李維偉　黎傲日　郭怡菲　李觀林　肖文靜　曾艷玲

摘要：【目的】探討鈦離子注入對(duì)油茶生長(zhǎng)過(guò)程中葉綠體及光合作用的影響，利用離子注入技術(shù)進(jìn)行油茶種質(zhì)創(chuàng)制及選育提供科學(xué)依據(jù)?！痉椒ā恳杂筒杵贩N華碩為試材，設(shè)置6×1016、9×1016、12×1016、15×1016和18×1016 Ti2+/cm2 5種劑量的鈦離子，分別注入油茶種子，以未進(jìn)行注入處理的種子作為對(duì)照，在相同條件下播種培育。采摘幼葉進(jìn)行DNA提取，對(duì)葉綠體基因組的部分基因片段的序列進(jìn)行擴(kuò)增、純化，并定期測(cè)量其葉綠素含量和光合參數(shù)，連續(xù)3年（2016—2018年）追蹤研究其葉綠體DNA的變異、葉綠素相對(duì)含量及凈光合速率（Pn）、氣孔導(dǎo)度（Gs）、胞間CO2濃度（Ci）和蒸騰速率（Tr）的變化規(guī)律?！窘Y(jié)果】鈦離子注入處理會(huì)引起葉綠體DNA少數(shù)堿基置換，雖然注入劑量越大置換相對(duì)增多，但不存在明顯的缺失或插入現(xiàn)象;葉綠素相對(duì)含量和光合參數(shù)均呈現(xiàn)馬鞍形變化;鈦離子注入濃度為6×1016和12×1016 Ti2+/cm2時(shí)，葉綠素含量相對(duì)較高，但隨著生長(zhǎng)年份增加，優(yōu)勢(shì)逐漸減小;處理后當(dāng)年各試驗(yàn)組Pn差異不顯著（P>0.05，下同），但第2和第3年，6×1016 Ti2+/cm2注入組Pn顯著高于對(duì)照組（P<0.05，下同），分別增加13.94%和12.56%;第1、2年中Gs和Tr各組差異不明顯，而第3年差異開(kāi)始增大，在注入濃度為0及6×1016 Ti2+/cm2時(shí)Gs分別為最低組的235.78%和249.55%，而在注入濃度為6×1016 Ti2+/cm2 Tr是最低組的239.24%;在第1年中，對(duì)照組Ci為508.4074 ?L/L，是最低組的213.72%，第2年中對(duì)照組與其他各組均存在顯著差異，達(dá)該年度最高值，為288.2563 ?L/L，較其他處理組增加6.66%～17.98%，但第3年對(duì)照與其他組差異減小?！窘Y(jié)論】鈦離子注入濃度的差異對(duì)葉綠素的影響暫時(shí)不穩(wěn)定，但當(dāng)鈦離子注入濃度為6×1016 Ti2+/cm2時(shí)，對(duì)油茶的綜合作用效果最佳，能促進(jìn)油茶凈光合速率的提升以及蒸騰作用的加強(qiáng)。

關(guān)鍵詞： 油茶;鈦離子注入;葉綠體DNA;葉綠素相對(duì)含量;光合參數(shù)

中圖分類號(hào)： S794.4 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)：2095-1191（2020）11-2738-09

Effects of titanium ion implantation on chloroplast DNA， chlorophyll content and photosynthetic parameters

of Camellia oleifera

LI Wei-wei， LI Ao-ri， GUO Yi-fei， LI Guan-lin， XIAO Wen-jing， ZENG Yan-ling*

（The Key Lab of Cultivation and Protection for Non-wood Forest Trees of Ministry of Education/ The Key Lab of Non-wood Forest Products of Forestry State Forestry Administration/Technology Laboratory of China National Center for

Oil-tea Science，Central South University of Forestry and Technology， Changsha ?410004， China）

Abstract：【Objective】To investigate the effects of titanium ion implantation on chloroplast and photosynthesis during the growth of Camellia oleifera， ?ion implantation technique was used to enrich the way of C. oleifera germplasm creation and breeding. 【Method】C. oleifera Huashuo was used as the test material. Set 6×1016， 9×1016， 12×1016， 15×1016 and 18×1016 Ti2+/cm2 as five doses of titanium ions， injecting into C. oleifera seeds， and use seeds that have not been implanted as control. The seeds were cultivated under the same conditions. Picked young leaves for DNA extraction， amplified and purified the sequence of some gene fragments of the chloroplast genome， and regularly measured its chlorophyll content and photosynthetic parametersto track and study the variation of chloroplast DNA， the changes of srelative content of chlorophyll and net photosynthetic rate， stomatal conductance， intercellular CO2 concentration and transpiration rate during 2016-2018. 【Result】The results showed that the titanium ion implantation treatment would cause the substitution of mino-rity bases in chloroplast DNA. Although the larger the injection dose， the replacement was relatively increased， but there was no large deletion or insertion. The relative content of chlorophyll and photosynthetic characteristics both showed a sa-ddle-type change. When the concentrations of titanium ion implantation were 6×1016 and 12×1016 Ti2+/cm2， the chlorophyll content was relatively high， but as the growth year increased， the advantage gradually decreased. After treatment， the net photosynthetic rate of each test group was not significantly different（P>0.05， the same below）， but in the second and third years， the net photosynthetic rate of the 6×1016 Ti2+/cm2 injection group was significantly higher than that of the control group（P<0.05， the same below）， increasing by 13.94% and 12.56% respectively. The differences in stomatal conductance and transpiration rate in the first and second years were not great among the groups， while in the third year the differences began to be great. At the injection concentration of 0 and 6×1016 Ti2+/cm2， the stomatal conductance was 235.78% and 249.55% of the lowest group， and the transpiration rate at the injection concentration of 6×1016 Ti2+/cm2 was 239.24% of the lowest group. In the first year， the intercellular CO2 concentration in the control group was 508.4074 ?L/L， which was 213.72% in the lowest group. In the second year， the control group was significantly different from the other groups， reaching the highest in the year（288.2563 ?L/L）， an increase of 6.66%-17.98% compared with other experimental groups， but the difference was smaller between control and other treatments in the third year. 【Conclusion】The effects of ?titanium ion implantation concentration are unstable on chlorophyll. The comprehensive performance of C. oleifera is best when the implantation dose is 6×1016 Ti2+/cm2. Net photosynthetic rate and and transpiration of C. oleifera can be enhanced.

Key words： Camellia oleifera; titanium ion implantation; chloroplast DNA; relative chlorophyll content; photosynthetic parameters

Foundation item： Hunan Natural Science Foundation（2019JJ50986）; Key Scientific Research Project of Department of Education of Hunan（18A152）

0 引言

【研究意義】油茶（Camellia oleifera）泛指山茶科山茶屬中具有生產(chǎn)價(jià)值的油用樹(shù)種，是我國(guó)南方地區(qū)重要的木本食用油料樹(shù)種，也是世界四大木本油料作物之一（袁軍等，2017;邵蕊等，2018）。油茶具有很高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，其產(chǎn)品在林業(yè)、農(nóng)漁、食療、醫(yī)藥、日化和輕紡等方面有非常廣闊的應(yīng)用，集經(jīng)濟(jì)、生態(tài)和社會(huì)效益于一體，極具栽培價(jià)值（王保明等，2019;王文斌和李雪，2019）。盡管我國(guó)科技人員對(duì)油茶進(jìn)行了長(zhǎng)期、細(xì)致的研究，發(fā)現(xiàn)從改善林分的撫育程度、種植密度及水肥管理等方面提高油茶產(chǎn)量（游璐等，2015;羅小彥，2019），但提高程度有限，且受制于原種質(zhì)質(zhì)量。目前我國(guó)油茶育種技術(shù)主要有常規(guī)育種、抗性育種、輻射誘變育種及生物技術(shù)育種等（黃欣等，2010）。油茶的常規(guī)育種周期較長(zhǎng)，且受到遠(yuǎn)緣雜交不親和性等條件的限制;抗性育種僅在抗油茶炭疽病及抗寒性等方面研究較多;生物技術(shù)育種起步較晚;而輻射誘變育種在近20～30年作為新興技術(shù)正被廣泛應(yīng)用（徐斌等，2017）。正如離子束注入技術(shù)已不再將研究對(duì)象僅限于物理學(xué)和材料科學(xué)，其在對(duì)生命科學(xué)領(lǐng)域也創(chuàng)造了可能，且發(fā)展迅速，取得了許多顯著成就（Feng et al.，2006;黃國(guó)偉等，2009）。同時(shí)，離子注入誘變育種作為一種育種技術(shù)，開(kāi)拓了林木選育工作的研究領(lǐng)域。因此，嘗試分析離子注入后對(duì)油茶葉綠體DNA變異及其光合參數(shù)的影響，對(duì)油茶選育及提高油茶種質(zhì)資源具有重要意義。【前人研究進(jìn)展】大量研究發(fā)現(xiàn)離子注入種子和芽等材料后，不僅能提高植物的產(chǎn)量、品質(zhì)，且具有突變率高和廣突變譜的特點(diǎn)，是比太空輻射和放射性同位素輻射更安全經(jīng)濟(jì)的誘變新途徑（郝杰等，2014）。目前，離子注入技術(shù)不僅在菌類的選育及培養(yǎng)方面發(fā)揮了重要作用（陳方新等，2018;陳浩等，2018），還拓寬至小麥和水稻等植物的種質(zhì)資源（袁兵，2014;郭明明等，2019）。曾艷玲等（2011）發(fā)現(xiàn)鈦離子注入油茶種子的劑量在6×1016～12×1016 Ti2+/cm2時(shí)，種子的過(guò)氧化物酶（POD）和超氧化物歧化酶（SOD）活性達(dá)到峰值，同時(shí)電解質(zhì)外滲率最低。Ya等（2012）也發(fā)現(xiàn)通過(guò)低能氮離子注入能誘導(dǎo)水稻種子增強(qiáng)其幼苗的活力指數(shù)，促進(jìn)脫落酸的生物合成和染色質(zhì)修飾的變化，從而促進(jìn)水稻幼苗生長(zhǎng)。Han等（2013）研究表明，低能碳離子注入的低流量可提高花生的日平均光合速率。郝杰等（2015）發(fā)現(xiàn)鈦離子注入對(duì)植物葉綠素總量、葉綠素a及葉綠素b的產(chǎn)生具有一定促進(jìn)作用，可提高光合作用的能力。張斌（2018）研究表明鈦離子注入效果較氮離子注入好，不僅能使杉木幼苗在耐陰性和適應(yīng)面具有較佳的表現(xiàn)，同時(shí)還能明顯提高光能利用效率?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】前人針對(duì)離子注入技術(shù)的研究?jī)H涉及酶含量等的變化，尚未涉及葉綠體DNA及光合參數(shù)的改變?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】在前期研究基礎(chǔ)上，探究鈦離子注入對(duì)油茶葉綠體DNA、葉綠素相對(duì)含量及光合參數(shù)的影響，進(jìn)一步論證促進(jìn)油茶生長(zhǎng)的最佳鈦離子注入濃度，以期為今后采用離子注入技術(shù)進(jìn)行油茶良種創(chuàng)制及選育提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 試驗(yàn)材料

試材為國(guó)家審定油茶品種華碩，由中南林業(yè)科技大學(xué)經(jīng)濟(jì)林培育與保護(hù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室選育。樣品采集自湖南省長(zhǎng)沙市望城縣東城鎮(zhèn)油茶基地，為5年生油茶種。

1. 2 試驗(yàn)方法

1. 2. 1 試驗(yàn)方案 于2015年10月底采摘華碩油茶成熟果實(shí)，去果皮后，根據(jù)本課題組前期研究設(shè)計(jì)試驗(yàn)處理梯度（曾艷玲等，2011），即應(yīng)用LCD21000型離子注入機(jī)，對(duì)種子分別進(jìn)行6×1016、9×1016、12×1016、15×1016和18×1016 Ti2+/cm2等5個(gè)劑量的鈦離子注入處理，依次記為Ti2、Ti3、Ti4、Ti5和Ti6處理，并以未進(jìn)行注入處理的種子為對(duì)照，記為Ti1，每個(gè)濃度3組重復(fù)，為Ti1-1、Ti1-2和Ti1-3，以此類推至Ti6-3，即共有18個(gè)樣本。經(jīng)沙藏至2016年3月底進(jìn)行播種。

1. 2. 2 DNA提取 于2017年4月采摘并稱取 0.1 g左右新抽嫩葉，根據(jù)植物基因組DNA快速抽提試劑盒[生工生物工程（上海）股份有限公司]說(shuō)明提取基因組DNA。

1. 2. 3 葉綠體基因組部分基因間隔區(qū)擴(kuò)增及測(cè)序 采用葉綠體DNA條形碼通用引物，rpl2：5'-GATAATTTGATTCTTCGTCGCC-3';trnH：5'-CGG ATGTAGCCAAGTGGATC-3'擴(kuò)增rpl2和trnH間的基因間隔區(qū)。PCR反應(yīng)體系（50.00 ?L）：上、下游引物（10 ?mol/L）各2.0 ?L，10×Buffer（TaKaRa）5.00 ?L，dNTPs（2.5 mmol/L）4.00 ?L，MgCl2（25 mmol/L）3.00 ?L，Taq DNA聚合酶（5 U/?L）0.25 ?L，基因組DNA（100 ng/?L）1.00 ?L，取無(wú)菌純水補(bǔ)足50.00 ?L。擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃ 1 min，55 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，進(jìn)行35個(gè)循環(huán);72 ℃延伸8 min。擴(kuò)增產(chǎn)物委托上海博亞生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1. 2. 4 光合特性參數(shù)測(cè)定 采用Li-6400便攜式光合測(cè)定系統(tǒng)，選取枝條生長(zhǎng)良好的中上部葉片進(jìn)行光合指標(biāo)測(cè)定，光源為太陽(yáng)光，溫度、相對(duì)濕度和CO2濃度均為自然狀態(tài)下。測(cè)定時(shí)間為2016、2017和2018年的10月初天氣晴朗的上午9：00—10：00，每年1次，1 d內(nèi)將數(shù)據(jù)收集完善。當(dāng)系統(tǒng)穩(wěn)定后進(jìn)行記錄，每片葉片記錄3次數(shù)據(jù)，即重復(fù)測(cè)定3次，并計(jì)算平均值。直接記錄的數(shù)據(jù)有凈光合速率（Pn）、氣孔導(dǎo)度（Gs）、蒸騰速率（Tr）和胞間CO2濃度（Ci）等指標(biāo)。

1. 2. 5 葉綠素相對(duì)含量測(cè)定 采用SPAD-502Plus測(cè)量葉片在2個(gè)波長(zhǎng)段里的吸收率，評(píng)估葉片葉綠素的相對(duì)含量。

1. 3 統(tǒng)計(jì)分析

DNA序列采用生物信息學(xué)軟件GenDoc進(jìn)行對(duì)比分析。光合參數(shù)及葉綠素相對(duì)含量均采用Excel 2010和SPSS 17.0進(jìn)行試驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，并以Duncans新復(fù)極差法進(jìn)行顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2. 1 鈦離子注入對(duì)葉綠體DNA的影響

利用通用引物對(duì)rpl2和trnH間的基因間隔區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增，得到單一條帶，片段大小約200 bp（圖1）。測(cè)序分析結(jié)果表明，不同濃度鈦離子注入后油茶實(shí)生苗葉片葉綠體DNA的rpl2-trnH區(qū)域的長(zhǎng)度范圍為213～217 bp（圖2，表1），G+C堿基的含量在40.5%～41.4%，符合葉綠體DNA序列G+C堿基含量較低的特點(diǎn)。共檢測(cè)出11個(gè)變異性狀，均為堿基置換，其中1個(gè)為顛換，10個(gè)為轉(zhuǎn)換。在第4組即鈦離子濃度為12×1016 Ti2+/cm2的第2個(gè)重復(fù)組（Ti4-2）中有2個(gè)堿基發(fā)生置換，且均發(fā)生在引物rpl2區(qū)域，即第4個(gè)堿基由A顛換成T，第16個(gè)堿基由C轉(zhuǎn)換成T;樣本Ti3-2堿基置換最多，分別位于47、58～61及109 bp，其中4處為C轉(zhuǎn)換成T，2處為T轉(zhuǎn)換成C;發(fā)生堿基置換最多的位點(diǎn)在58 bp處，其中該位點(diǎn)有6組為T、12組為C。雖然隨著鈦離子注入劑量的增加，堿基置換現(xiàn)象有所增加，但不存在缺失或插入的現(xiàn)象。

2. 2 鈦離子注入對(duì)油茶葉片葉綠素含量的影響

對(duì)3年所測(cè)得葉綠素相對(duì)含量進(jìn)行方差分析可知，年份與鈦離子注入量的交互效應(yīng)對(duì)葉綠素相對(duì)含量的顯著值（P）為0.02，說(shuō)明兩者存在交互效應(yīng)且對(duì)葉綠素相對(duì)含量具有顯著影響（P<0.05，下同）;同時(shí)發(fā)現(xiàn)，2016與2017年間無(wú)顯著差異（P>0.05，下同），但2018與2016和2017年均存在顯著差異。

由圖3可知，在2016年，Ti2與Ti4處理的葉綠素SPAD較高，分別為57.10和51.80，較Ti1處理增加22.80%和11.40%，且二者差異不顯著，說(shuō)明Ti2和Ti4處理均能促進(jìn)葉綠素的產(chǎn)生。在2017年，各處理間差異不顯著，葉綠素SPAD值順序依次為Ti2>Ti6>Ti5>Ti1>Ti4>Ti3，其中，Ti2處理的SPAD值達(dá)48.40，為Ti1處理的105.91%。在2018年，Ti1和Ti4處理與Ti3和Ti6處理存在顯著差異，且前兩組葉綠素含量較高，SPAD值分別為72.80和74.27?？梢?jiàn)，鈦離子的注入對(duì)于提高葉綠素含量并不具有穩(wěn)定性，可能還受其他因素的影響。

2. 3 鈦離子注入對(duì)油茶葉片光合參數(shù)的影響

2. 3. 1 鈦離子注入對(duì)油茶葉片Pn的影響 方差分析結(jié)果（表2）顯示，從2016—2018年，處理結(jié)果差異顯著值在逐漸增加，其中，2016年P(guān)=0.295>0.05，說(shuō)明各處理組間Pn差異不顯著，鈦離子注入處理對(duì)油茶實(shí)生苗萌芽階段光合影響不明顯;2017年P(guān)=0.040，各處理間差異顯著，2018年P(guān)<0.001，各處理間差異極顯著，表明鈦離子注入處理對(duì)油茶實(shí)生苗后期生長(zhǎng)過(guò)程中Pn有明顯影響，且存在逐漸放大的趨勢(shì)。由圖4-A可知，在2016年，各處理間差異不顯著，Ti4處理的葉片Pn為9.8952 ?mol/（m2·s），為Ti1處理的109.73%;在2017和2018年，Ti2處理與其他處理均存在顯著差異，且Pn達(dá)較高水平，分別為3.5842和11.189 ?mol/（m2·s），較Ti1處理分別增加13.94%和12.56%。說(shuō)明適當(dāng)濃度的鈦離子注入對(duì)植物Pn提高有促進(jìn)作用。綜合3年的情況分析可知，一方面，在幼苗期鈦離子注入對(duì)葉片Pn影響不顯著，隨著植物的生長(zhǎng)發(fā)育，鈦離子注入的影響逐漸放大;另一方面，Ti2處理的鈦離子注入對(duì)葉片Pn提高有促進(jìn)作用。

2. 3. 2 鈦離子注入對(duì)油茶葉片Gs的影響 方差分析結(jié)果（表2）顯示，從2016—2018年，各年份顯著值P分別為0.390、0.039和0.000，因此可得出不同年份各處理組的顯著性在逐漸增大，說(shuō)明鈦離子注入處理對(duì)油茶葉片Gs的影響與其對(duì)葉片Pn的影響相似，均隨著油茶的生長(zhǎng)發(fā)育而逐漸增強(qiáng)。由圖4-B可知，在2016年，各組Gs差異不顯著，Ti2處理葉片Gs達(dá)0.1734 mol/（m2·s），為Ti1處理的127.69%。在2017年，除Ti6處理的Gs極低以外，其他各組差異均不顯著，Ti1處理的葉片Gs為0.0499 mol/（m2·s），為Ti6處理的236.49%;在2018年，Ti1與Ti2處理差異不顯著，分別為0.1575和0.1667 mol/（m2·s），為Ti6處理的235.78%和249.55%。綜合3年情況來(lái)看，適當(dāng)?shù)拟侂x子注入有提高Gs的作用，但濃度高于15×1016 Ti2+/cm2后會(huì)大幅度抑制氣孔張開(kāi)。

2. 3. 3 鈦離子注入對(duì)油茶葉片Tr的影響 方差分析結(jié)果（表2）顯示，從2016—2018年，處理結(jié)果顯著性在逐漸減小，P分別為0.403、0.054和0.001，說(shuō)明鈦離子注入處理對(duì)Tr的影響隨油茶幼苗的生長(zhǎng)逐年增大。由圖4-C可知，在2016年，各處理間差異不顯著，Ti6處理達(dá)2.9044 mmol/（m2·s），為Ti1處理的185.74%;在2017年，除Ti6處理Tr顯著低于Ti2、Ti3和Ti4處理外，其他各處理間差異不顯著，Ti4處理達(dá)1.0526 mmol/（m2·s），為Ti1處理的131.39%;在2018年，Ti1和Ti2與Ti3處理間無(wú)顯著差異，但3個(gè)處理與Ti6處理均存在顯著差異，各處理Tr排序?yàn)門i2>Ti3>Ti1>Ti5>Ti4>Ti6，其中Ti2處理為2.9489 mmol/（m2·s），是Ti6處理的239.24%?？梢?jiàn)，一方面，鈦離子注入對(duì)Tr的影響在油茶生長(zhǎng)后期才開(kāi)始體現(xiàn);另一方面，適當(dāng)濃度鈦離子注入可促進(jìn)蒸騰作用，而過(guò)高濃度的鈦離子注入會(huì)抑制蒸騰作用。

2. 3. 4 鈦離子注入對(duì)油茶葉片Ci的影響 方差分析結(jié)果（表2）顯示，3年組間差異顯著值P先減后增，2018年P(guān)值為0.058，說(shuō)明此時(shí)各處理組間Ci差異不顯著。由圖4-D可知，在2016年，前3個(gè)處理與后3個(gè)處理均存在顯著差異，且在Ti3至Ti4時(shí)出現(xiàn)陡降現(xiàn)象，Ti1處理的Ci為508.4074 ?L/L，是Ti6處理的213.72%;在2017年，Ti1處理與其他處理均存在顯著差異，達(dá)該年度最高值，為288.2563 ?L/L，較其他處理增加6.66%～17.98%，其他各處理Ci排序?yàn)門i2>Ti4>Ti3>Ti5>Ti6;在2018年，各處理的Ci排序?yàn)門i1>Ti2>Ti5>Ti3>Ti4>Ti6。以上分析說(shuō)明對(duì)照的葉片細(xì)胞對(duì)CO2的利用效率沒(méi)有試驗(yàn)組的高，適當(dāng)濃度的鈦離子注入有利于細(xì)胞對(duì)Ci的利用。此外，顯著性在逐漸減小說(shuō)明植物可能產(chǎn)生某種機(jī)制的應(yīng)對(duì)這種變化，具有自我修復(fù)的能力。

由表3可知，油茶幼苗Pn、Gs、Tr在相鄰年間差異顯著，即2016與2017年、2017與2018年差異顯著，但2016與2018年差異不顯著，可能是因?yàn)?017年的氣候、水肥條件與其他2年相比存在差異而導(dǎo)致這3個(gè)光合指標(biāo)年際間差異顯著。而對(duì)于Ci，2016年與另外2個(gè)年份均存在顯著差異，可能是由于油茶幼苗生長(zhǎng)初期葉肉細(xì)胞葉肉導(dǎo)度不完善而引起。

3 討論

葉綠體DNA序列片段的非編碼區(qū)在植物種間存在較高變異性，常被作為顯花植物種間鑒定的DNA條形碼（王以紅等，2009）。鈦離子誘變效應(yīng)可能通過(guò)影響一些與葉綠體DNA復(fù)制、轉(zhuǎn)錄或修復(fù)相關(guān)的酶，從而激活或抑制這些酶活性來(lái)影響DNA的正常復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和修復(fù);鈦離子也可能直接作用于DNA上，通過(guò)影響其構(gòu)象或其與蛋白質(zhì)的相互作用而產(chǎn)生突變（張寧等，2006）。本研究中所采用的劑量梯度均未涉及到明顯的葉綠體DNA突變，僅出現(xiàn)少量堿基置換而不存在堿基缺失或插入現(xiàn)象，即各處理組葉綠體DNA序列變異性較小，一方面說(shuō)明所取試材品系純正，另一方面說(shuō)明鈦離子注入對(duì)油茶葉綠體DNA影響不明顯。此外，根據(jù)Yu（2000）的研究，注入的離子在葉綠體雙鏈DNA鏈中打散組成分子的原子，并迫使其從原始位置進(jìn)行移動(dòng);轉(zhuǎn)移的原子可能會(huì)與DNA分子中的其他元素相互作用并形成其他新分子，或完全移位并在其原始位置留出空白空間。前者會(huì)導(dǎo)致遺傳效應(yīng)，如堿基取代;后者導(dǎo)致單個(gè)堿基或小DNA片段的缺失和插入，甚至染色體斷裂和易位。在本研究中并未出現(xiàn)后一種情況，可能是由于不同離子的注入在植物體內(nèi)導(dǎo)致的化學(xué)性質(zhì)及生物活性不同，因而引起不同的生物效應(yīng)，而鈦元素不屬于植物的微量元素，對(duì)植物產(chǎn)生的生物效應(yīng)會(huì)較弱（郝杰等，2014）;也可能由于油茶自身存在某種修復(fù)機(jī)制，能在一定程度上修復(fù)斷裂的部分。葉綠素是植物光合作用的物質(zhì)基礎(chǔ)，其濃度和組成直接影響葉片的光合速率（Fan et al.，2013）。適當(dāng)?shù)碾x子注入能促進(jìn)植物幼苗產(chǎn)生更多葉綠素，從而提高葉片吸收光能的作用（張斌等，2010）。本研究結(jié)果顯示，離子注入量為6×1016 Ti2+/cm2時(shí)，葉綠素含量相對(duì)較高，但鈦離子注入的影響隨著油茶幼苗的生長(zhǎng)存在“大小大”的現(xiàn)象，即在注入后第1年對(duì)葉綠素含量的影響較大，而第2年影響減小，第3年影響又繼續(xù)增大。上述現(xiàn)象說(shuō)明鈦離子注入作用尚未涉及葉綠體DNA構(gòu)象，未產(chǎn)生穩(wěn)定的DNA突變，因此導(dǎo)致適當(dāng)離子注入提高葉綠素含量的現(xiàn)象并不穩(wěn)定。

衡量光合作用的主要指標(biāo)是Pn，其為光合作用積累的總量除去呼吸作用消耗的量（孫少波等，2016），可直接體現(xiàn)光合系統(tǒng)的功能。外界與植物進(jìn)行氣體交換主要是通過(guò)植物葉片的氣孔進(jìn)行，衡量氣孔開(kāi)張程度的指標(biāo)是Gs，其不僅反映植物蒸騰耗水的程度，還是檢測(cè)植物抗旱性能的重要指標(biāo)（郭成龍，2019;朱紹丹等，2019）。本研究結(jié)果顯示，隨著鈦離子注入劑量的增加，油茶幼苗葉片Pn和Gs均呈現(xiàn)馬鞍型圖線的趨勢(shì)，即低劑量注入時(shí)Pn及Gs較小，中高劑量注入時(shí)反而有所增高，但高劑量注入時(shí)有所下降。究其原因可能是：在低劑量離子注入時(shí)生物特性改變主要是能量沉積效應(yīng)和動(dòng)量傳遞效應(yīng)綜合作用的結(jié)果，電荷作用效應(yīng)其次，能量沉積所產(chǎn)生的大量自由基會(huì)導(dǎo)致DNA和生物膜等其他生物大分子的損傷，而中高劑量注入時(shí)電荷積累發(fā)揮作用，大量電荷的堆積會(huì)產(chǎn)生很強(qiáng)的庫(kù)侖斥力，這種庫(kù)侖斥力能對(duì)被注入細(xì)胞形成一個(gè)保護(hù)屏障，阻礙后續(xù)注入離子對(duì)細(xì)胞的直接接觸所造成損傷，從而達(dá)到對(duì)細(xì)胞的保護(hù)作用（宋道軍等，1999;劉志高等，2013;龔洪恩等，2014）。但高劑量注入時(shí)，能量沉積和動(dòng)量傳遞所造成的負(fù)面影響已超出電荷積累發(fā)揮的積極作用，因此出現(xiàn)生活力下降的趨勢(shì)。

蒸騰作用是植物重要的生理活動(dòng)，影響著植物體內(nèi)水分的平衡、運(yùn)輸與吸收;從蒸騰耗水的規(guī)律可深入了解其水分代謝的特點(diǎn)和水分利用的效率（Wang et al.，2016;趙夏緯等，2019）。葉片Tr由于受到眾多因素如Gs、細(xì)胞活力、水分管理等的綜合影響，因此其數(shù)值的柱形圖隨鈦離子注入劑量變化無(wú)明顯的規(guī)律性。但進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，隨著植物的生長(zhǎng)發(fā)育，低濃度注入的處理有較高值，蒸騰速率較快，代謝較快。Ci是指植物進(jìn)行光合作用時(shí)細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的CO2濃度，可反映植物葉片光合作用對(duì)CO2的利用情況，直接影響到光合作用暗反應(yīng)階段的羧化速率，從而影響光合作用（楊澤粟等，2017;周罕覓等，2019）。Ci取決于4個(gè)可能變化的因素：葉片周圍空氣的CO2濃度、Gs、葉肉導(dǎo)度和葉肉細(xì)胞的光合活性（陳根云等，2010）。本研究結(jié)果顯示，油茶種子注入鈦離子后隨注入劑量增加，追蹤觀察的油茶幼苗生長(zhǎng)過(guò)程中Ci所呈現(xiàn)的趨勢(shì)均為先下降、后上升、再下降的形式，與Gs的趨勢(shì)均一致，因此這4個(gè)影響因素中，Gs起關(guān)鍵性作用。高劑量鈦離子注入出現(xiàn)Ci陡降的現(xiàn)象，說(shuō)明高劑量離子注入存在抑制葉片利用CO2的現(xiàn)象，且影響較明顯。

4 結(jié)論

鈦離子注入濃度差異對(duì)葉綠素的影響暫時(shí)不穩(wěn)定，但當(dāng)鈦離子注入濃度為6×1016 Ti2+/cm2時(shí)，對(duì)油茶的綜合作用效果最佳，能促進(jìn)油茶凈光合速率的提升及蒸騰作用的加強(qiáng)。

參考文獻(xiàn)：

陳方新，齊永霞，丁婷. 2018. 氮離子注入誘變選育大豆疫霉高效拮抗菌[J]. 核農(nóng)學(xué)報(bào)，32（10）： 1873-1879. [Chen F X，Qi Y X，Ding T. 2018. Mutagenesis breeding of high efficiency antagonistic bacteria of Phytophthora sojae by nitrogen ion-implantation[J]. Journal of Nuclear Agricultural Sciences，32（10）： 1873-1879.]

陳根云，陳娟，許大全. 2010. 關(guān)于凈光合速率和胞間CO2濃度關(guān)系的思考[J]. 植物生理學(xué)通訊，46（1）： 64-66. [Chen G Y，Chen J，Xu D Q. 2010. Thinking about the relationship between net photosynthetic rate and intercellular CO2 concentration[J]. Plant Physiology Journal，46（1）： 64-66.]

陳浩，石磊，解繼紅，宋智青. 2018. 低能離子注入對(duì)叢枝菌根真菌及其與蒺藜苜蓿共生的影響[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，46（26）： 1-2. [Chen H，Shi L，Xie J H，Song Z Q. 2018. Effects of ion beam implantation on Arbuscular mycorrhizal fungi and mycorrhizal Medicago truncatula[J]. Journal of Anhui Agricultural Sciences，46（26）： 1-2.]

龔洪恩，呂芳德，陳傳松，和紅曉. 2014. 離子注入對(duì)傘樹(shù)幼苗葉綠素含量的影響[J]. 經(jīng)濟(jì)林研究，32（1）： 140-143. [Gong H E，Lü F D，Chen C S，He H X. 2014. Effects of ion implantation on chlorophyll content in Acacia saligna seedlings[J]. Nonwood Forest Research，32（1）： 140-143.]

郭成龍. 2019. 臭氧環(huán)境對(duì)13種鄉(xiāng)土樹(shù)種光合作用的影響[J]. 林業(yè)調(diào)查規(guī)劃，44（3）： 152-157. [Guo C L. 2019. Influence of ozone environment on photosynthesis of 13 native tree species[J]. Forestry Inventory and Planning，44（3）： 152-157.]

郭明明，樊繼偉，陳鳳，李強(qiáng)，孫中偉，王康君，張廣旭，趙雪君，浦漢春，代丹丹. 2019. 不同劑量氮離子注入對(duì)小麥生長(zhǎng)發(fā)育及光合特性的影響[J]. 北方農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，47（1）： 18-23. [Guo M M，F(xiàn)an J W，Chen F，Li Q，Sun Z W，Wang K J，Zhang G X，Zhao X J，Pu H C，Dai D D. 2019. Effects of different N ion implantation doses on growth and development and characteristics of photosynthesis of wheat[J]. Journal of Northern Agriculture，47（1）： 18-23.]

郝杰，阮少寧，林思祖，張濤，薛明瑜. 2014. Fe+與Ti+注入對(duì)杉木苗高及相對(duì)電導(dǎo)率的影響[J]. 泉州師范學(xué)院學(xué)報(bào)，32（2）： 13-16. [Hao J，Ruan S N，Lin S Z，Zhang T，Xue M Y. 2014. A comparative study of Fe+ and Ti+ ion implantation on seedling height and relative conductivity of Chinese fir[J]. Journal of Quanzhou Normal University，32（2）： 13-16.]

郝杰，阮少寧，林思祖，張濤，薛明瑜，丁恒先. 2015. 鐵與鈦離子注入對(duì)杉木幼苗葉綠素?zé)晒鈪?shù)及葉綠素含量的影響[J]. 輻射研究與輻射工藝學(xué)報(bào)，33（1）： 60-66. [Hao J，Ruan S N，Lin S Z，Zhang T，Xue M Y，Ding H X. 2015. A comparative study on chlorophyll fluorescence and chlorophyll content characteristics effects of Fe+ and Ti+ ion implantation in Chinese fir seedling[J]. Journal of Radiation Research and Radiation Processing，33（1）： 60-66.]

黃國(guó)偉，毛培宏，金湘，呂杰. 2009. 低能離子注入介導(dǎo)外源DNA轉(zhuǎn)化的原理與應(yīng)用[J]. 基因組學(xué)與應(yīng)用生物學(xué)，28（4）： 815-820. [Huang G W，Mao P H，Jin X，Lü J. 2009. Principle of exogenous mega-DNA transformation mediated by low-energy ion implantation and their applications[J]. Genomics and Applied Biology，28（4）： 815-820.]

黃欣，張乃燕，馬錦林，陳國(guó)臣，葉航. 2010. 我國(guó)油茶品質(zhì)育種研究進(jìn)展與展望[J]. 廣西林業(yè)科學(xué)，39（4）： 235-238. [Huang X，Zhang N Y，Ma J L，Chen G C，Ye H. 2010. Research progress and prospect of Camellia oleifera qua-lity breeding in China[J]. Guangxi Forestry Science，39（4）： 235-238.]

劉志高，張斌，童再康，季夢(mèng)成，梅婷. 2013. 鈦離子注入對(duì)3種石蒜屬植物種子生物化學(xué)特性的影響[J]. 核農(nóng)學(xué)報(bào)，27（2）： 146-151. [Liu Z G，Zhang B，Tong Z K，Ji M C，Mei T. 2013. Effects of Ti+ implantation on biological and chemical characteristics of seeds from three species of Lycoris[J]. Journal of Nuclear Agricultural Sciences，27（2）： 146-151.]

羅小彥. 2019. 淺析油茶產(chǎn)量的影響因素及整改措施[J]. 南方農(nóng)業(yè)，13（2）： 67-69. [Luo X Y. 2019. Analysis of the influencing factors of oil tea yield and the rectification measures[J]. South China Agriculture，13（2）： 67-69.]

邵蕊，趙苗苗，趙芬，沈瑞昌，劉麗香，張麗云，徐明. 2018. 施肥對(duì)油茶園土壤呼吸和異養(yǎng)呼吸及其溫度敏感性的影響[J]. 生態(tài)學(xué)報(bào)，38（7）： 2315-2322. [Shao R，Zhao M M，Zhao F，Shen R C，Liu L X，Zhang L Y，Xu M. 2018. Effects of fertilization on soil respiration，heterotrophic respiration，and temperature sensitivity in an oil tea plantation[J]. Acta Ecologica Sinica，38（7）： 2315-2322.]

宋道軍，姚建銘，邵春林，余增亮. 1999. 離子注入微生物產(chǎn)生“馬鞍型”存活曲線的可能作用機(jī)制[J]. 核技術(shù)，22（3）： 129-132. [Song D J，Yao J M，Shao C L，Yu Z L. 1999. A possible mechanism of dose related survival of microo-rganism implanted by N+ ions[J]. Nuclear Techniques，22（3）： 129-132.]

孫少波，杜華強(qiáng)，李平衡，周國(guó)模，徐小軍，高國(guó)龍，李雪建. 2016. 基于小波變換的毛竹葉片凈光合速率高光譜遙感反演[J]. 應(yīng)用生態(tài)學(xué)報(bào)，27（1）： 49-58. [Sun S B，Du H Q，Li P H，Zhou G M，Xu X J，Gao G L，Li X J. 2016. Retrieval of leaf net photosynthetic rate of moso bamboo forests using hyperspectral remote sensing based on wavelet transform[J]. Chinese Journal of Applied Ecology，27（1）： 49-58.]

王保明，李紅波，陳永忠，莫華. 2019. 油茶Rubisco基因的鑒定及其在高產(chǎn)種質(zhì)篩選中的應(yīng)用[J]. 福建農(nóng)林大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），48（5）： 605-613. [Wang B M，Li H B，Chen Y Z，Mo H. 2019. Identification of Rubisco genes of Camellia oleifera Abel. and its application on the selection of high tea oil cultivars[J]. Journal of Fujian Agri-culture and Forestry University（Natural Science Edition），48（5）： 605-613.]

王文斌，李雪. 2019. 廣西油茶種植技術(shù)與油茶作物發(fā)展前景分析[J]. 吉林農(nóng)業(yè)，（8）： 73-74. [Wang W B，Li X. 2019. Analysis of Camellia oleifera planting technology and development prospect of Camellia oleifera crops in Guangxi[J]. Agriculture of Jilin，（8）：73-74.]

王以紅，陶曉瑜，劉海龍，陳曉明，邱英雄. 2009. 兩個(gè)葉綠體基因位點(diǎn)的DNA條形碼在桉屬種間鑒定中的應(yīng)用[J]. 園藝學(xué)報(bào)，36（11）： 1651-1658. [Wang Y H，Tao X Y，Liu H L，Chen X M，Qiu Y X. 2009. A two-locus chloroplast（cp） DNA barcode for identification of different species in Eucalyptus[J]. Acta Horticulturae Sinica，36（11）： 1651-1658.]

徐斌，廖煥琴，楊會(huì)肖，朱報(bào)著，潘文，張方秋. 2017. 杜鵑紅山茶優(yōu)良無(wú)性系遺傳多樣性的ISSR分析[J]. 北方園藝，（7）： 127-131. [Xu B，Liao H Q，Yang H X，Zhu B Z，Pan W，Zhang F Q. 2017. Genetic diversity analysis on Camellia azalea superior clones based on ISSR markers[J]. Northern Horticulture，（7）： 127-131.]

楊澤粟，張強(qiáng)，郝小翠，陽(yáng)伏林. 2014. 半干旱雨養(yǎng)地區(qū)春小麥氣孔導(dǎo)度和胞間CO2濃度對(duì)環(huán)境因子的響應(yīng)[J]. 科學(xué)技術(shù)與工程，14（33）： 20-27. [Yang Z S，Zhang Q，Hao X C，Yang F L. 2014. The response of stomatal conductance and intercellular CO2 of spring wheat to climatic factors in Semi-arid rain-fed region of Loess Plateau[J]. Science Technology and Engineering，14（33）： 20-27.]

游璐，樊妮娜，胡冬南. 2015. 不同沼液用量對(duì)油茶生長(zhǎng)及果實(shí)品質(zhì)的影響[J]. 經(jīng)濟(jì)林研究，33（2）： 92-96. [You L，F(xiàn)an N N，Hu D N. 2015. Effects of biogas slurry dosages on growth and fruit quality in Camellia oleifera[J]. Nonwood Forest Research，33（2）： 92-96.]

袁兵. 2014. 水稻OsMsh6基因的多樣性及其插入突變體的離子束誘變效應(yīng)[D]. 杭州：浙江大學(xué). [Yuan B. 2014. The diversity of rice OsMsh6 gene and ion implantation mutagenesis of its Insertion mutants[D]. Hangzhou： Zhejiang University.]

袁軍，王慧，董文統(tǒng)，冉舵，譚曉風(fēng). 2017. 不同砧木對(duì)海南油茶嫁接成活率和苗木生長(zhǎng)的影響[J]. 熱帶作物學(xué)報(bào)，38（7）： 1193-1197. [Yuan J，Wang H，Dong W T，Ran D，Tan X F. 2017. Effects of four rootstocks on the survival percentage of grafting and growth of Camellia oleifera seedlings[J]. Chinese Journal of Tropical Crops，38（7）： 1193-1197.]

曾艷玲，譚曉風(fēng)，張斌，范曉明，劉長(zhǎng)虹. 2011. 鈦離子注入對(duì)油茶種子生理生化反應(yīng)及初期生長(zhǎng)的影響[J]. 中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)，27（28）： 53-57. [Zeng Y L，Tan X F，Zhang B，F(xiàn)an X M，Liu C H. 2011. Effects of the Ti2+ ion implantation on physiological-biochemical reaction and seminal growth of Camellia oleifera seeds[J]. Chinese Agricultu-ral Science Bulletin，27（28）： 53-57.]

張斌. 2018. 離子注入對(duì)杉木幼苗光合生理的影響[J]. 江西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，40（2）： 225-234. [Zhang B. 2018. The effect of ion-beam implantation on the photosynthesis characterics of Chinese fir seedlings[J]. Acta Agriculturae Universitis Jiangxiensis（Natural Sciences Edition），40（2）： 225-234.]

張斌，李志輝，傅新文，張冬林，王敏姿. 2010. N+注入對(duì)紫薇光合特性和葉綠素含量的影響[J]. 激光生物學(xué)報(bào)，19（3）： 303-306. [Zhang B，Li Z H，F(xiàn)u X W，Zhang D L，Wang M Z. 2010. Effects of N+ beam implantation on photosynthesis characters and chlorophyll contents of Lagerstroemia indica Linn[J]. Acta Laser Biology Sinica，19（3）： 303-306.]

張寧，虞龍，楊立峰. 2006. 利用金屬鈦離子注入天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶生產(chǎn)菌誘變篩選高產(chǎn)菌株的初步研究[J]. 輻射研究與輻射工藝學(xué)報(bào)，24（2）： 125-128. [Zhang N，Yu L，Yang L F. 2006. Screening on the higher yield of transa-minase producing Escherichia coli with the metal ion implantation[J]. Journal of Radiation Research and Radiation Processing，24（2）： 125-128.]

趙夏緯，王一峰，馬文梅. 2019. 高寒草地不同坡向披針葉黃華蒸騰速率與葉性狀的關(guān)系[J]. 生態(tài)學(xué)報(bào)，39（7）： 2494-2500. [Zhao X W，Wang Y F，Ma W M. 2019. The relationship of transpiration rate with leaf characters of Thermopsis lanceolate in different slopes of an alpine meadow[J]. Acta Ecologica Sinica，39（7）： 2494-2500.]

周罕覓，牛曉麗，燕輝，趙龍，趙娜，向友珍. 2019. 水肥耦合對(duì)蘋果幼樹(shù)生長(zhǎng)及光合特性的影響[J]. 河南農(nóng)業(yè)科學(xué)，48（10）： 112-119. [Zhou H M，Niu X L，Yan H，Zhao L，Zhao N，Xiang Y Z. 2019. Effects of water and fertilizer coupling on growth and photosynthetic characteristics of young apple tree[J]. Journal of Henan Agricultural Scien-ces，48（10）： 112-119.]

朱紹丹，陳麗，焦健，李朝周，劉文蘭，趙陽(yáng). 2019. 土壤干旱及生草間作對(duì)油橄欖光合特性的影響[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，35（2）： 282-288. [Zhu S D，Chen L，Jiao J，Li C Z，Liu W L，Zhao Y. 2019. Effects of soil drought and grass intercropping on photosynthetic characteristics of olive[J]. Jiangsu Journal of Agricultural Sciences，35（2）： 282-288.]

Fan X X，Zang J，Xu Z G，Guo S R，Jiao X L，Liu X Y，Gao Y. 2013. Effects of different light quality on growth，chlorophyll concentration and chlorophyll biosynthesis precursors of non-heading Chinese cabbage（Brassica campestris L.）[J]. Acta Physiologiae Plantarum，35（9）： 2721-2726.

Feng H Y，Liu X L，Yuan H，Kong M G，Wu L J，Wu Y J，Yu Z L. 2006. Utilizing low-energy ion beams to study living organisms[J]. Surface and Coatings Technology，201（19-20）： 8034-8038.

Han Y G，Xu L，Yang P L，Ren S M. 2013. Study on the growth and the photosynthetic characteristics of low energy C+ ion implantation on peanut[J]. PLoS One：e68769.doi： 10.1371/journal.pone.0068769.

Wang H，Sánchez-Molina J A，Li M，Berenguel M，Yang X T，Bienvenido J F. 2016. Leaf area index estimation for a greenhouse transpiration model using external climate conditions based on genetics algorithms，back-propagation neural networks and nonlinear autoregressive exogenous models[J]. Agricultural Water Management，183： 107-115.

Ya H Y，Chen Q F，Wang W D，Chen W G，Qin G Y，Jiao Z. 2012. Gene expression profiles in promoted-growth rice seedlings that germinated from the seeds implanted by low-energy N+ beam[J]. Journal of Radiation Research，53（4）： 558-569.

Yu Z L.2000. Ion beam application in genetic modification[J]. IEEE Transactions on Plasma Science，28（1）： 128-132.

（責(zé)任編輯 鄧慧靈）

收稿日期：2020-01-17

基金項(xiàng)目：湖南省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（2019JJ50986）;湖南省教育廳科學(xué)研究重點(diǎn)項(xiàng)目（18A152）

作者簡(jiǎn)介：*為通訊作者，曾艷玲（1980-），博士，教授，主要從事經(jīng)濟(jì)林栽培育種研究工作，E-mail： zengyanling110@126.com。李維偉（1999-），研究方向?yàn)榻?jīng)濟(jì)林栽培育種，E-mail： liweiweiorg@126.com