李娜娜，黃志強，顧兆泰，安昕

1 廣東歐譜曼迪科技有限公司，佛山市，528200

2 廣東省醫(yī)療器械質(zhì)量監(jiān)督檢驗所，廣州市，510663

0 引言

近年來，熒光成像技術(shù)在臨床的應(yīng)用逐漸廣泛，為外科手術(shù)實時顯示熒光劑所在的解剖結(jié)構(gòu)和病灶，被認為是一種新穎的術(shù)中導(dǎo)航技術(shù)。其中，基于吲哚菁綠（Indocyanine Green，ICG）近紅外熒光造影劑的成像技術(shù)由于穿透性深、無自發(fā)熒光背景等優(yōu)勢，其圖像效果備受認可，近幾年被廣泛應(yīng)用于臨床血流灌注、淋巴結(jié)等解剖結(jié)構(gòu)標記和病灶標記等領(lǐng)域[1-2]。隨著大量臨床研究和手術(shù)應(yīng)用的普及，市場上出現(xiàn)的基于ICG造影劑的熒光攝像系統(tǒng)越來越多，如：Stryker公司的Pinpoint系統(tǒng)、Storz公司的IMAGE1 STM、達芬奇手術(shù)機器人加載的ICG近紅外導(dǎo)航系統(tǒng)、日本濱松的PDE、上海逸思醫(yī)療的EasyscopyTM和北京數(shù)字精準醫(yī)療的慧眼系統(tǒng)等。生物組織的光學(xué)特性、熒光造影劑的積累和熒光攝像系統(tǒng)的熒光成像相關(guān)性能，如靈敏度、動態(tài)范圍、信噪比和信背比等，共同決定了最終臨床所呈現(xiàn)的熒光圖像[3]。為適應(yīng)特定成像系統(tǒng)，臨床需嚴格控制使用造影劑的方式、時間與劑量，以保證熒光信號落在攝像系統(tǒng)的良好響應(yīng)范圍內(nèi)，避免信號難以區(qū)分、圖像噪聲大或者信號過曝等問題。但是，目前仍沒有相應(yīng)的評價熒光攝像系統(tǒng)性能的指導(dǎo)或標準文件，無法進行產(chǎn)品性能的量化分析和質(zhì)量監(jiān)督。市面上產(chǎn)品的熒光性能亦沒有統(tǒng)一標準，這使得造影方案需根據(jù)攝像系統(tǒng)反復(fù)調(diào)整，為相關(guān)臨床研究和應(yīng)用帶來極大不便。我們提出一種熒光攝像系統(tǒng)的熒光性能檢測標準方法，嚴格定義幾類影響熒光圖像的相關(guān)熒光性能參數(shù)，提出科學(xué)可行的檢測和分析方法，并通過實例驗證，旨在為熒光性能評價提供可行的標準參考。

1 關(guān)鍵參數(shù)設(shè)定與定義

臨床應(yīng)用熒光導(dǎo)航技術(shù)時，以不同的方式進行熒光造影劑給藥，利用藥品在代謝過程中的特定生物組織區(qū)域集聚進行熒光的激發(fā)成像。熒光攝像系統(tǒng)通常包含激發(fā)光源、熒光信號收集和熒光信號采集處理模塊，使用匹配熒光造影劑吸收峰的特定波段光源進行照射激發(fā)，收集成像區(qū)域的熒光信號，過濾掉激發(fā)光及其他雜散光，進行熒光信號采集和圖像處理。其中，各模塊的設(shè)計和參數(shù)都嚴重影響所得熒光信號的質(zhì)量，過多的變量使得市面產(chǎn)品性能不一，難以評估。在生物組織光學(xué)特性及熒光造影劑濃度確定的情況下，作為終端熒光成像設(shè)備，熒光攝像系統(tǒng)的信噪比、信背比、靈敏度和響應(yīng)動態(tài)范圍等參數(shù)至關(guān)重要，可作為評估熒光成像性能的重要標準。這些參數(shù)的標準建立、量化檢測和分析，對熒光攝像系統(tǒng)的性能評估和臨床應(yīng)用的方案研究有極大的意義。

1.1 信背比

信背比（Signal-to-Background Ratio，SBR）是評價熒光圖像質(zhì)量的關(guān)鍵參數(shù)，在臨床上往往與熒光檢測的敏感度和檢出率相關(guān)，常作為臨床研究的相關(guān)終點參數(shù)[3]。特定的組織光學(xué)特性和成像設(shè)備對背景光的濾除能力，共同決定了熒光圖像的背景。強度過高的背景信號將使熒光信號對比度下降，影響圖像質(zhì)量和臨床評估。在腫瘤熒光顯影中，通常將腫瘤和背景組織的熒光信號比值稱為腫瘤背景比（Tumor-to-Background Ratio，TBR），有報道認為該腫瘤特異性的信號差異比值至少大于3，才可使外科醫(yī)生在臨床研究中區(qū)分腫瘤和正常組織[4]。

本研究以溶液樣品的熒光信號和接近樣品的背景信號的比值為信背比，作為評估熒光信號質(zhì)量的關(guān)鍵參數(shù)。具體地，在熒光圖像中樣品孔熒光區(qū)域內(nèi)，選取M個像素點，并將計算出平均亮度值作為熒光信號強度的平均值：

然后，在熒光區(qū)域附近選取無熒光背景區(qū)域中的K個像素點，并將計算出平均亮度值作為背景信號強度的平均值：

所得信背比即為：

該比值越高，代表成像設(shè)備在背景雜散光過濾方面性能越好，其熒光信號與背景差異更大，熒光顯影區(qū)域如腫瘤、淋巴等，與周圍背景組織的區(qū)分程度越大，越有助于區(qū)分正常組織和病變組織[3-4]。

1.2 信噪比

噪聲是影響成像質(zhì)量的重要因素，圖像的噪聲可來源于成像系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)性噪聲和隨機噪聲。同等水平噪聲對不同強度的信號的圖像質(zhì)量影響不同，以信噪比（Signal-to-Noise Ratio，SNR）評價圖像質(zhì)量是圖像評價的常用手段，通常通過比較探測信號數(shù)值和背景噪聲數(shù)值得到。從圖像信號上看，信噪比的大小代表著圖像信號的連續(xù)性，是區(qū)分圖像有用信號和噪聲的一個重要參數(shù)。

本研究以常用的方差法進行信噪比評估，即信噪比為感興趣區(qū)域內(nèi)測量信號強度的平均值和測量信號強度的標準差之間的比值[5-7]。對于圖像中，Pi是有熒光標記的測量區(qū)域A中單個像素的灰度值，M為測量區(qū)域的像素數(shù)，S為測量信號強度的平均值，如下：

N為測量信號的標準差，如下：

所得信噪比即為：

信噪比越高，代表成像設(shè)備所探測信號質(zhì)量越好，圖像越細膩。

1.3 靈敏度與響應(yīng)動態(tài)范圍

特定條件下，熒光攝像系統(tǒng)對一定濃度范圍內(nèi)的造影劑熒光產(chǎn)生可變化信號響應(yīng)，高于該濃度范圍的造影劑熒光將持續(xù)呈現(xiàn)信號峰值響應(yīng)，低于該濃度范圍的造影劑熒光將保持低強度信號響應(yīng)或無信號，該濃度區(qū)間即為成像系統(tǒng)的響應(yīng)動態(tài)范圍。其中，在信號質(zhì)量符合要求的情況下，可探測的最低熒光劑濃度即為系統(tǒng)的靈敏度。攝像系統(tǒng)的響應(yīng)動態(tài)區(qū)間應(yīng)包含臨床進行成像的目標熒光造影劑濃度區(qū)間，否則將無法產(chǎn)生與濃度相關(guān)的響應(yīng)，無法體現(xiàn)真實的造影劑濃度情況。臨床時可通過目標組織的ICG濃度來判定該位置的血流灌注是否良好以及吻合口漏等情況[8]，攝像系統(tǒng)的響應(yīng)動態(tài)區(qū)間過小或與造影方案不適配都容易影響臨床判斷。其中，系統(tǒng)靈敏度是指熒光成像系統(tǒng)可達到有效成像效果的最低熒光劑濃度，影響著熒光檢測的敏感性和檢出率等。

在響應(yīng)動態(tài)范圍與靈敏度的測試中，可先通過信噪比和信背比確認信號質(zhì)量，進行最低有效成像濃度的計算。具體地，可通過獲取不同濃度熒光劑的圖像，測量得到梯度濃度的信噪比和信背比。以信噪比SNR＞20 dB[9]為標準，符合信號質(zhì)量要求為有效探測信號，在此前提下，當信背比SBR＞3[10]時，所對應(yīng)的最低熒光劑濃度即為熒光系統(tǒng)的探測靈敏度。符合信號質(zhì)量要求的最低探測濃度至系統(tǒng)開始呈現(xiàn)峰值響應(yīng)的濃度區(qū)間即為系統(tǒng)的響應(yīng)動態(tài)范圍。

2 關(guān)鍵參數(shù)檢測方法

熒光攝像系統(tǒng)的信噪比、信背比、靈敏度和響應(yīng)動態(tài)范圍等參數(shù)作為評估系統(tǒng)熒光成像性能的重要指標，我們?yōu)槠錂z測和量化分析設(shè)計了科學(xué)實用的檢測方法，操作流程，如圖1所示。

圖1 熒光攝像系統(tǒng)的性能檢測流程圖Fig.1 Flow chart of the performance detection of fluorescence imaging system

2.1 測試樣品盤

本研究為了科學(xué)評估熒光成像系統(tǒng)，設(shè)計一個標準的熒光試劑樣品盤，以統(tǒng)一不同成像系統(tǒng)的測試條件。如圖2所示，樣品盤四個角落直徑為5 mm的半圓凹坑ABCD/abcd，作為盛載高濃度熒光劑的視野定位孔，用于熒光成像時保持成像系統(tǒng)所觀察的視場一致。其中，ABCD四個視野定位孔對16:9成像畫面，abcd視野定位孔針對4:3畫面。樣品盤中間區(qū)域設(shè)置圓形排列直徑為10 mm的半圓凹坑，作為盛載測量所用的不同濃度熒光劑的測試樣品孔，使測試樣品處于視野中央，保持照明角度一致，避免測試時產(chǎn)生偏差。樣品盤采用白色PVC塑料加工而成，其效果如圖2樣品盤實物圖所示。

圖2 熒光試劑樣品盤示意圖及實物圖Fig.2 Schematic diagram and physical product of the fluorescent agent sample disk

2.2 預(yù)測試與熒光劑配制

此處以吲哚菁綠作熒光劑為例，進行熒光攝像系統(tǒng)探測樣品的配制。稱取一定量的吲哚菁綠粉末，用去離子水充分溶解，作為母液。由于不同熒光攝像系統(tǒng)的性能差異可能較大，可先使用血清稀釋上述吲哚菁綠溶液，于離心管內(nèi)配制不同濃度溶液，使用待測設(shè)備進行成像，作為預(yù)測試，為選擇探測溶液濃度提供參考。預(yù)測試中，隨著溶液濃度增加，熒光信號將逐漸增強，最終呈現(xiàn)過曝現(xiàn)象。根據(jù)預(yù)測試結(jié)果，選擇溶液熒光信號過曝的臨界點附近的濃度作為測試樣品的1號溶液，使用血清稀釋1號溶液，以2倍為稀釋梯度，制備12管探測溶液。

本次實驗案例以歐譜曼迪科技有限公司研制的ICG熒光導(dǎo)航系統(tǒng)作為測試設(shè)備，預(yù)測試結(jié)果顯示62.50 nM溶液為熒光信號過曝的臨界點附近的濃度，以其為1號溶液進行稀釋，具體見表1。

2.3 測試方法與數(shù)據(jù)處理

將250 μL的ICG熒光溶劑按順序滴加入樣品盤的測試樣品孔中，保持液面與樣品盤持平，并將較高濃度探測液滴加入四個角落的視野定位孔中。調(diào)整待測設(shè)備的觀察距離和位置，使得樣品盤四個角落的視野定位孔正好完全進入視場。保存圖片，使用軟件ImageJ進行分析。如圖3所示，通過軟件區(qū)域選取功能，選取熒光區(qū)域和最接近熒光的背景區(qū)域，作為熒光信號區(qū)域和背景信號區(qū)域，進行平均值和標準差分析，通過1節(jié)中所述關(guān)鍵參數(shù)設(shè)定公式得到信噪比、信背比、動態(tài)響應(yīng)區(qū)間和設(shè)備靈敏度數(shù)據(jù)。

圖3 熒光信號區(qū)域和背景信號區(qū)域的選取Fig.3 Selections of fluorescence signal region and background signal region

2.4 材料與設(shè)備

本次測試采用歐譜曼迪科技有限公司研制的ICG熒光導(dǎo)航系統(tǒng)作為測試設(shè)備，該設(shè)備具有白光成像和近紅外熒光導(dǎo)航成像功能。測試使用熒光劑吲哚菁綠（CAS 號：3599-32-4，美侖生物，MB4675），小牛血清（Cat 號:SNCS，bovogen，Lot No:1602D）。

3 檢測結(jié)果與分析

按照所述方法配制不同濃度熒光劑后滴入樣品孔后進行成像。此處以歐譜曼迪科技有限公司的ICG熒光導(dǎo)航系統(tǒng)為待探測儀器，其圖像展示長寬比為4:3，選取樣品盤abcd小孔作為視野定位孔，滴入高濃度熒光劑。測試儀器時保持abcd視野定位孔恰好位于視野邊角，保存成像圖片以供數(shù)據(jù)分析。

實驗所得圖像如圖4所示，高濃度樣品孔的熒光信號呈現(xiàn)過曝狀態(tài)，濃度最低的三個樣品孔（10～12號溶液）無肉眼可分辨的信號，可能超出設(shè)備的動態(tài)響應(yīng)范圍。實驗通過2.3中所述方法對樣品熒光信號進行數(shù)據(jù)分析，未從濃度最低的10～12號溶液中測得可分辨信號，其他樣品孔信號如圖5（a）所示。從圖5（a）中可看出，隨著熒光劑濃度的增加，熒光強度逐漸增加，在濃度為31.25 nM的2號溶液信號灰度值開始達到254，進入峰值響應(yīng)的過曝平臺區(qū)間。對各樣品孔的信背比SBR進行分析發(fā)現(xiàn)，隨著樣品濃度升高，SBR呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，在低濃度區(qū)間，熒光信號較暗，與背景信號對比度不高；而在高濃度區(qū)間，較亮的熒光信號容易在周圍物體產(chǎn)生反射光，導(dǎo)致背景信號的上升，SBR下降。但從圖5（b）中可發(fā)現(xiàn)，1～9號樣品的SBR均高于最低標準3，不影響臨床辨別。在圖像信噪比SNR的分析中可見，隨著樣品濃度上升，SNR逐漸上升，其中8～9號低濃度樣品的SNR低于最低標準20，信號質(zhì)量不符合要求，視為無效探測信號。綜上，在SBR＞3和SNR＞20 dB的條件下，可探測的最低濃度為7號樣品，即0.98 nM，為所測系統(tǒng)的靈敏度。所測系統(tǒng)在樣品濃度高至31.25 nM時開始出現(xiàn)峰值響應(yīng)，其響應(yīng)動態(tài)范圍為0.98～31.25 nM。

表1 熒光劑溶液梯度表Tab.1 Concentration gradient of the fluorescence agent solution

圖4 待測儀器成像效果圖（白光圖像，熒光圖像）Fig.4 Imaging results of the equipment under test(the white-light image and the fluorescence image)

圖5 樣品參數(shù)圖Fig.5 Parmenter figures of samples

4 結(jié)論

本研究提出一種評估熒光攝像系統(tǒng)的標準方法，通過制定標準化測試樣品獲取待測系統(tǒng)的整體圖像，建立科學(xué)實用的信噪比、信背比、靈敏度和響應(yīng)動態(tài)范圍等參數(shù)的量化分析標準，對熒光攝像系統(tǒng)性能進行評估，旨在為相關(guān)產(chǎn)品性能的量化分析和質(zhì)量監(jiān)督提供切實可行的標準參考，同時也為臨床使用和應(yīng)用研究的圖像效果提供保障，促進熒光攝像系統(tǒng)在臨床上的廣泛應(yīng)用。