孫凱 陳夕軍 沈迎春 徐冬祥 陳宸 黃奔立

摘要：為明確江蘇省栝樓果實腐爛病病原并選擇對其有效的防控藥劑，從田間采集病果，經單孢分離后，運用形態(tài)學和分子生物學方法進行鑒定。根據菌絲形狀、菌落特征、孢子形態(tài)與類型，并結合病菌ITS區(qū)序列分析，明確引起江蘇省栝樓果實腐爛病的病原菌為擬莖點霉。室內毒力測定結果表明，吡唑醚菌酯、咪鮮胺、多菌靈、戊唑醇、嘧菌酯、丙硫菌唑和中生菌素等藥劑對該病菌均有較高的毒力，抑制中濃度（EC50）為0.005 5～19.947 3 mg/L;而噻呋酰胺、多抗霉素和春雷霉素對該病菌基本無抑制作用，即使?jié)舛却笥?00 mg/L，菌絲生長抑制率也僅為20%～30%。明確病原物及化學藥劑對該病菌的毒力，將為該病的發(fā)生、流行和防控研究提供理論依據。

關鍵詞：病原鑒定;毒力測定;殺菌劑;爛果病;栝樓

中圖分類號： S435.67 ?文獻標志碼： A ?文章編號：1002-1302（2020）24-0112-05

栝樓（Trichosanthes kirilowii Maxim），葫蘆科栝樓屬多年生藤本植物，又稱瓜蔞、藥瓜、野瓜、吊瓜、野葫蘆等，是一種重要的中藥材?！渡褶r本草經》中將之歸為藥之中品，注“味苦寒、主消渴、身熱、煩滿大熱、補虛安中、續(xù)絕傷”;《本草綱目》中認為栝樓有治痰熱咳嗽、胸痹、結胸、肺痿咳血、消渴、黃疸、便秘和癰腫初起的功能[1]。2019年末至今，新型冠狀病毒肺炎肆虐全國，并在世界多個國家和地區(qū)蔓延。馬婧等基于冠狀病毒的木瓜樣蛋白酶（papain-like proteases，PLP）進行中藥成分-靶點分子對接篩選發(fā)現，栝樓中有5種活性成分可與PLP形成復合物，其中主要活性成分為栝樓酯堿，說明栝樓可作為防治新冠肺炎的湯劑成分[2]。而且，以栝樓為主要成分的多種中藥湯劑對其他急慢性肺病均有較好的臨床效果[3-5]。

正因為瓜簍藥用價值高，栝樓籽又可作為休閑食品，近年來全國栝樓種植面積不斷增加。在江蘇省各地，多個以栝樓種植為特色的“栝樓小鎮(zhèn)” “栝樓康養(yǎng)小鎮(zhèn)”和“栝樓產業(yè)示范園”相繼出現，其中種植面積過萬畝的鹽城市阜寧縣郭墅鎮(zhèn)、宿遷市宿豫區(qū)大興鎮(zhèn)、宿遷市沐陽縣沂濤鎮(zhèn)和淮安市淮陰區(qū)西宋集鎮(zhèn)等更是將栝樓作為地方重點扶持的產業(yè)（產業(yè)調研數據）。但隨著栝樓種植年限的延長，栝樓病害也越來越嚴重，其中栝樓炭疽病、根結線蟲病、蔓枯病等已成為制約江蘇省栝樓產業(yè)發(fā)展的重要因子[6-8]。盡管有研究者提出多種針對栝樓重要病害的防控措施[9]，但實際效果不佳，如2018年鹽城市阜寧縣郭墅鎮(zhèn)出現千畝栝樓果實未熟便腐爛的現象，導致嚴重的減量和經濟損失，當地技術部門以防控炭疽病的方法進行病害治理，防效很差，且該病在田間與炭疽病癥狀存在一定差異。本研究通過單孢分離獲得病原物，經形態(tài)與分子生物學鑒定明確引起該病的病原物，并通過室內毒力測定篩選有效藥劑，旨在為該病的田間防控提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 供試材料

栝樓病樣：2018年11月采自江蘇省鹽城市阜寧縣郭墅鎮(zhèn)栝樓病田。

供試化學藥劑：98%吡唑醚菌酯（江蘇劍牌農化股份有限公司）、95%丙硫菌唑（山東海利爾化工有限公司）、98%咪鮮胺（江蘇輝豐生物農業(yè)股份有限公司）、98%戊唑醇（江蘇龍燈化學有限公司）、98%嘧菌酯（青島潤農化工有限公司）、98%多菌靈（江蘇瑞邦農化股份有限公司）、96%噻呋酰胺（浙江天豐生物科學有限公司）、12%中生菌素（福建凱立生物制品有限公司）。

1.2 病菌的單孢分離

于田間采集的栝樓病樣的病健交界處取1～2 mm 組織塊，2%次氯酸鈉表面消毒后，置于含有0.3%乳酸的PDA培養(yǎng)基（馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，葡萄糖17 g，瓊脂粉17 g，水 1 000 mL）平板表面，待組織塊周圍有菌絲長出時，在無菌操作臺中將菌絲移至新的PDA平板。10 d后，用挑針挑取少許菌絲置于200 μL無菌水中，輕微振蕩至孢子均勻分散后，用移液器吸取100 μL孢子液均勻展布于水瓊脂（瓊脂粉20 g，水1 000 mL）平板。用滅菌解剖刀將涂有孢子液的水瓊脂平板細劃成1～2 mm小塊，顯微鏡下挑取有單個孢子的水瓊脂小塊置于PDA斜面，待菌絲長出后即得單孢菌株。

1.3 病原菌的形態(tài)與生物學鑒定

采用常規(guī)方法進行病原菌形態(tài)與生物學鑒定。從果實病部取2 mm見方組織塊，手工切片后制作水浸片，顯微鏡下觀察分生孢子形態(tài)。從活化的菌落邊緣用打孔器取直徑6 mm的菌絲塊置于PDA平板中央，4 d后測量菌落直徑。待菌絲快長滿平板時，觀察菌落形態(tài)、有無色素，顯微鏡下觀察菌絲和分生孢子形態(tài)，測量孢子大小等。

1.4 ITS區(qū)擴增與序列測定

將置于馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)液（PDB），溫度 25 ℃，轉速120 r/min振蕩培養(yǎng)72 h的菌絲球過濾，用無菌水沖洗后，抽濾去水分，加入液氮研磨成粉末。十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）法提取病菌基因組DNA[9]。ITS區(qū)擴增使用通用引物ITS1（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′）和ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTCATATGC-3′）。20 μL反應體系（10×Buffer 2 μL、2.5 mmol/L dNTP 1 μL、10 μmol/L ITS1 1 μL、10 μmol/L ITS4 1 μL、5 U/μL Taq酶 0.5 μL、30 ng/μL Template DNA 1 μL、ddH2O 13.5 μL）。反應條件：94 ℃ 5 min;94 ℃ 30 s、55 ℃ 30 s、72 ℃ 1.0 min，35個循環(huán);72 ℃ 10 min。PCR產物于1.5%瓊脂糖凝膠電泳后，用北京索萊寶科技有限公司生產的DNA回收試劑盒D1200進行片段回收，具體方法參照說明書進行?；厥掌芜B接至pMD19-T克隆載體，轉化大腸桿菌DH5α，具體方法參見文獻[10]。陽性轉化子送生工生物工程（上海）股份有限公司測序。

1.5 系統(tǒng)進化樹構建

從NCBI中搜索不同真菌來源的ITS區(qū)序列，利用MEGA 5.1軟件構建系統(tǒng)發(fā)育進化樹。

1.6 生產常用藥劑對病原菌的毒力測定

按照預試驗結果，分別將供試藥劑吡唑醚菌酯（0.001、0.002、0.004、0.008、0.016 mg/L）、丙硫菌唑（0.50、0.75、1.00、1.25、1.50 mg/L）、咪鮮胺（0.001、0.002、0.004、0.006、0.008 mg/L）、戊唑醇（0.05、0.10、0.15、0.20、0.30 mg/L）、嘧菌酯（0.5、1.0、2.0、4.0、8.0 mg/L）、多菌靈（0.01、0.02、0.04、0.08、0.16 mg/L）、噻呋酰胺（10、25、50、100、200 mg/L）、中生菌素（5.0、10.0、15.0、20.0、25.0）、多抗霉素（10、25、50、100、200 mg/L）和春雷霉素（10、25、50、100、200 mg/L）配成梯度濃度含藥培養(yǎng)基，以不含藥的空白PDA培養(yǎng)基為對照。從活化的菌落邊緣打孔取直徑6 mm菌絲塊置于平板中央，待對照菌落快長滿平板時，測量各處理菌落直徑，計算半最大效應濃度（EC50）。每處理重復3次，試驗重復2次。

2 結果與分析

2.1 病菌形態(tài)學鑒定

從田間采集后期病果，于體視顯微鏡下觀察，可見果皮表面存在大量黑色連片黑點（分生孢子器），這些黑點部分埋生于寄主表皮下，部分突破表皮外露。病菌形態(tài)學鑒定表明，菌落為白色至灰白色，絨毛狀，菌落中央霉層密實、邊緣稀疏，PDA培養(yǎng)基上生長4 d后菌落直徑可達8.0 cm左右（圖1-A）;菌絲為有隔菌絲（圖1-B）;組織切片與培養(yǎng)基中均能產生2種類型的分生孢子，甲型（ɑ）分生孢子為無色、單孢、橢圓形至紡錘形，少數一端尖細微彎曲，孢子中含有2個油球，大小為（4.8～7.9 ） μm×（1.5～2.6 ） μm（圖1-C）;乙型（β）分生孢子無色、單孢、細長線形、少數頂端成鉤狀（圖1-D）。

2.2 病菌分子生物學鑒定

瓊脂糖凝膠電泳顯示，使用ITS1/ITS4引物對可從分離的病菌gDNA中擴增出單一條帶，大小約600 bp，測序結果表明該片段長574 bp（圖2）。經與NCBI中其他真菌ITS區(qū)序列進行Blast比對，發(fā)現其與擬莖點霉屬ITS區(qū)序列相似度高達95%以上，覆蓋率為86%～100%（圖3）。進一步搜索GenBank中所有擬莖點霉屬ITS區(qū)序列，以MEGA 5.1軟件制作系統(tǒng)進化樹，發(fā)現其與所有擬莖點霉屬真菌種均不能歸在一起， 雖然與Phomopsis vexans相近，但并不完全在一個分支上，因此要使用更多的基因序列才能確定（圖4）。結合形態(tài)與分子生物學鑒定結果，筆者認為栝樓爛果病病原菌為擬莖點霉屬，但具體是何種還需進一步鑒定。

2.3 生產常用藥劑對栝樓腐爛病菌的毒力

毒力測定結果表明，供試的生產上常用殺菌劑對栝樓爛果病病菌大多具有較強的毒力，EC50為0.005 5～19.947 3 mg/L（表1）;但噻呋酰胺、多抗霉素和春雷霉素對栝樓爛果病病菌無明顯抑制效果，在 5～100 mg/L濃度含藥平板上，菌落直徑差異不大，即使平板含藥濃度達200 mg/L，其對菌落生長的抑制率仍只有20%～30%（圖5）。

3 討論

栝樓是重要的藥用植物，栝樓籽也是營養(yǎng)價值極高的休閑食品，兩者市場需求量極大。近年來，全國多地將栝樓種植作為脫貧幫困項目， 僅江蘇省栝樓種植面積就超10萬畝，但栝樓種植過程中病害的危害也日趨嚴重。有研究者鑒定了栝樓根結線蟲的種類[6]，也對栝樓炭疽病病菌的生理生態(tài)及病害防治做了相關研究[11-12]，但總體來說目前對栝樓病害的研究還處于初步階段，報道的栝樓常見病害也只有枯萎病、蔓枯病、炭疽病、根結線蟲病和病毒病[13-16]。2016年，Zhang等首先報道了由鏈格孢引起的栝樓葉枯病，并對其病菌致病性做了測定[17]。而關于栝樓爛果病目前國內外還未見報道，鑒定其病原，并篩選對其有較高毒力的化學藥劑，將為生產上進行該病的防控提供重要的理論依據。

參考文獻：

[1]王姍姍. 瓜蔞皮的藥理作用及其臨床應用[J]. 山西醫(yī)學雜志，2009，38（1）：67-68.

[2]馬 婧，霍曉乾，陳 茜，等. 基于Mpro和PLP篩選潛在抗新型冠狀病毒中藥研究[J]. 中國中藥雜志，2020（6）：1219-1224.

[3]潘其勝. 三拗瓜蔞薤白半夏湯聯合西藥對慢性陰塞性肺疾病急性加重期患者的療效[J]. 河南醫(yī)學研究，2019，28（24）：4522-4524.

[4]孫丹妮，汪倩倩，王 超，等. 基于均勻設計法評價瓜蔞與制川烏反藥配伍組合的祛痰鎮(zhèn)咳作用[J]. 中國實驗方劑學雜志，2015，21（22）：55-59.

[5]黃楚燕，梁宏宇. 自擬加味瓜蔞薤白半夏湯對痰熱蘊肺型慢性阻塞性肺疾病急性加重期患者炎癥因子及凝血功能的影響[J]. 廣州中醫(yī)藥大學學報，2019，36（2）：181-185.

[6]趙 雷，張紅艷，萬景旺，等. 江蘇省瓜蔞根結線蟲種類鑒定[J]. 西南農業(yè)學報，2012，25（2）：517-520.

[7]孫天曙，陳永明，王乃寧，等. 江蘇鹽城瓜蔞主要病蟲害發(fā)生規(guī)律及綜合防治技術初探[J]. 特種經濟動植物，2018，21（12）：47-51.

[8]毛艷芝，高 源，姚 亮. 阜寧縣瓜蔞病蟲害發(fā)生情況調查與防治技術[J]. 農業(yè)開發(fā)與裝備，2019（2）：159.

[9]曹小迎，蔣繼宏，孫 勇，等. 刺革菌科4種藥用真菌的ITS區(qū)序列分析[J]. 中草藥，2007，38（2）：261-264.

[10]陳麗梅. 分子生物學實驗-實用操作技術與應用案例[M]. 北京：科學出版社，2017.

[11]徐敬峰，檀根甲，韓 翔. 瓜蔞炭疽病發(fā)生危害及綜合防控技術研究[J]. 安微農業(yè)科學，2006，34（15）：3741，3784.

[12]韓 翔，檀根甲，徐頸峰，等. 瓜蔞炭疽病菌越冬能力的初步研究[J]. 安徽農業(yè)科學，2003，31（2）：268-269.

[13]孫玉平，吳彩玲，徐頸峰. 瓜蔞主要病、蟲、草害及無公害生產技術[J]. 安徽農學通報，2003，9（4）：81-82.

[14]陳香艷. 臨沂市瓜蔞枯萎病的發(fā)生與防治[J]. 農業(yè)科技通訊，2018（6）：333-335.

[15]楊志龍. 瓜蔞不同種植栽培技術及病蟲害防治探析[J]. 農業(yè)開發(fā)與裝備，2019（5）：176-177.

[16]Zhang L X，Song J H，Tan G J，et al. Characterization of Colletotrichum gloeosporioides responsible for anthracnose disease of Trichosanthes kirilowii Maxim in central China[J]. Phytoparasitica，2014，42（4）：549-558.

[17]Zhang L X，Shi Y R，Yu J H，et al. First report of leaf blight caused by Alternaria alternate on Trichosanthes kirilowii Maxim in China[J]. Plant Disease，2016，100（5）：1021.趙佳佳，祁睿尹，葉爾江·拜克吐爾漢，等. 烏爾禾區(qū)不同生境胡楊年輪寬度變化特征[J]. 江蘇農業(yè)科學，2020，48（24）：117-123.