做出更多的反應(yīng)并記住各種感染類型，從而以更快、更有效的反擊來(lái)應(yīng)對(duì)再次感染，這些響應(yīng)都依賴于特定基因的選擇性表達(dá)。

VD對(duì)人體的免疫系統(tǒng)有重要影響，其既可以調(diào)節(jié)先天免疫和適應(yīng)性免疫，還可以調(diào)節(jié)炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)。一項(xiàng)匯集11 321名參與者的Meta分析顯示，補(bǔ)充VD可降低受試者急性呼吸道感染的風(fēng)險(xiǎn)，且對(duì)VD缺乏患者受益最大[19]，Bergman等[20]匯總了11項(xiàng)隨機(jī)安慰劑對(duì)照試驗(yàn)，共涉及5660人（平均年齡16歲，6個(gè)月～75歲），分析結(jié)果顯示，補(bǔ)充VD可顯著降低呼吸道感染的風(fēng)險(xiǎn)（P<0.01）。已有的研究顯示，反復(fù)呼吸道感染患兒存在25-羥維生素D3和免疫球蛋白功能降低的情況，補(bǔ)充VD后，患兒機(jī)體免疫力顯著提高，呼吸道感染的發(fā)生率顯著降低[21]。本研究通過位點(diǎn)阻滯法進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，Apa I基因三種基因型在實(shí)驗(yàn)與對(duì)照組中的分布比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），Apa I基因的野生基因型（CC）相比突變基因型（CA、AA）有更好的抗病能力（P<0.05），而與Bsm I、Taq I、Fok I基因的多態(tài)性無(wú)關(guān)。孫越等[22]的研究顯示，Apa I突變型基因人群中，血清免疫球蛋白水平顯著低于正常非突變?nèi)巳?，?yàn)證了該基因型對(duì)免疫力的影響。

VD與免疫系統(tǒng)之間存在多種相互作用，大多數(shù)免疫細(xì)胞在自身受刺激后可表達(dá)VDR。研究顯示，VD調(diào)節(jié)炎癥和免疫力的機(jī)制似乎是多方面的，其可以調(diào)控巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞的活性，以及中性粒細(xì)胞中各種Toll樣受體介導(dǎo)的信號(hào)通路。本研究顯示，研究組25-羥維生素D3水平低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），并且研究對(duì)象的感冒次數(shù)與25-羥維生素D3水平呈負(fù)相關(guān)，即VD在一定程度上能夠增強(qiáng)兒童免疫力。VDR分布于各種組織中，VD調(diào)控機(jī)制具有多樣性及重要性。但是目前的研究尚未明確VD的補(bǔ)充標(biāo)準(zhǔn)，根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，需要結(jié)合VDR基因多態(tài)性及進(jìn)一步的臨床試驗(yàn)以確定最合適的補(bǔ)充方案，以此判斷VD缺乏的原因及用什么方式改善這種狀況。

綜上所述，VDR基因多態(tài)性與兒童免疫力具有相關(guān)性，其相關(guān)基因?yàn)锳pa I，野生型的免疫力高于突變型，并且VD可能具有與兒童感染風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)的免疫調(diào)節(jié)功能，血清中VD含量與感冒次數(shù)呈負(fù)相關(guān)。

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（收稿日期：2020-07-23）