張運(yùn)峰

(唐山師范學(xué)院生命科學(xué)系，河北 唐山 063000)

【研究意義】植物病原真菌中TOXE蛋白作為轉(zhuǎn)錄因子在真菌寄主選擇性毒素的合成方面具有重要的作用，通過(guò)建立玉米大斑病菌StTOXE蛋白原核表達(dá)體系，為進(jìn)一步開(kāi)展StTOXE蛋白抗體制備、結(jié)構(gòu)解析和StTOXE蛋白功能研究奠定基礎(chǔ)?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】玉米大斑病(Setosphaeriaturcica)是玉米上的重要葉部病害之一，在世界各地的玉米產(chǎn)區(qū)均有發(fā)生，流行的年份會(huì)造成高達(dá)50 %的玉米減產(chǎn)[1-3]。近年來(lái)，關(guān)于玉米大斑病菌的研究主要集中于對(duì)病原菌的Ras[4]、MAPK[1,5]、cAMP及Ca2+途徑等信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的結(jié)構(gòu)及功能分析，尤其以對(duì)MAPK信號(hào)途徑的研究最為深入[6]。由于不同的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑之間存在著廣泛的交互調(diào)控(Cross Talk)[7]，造成一個(gè)信號(hào)途徑產(chǎn)生變化時(shí)，其它信號(hào)途徑會(huì)產(chǎn)生補(bǔ)充效應(yīng)。因此，利用這些基因作為靶位點(diǎn)防治玉米大斑病菌的技術(shù)面臨很大的挑戰(zhàn)。在中國(guó)玉米產(chǎn)區(qū)發(fā)現(xiàn)了超過(guò)15個(gè)玉米大斑病菌致病小種，包括0、1、3、N、12、13、1N、23、2N、3N、123、12N、13N、23N和123N[8]。玉米大斑病菌是否能夠?qū)闹饔衩桩a(chǎn)生侵染并形成病害，主要取決于玉米Ht基因的類型[9]。例如：1號(hào)小種會(huì)使基因型為Ht1的玉米品種感病，而對(duì)于Ht2和Ht3、HtN等基因型的玉米植株不能形成侵染。許多植物病原真菌都是通過(guò)分泌真菌毒素侵染寄主植物并使植物產(chǎn)生病理反應(yīng)[10]，真菌毒素分為兩類，一類為非寄主選擇性毒素，具有廣泛的寄主侵染活性，一類為寄主選擇性毒素(Host-Selective Toxins，HSTs)，它是由病原真菌分泌的一類低分子量次級(jí)代謝產(chǎn)物[11]，這一類毒素僅會(huì)對(duì)特異基因型的植物產(chǎn)生病理反應(yīng)，決定了病原真菌的寄主范圍和致病性[12]。Ahn Joong-Hoon等[10]首先在玉米圓斑病菌(Cochlioboluscarbonum)研究了HSTs毒素合成的機(jī)制，后相繼在Alternariajesenskae[13]、Burkholderiaglumae[14]等少數(shù)真菌中開(kāi)展研究。研究發(fā)現(xiàn)HSTs合成需要Tox2基因簇，并發(fā)現(xiàn)基因簇中的ToxE基因起著重要作用，TOXE蛋白作為一種轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控Tox2基因簇多個(gè)基因的協(xié)同表達(dá)，進(jìn)而調(diào)控毒素的合成，ToxE基因突變以后，突變體的致病力會(huì)喪失[12]。目前，HSTs合成的機(jī)制在其它植物病原真菌中報(bào)道還較少。【本研究切入點(diǎn)】玉米大斑病菌侵染玉米過(guò)程中存在明顯的小種?；F(xiàn)象，推測(cè)玉米大斑病菌病菌也具有玉米圓斑病菌類似的寄主選擇性毒素合成機(jī)制，因此，開(kāi)展玉米大斑病菌中StToxE基因和其蛋白的研究對(duì)證明和研究玉米大斑病菌寄主選擇性毒素合成機(jī)制具有重要作用?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】本研究將克隆StToxE基因，構(gòu)建StTOXE融合蛋白原核表達(dá)載體，并確定StTOXE融合蛋白最優(yōu)表達(dá)條件及其可溶性特征。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與質(zhì)粒 原核表達(dá)載體pET-28a(+)由河北農(nóng)業(yè)大學(xué)真菌毒素實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng)。玉米大斑病菌野生型Wt01-23和大腸桿菌菌株BL21(DE3)由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建和保存。

1.1.2 試劑 磁珠法 DNA 膠回收試劑盒、SanPrep 柱式質(zhì)粒 DNA 小量抽提試劑盒、ECL化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒和異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(ITPG)等試劑均購(gòu)自生工(上海)生物工程有限公司；TaqTMDNA 聚合酶、EcoR I和Hind III購(gòu)自寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司；細(xì)菌蛋白提取試劑盒、Western Blot Marker(PR1800)和Pfu DNA Polymerase購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司。Anti-His Tag Antibody (Monoclonal, 9C11)一抗和Goat Anti-Mouse IgG(H+L)Secondary Antibody(HRP Conjugate)二抗均購(gòu)自博士德生物工程有限公司(Boster Biological Technology co.ltd)。氯化鈉、蛋白胨和酵母提取物等試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

1.2 方法

1.2.1StToxE基因的克隆和凝膠回收 參照張運(yùn)峰[15]的方法提取玉米大斑病菌Wt01-23的RNA，反轉(zhuǎn)成cDNA。以StToxE-F(5’-GCGAATTCATGGCCGATGTCAACGAG-3’)和StToxE-R(5’-GCAA GCTTGGGCACAGCCTAGATTTACATTC-3’)特異引物進(jìn)行高保真PCR擴(kuò)增。 PCR擴(kuò)增體系為：Pfu DNA Polymerase 1.0 μl，10×Pfu buffer 2.5 μl，上下游引物各0.5 μl，cDNA 0.25 μl, 雙蒸水(ddH2O)補(bǔ)足至25 μl。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性10 s，55 ℃退火30 s, 72 ℃延伸3 min，30個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。經(jīng)1 %瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，用磁珠法 DNA 膠回收試劑盒回收PCR產(chǎn)物。

1.2.2 玉米大斑病菌StToxE基因表達(dá)載體的構(gòu)建和鑒定 將1.2.1回收獲得的PCR產(chǎn)物與載體pET28a(+)質(zhì)粒分別用限制性內(nèi)切酶HindIII和EcoR I進(jìn)行37 ℃酶切過(guò)夜反應(yīng)，用DNA回收試劑盒回收目的基因及載體片段，隨后將載體和PCR產(chǎn)物按1∶5進(jìn)行連接反應(yīng)后，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，用StToxE基因特異引物進(jìn)行篩選陽(yáng)性克隆菌落。使用SanPrep 柱式質(zhì)粒 DNA 小量抽提試劑盒提取重組質(zhì)粒，并進(jìn)行雙酶切鑒定，最后將驗(yàn)證正確的質(zhì)粒交生工(上海)生物工程股份有限公司測(cè)序。

1.2.3 ITPG最適誘導(dǎo)濃度摸索 將含有pET28a-StToxE質(zhì)粒的BL21(DE3)菌株在LB培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)，挑取單菌落接入3 mL LB液體培養(yǎng)基中震蕩培養(yǎng)過(guò)夜，按照1∶100將菌液接種入50 mL LB液體培養(yǎng)基中37 ℃，200 r/min振蕩培養(yǎng)，待OD600≈0.8時(shí)，加入終濃度為0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mmol/L的IPTG，繼續(xù)振蕩培養(yǎng)4 h，離心收集菌體沉淀。

1.2.4 StTOXE蛋白的SDS-PAGE和Western Blot檢測(cè) 參考宋楊等[16]將收集菌體沉淀并用PBS(磷酸緩沖液pH7.4)懸浮，加入2×聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)上樣緩沖液，100 ℃煮沸10 min，冰浴5 min后4 ℃、12 000 r/min 離心10 min。使用12 %的SDS-PAGE凝膠對(duì)上清液進(jìn)行電泳，考馬斯亮藍(lán)染色檢測(cè)蛋白表達(dá)。

將目的上清液進(jìn)行SDS-PAGE電泳后，將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，然后進(jìn)行Anti-His Tag Antibody (Monoclonal, 9C11)一抗孵育1.5 h，TBST洗滌5次，再進(jìn)行Goat Anti-Mouse IgG(H+L) Secondary Antibody(HRP Conjugate)孵育1.5 h，經(jīng)TBST洗膜后用ECL顯色，最后置于化學(xué)發(fā)光成像儀(上海嘉鵬科技有限公司，ZF-670)中檢測(cè)；另外，利用Image J軟件對(duì)不同ITPG濃度條件下StTOXE融合蛋白的Western blot檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行灰度分析，定量分析蛋白表達(dá)量的差異。

1.2.5 StTOXE蛋白的可溶性分析 將經(jīng)過(guò)誘導(dǎo)培養(yǎng)的菌液12 000 r/min離心2 min，用PBS(pH 8.0)緩沖液洗滌2次后，沉淀用1 mL PBS緩沖液重懸。細(xì)胞超聲破碎儀功率為200 W，超聲3 s，冷卻5 s進(jìn)行循環(huán)破碎40 min。裂解完成后4 ℃、10 000 r/min離心10 min，分別收集破碎后的上清和沉淀，SDS-PAGE電泳和Western Blot檢測(cè)分析重組蛋白的可溶性。

2 結(jié)果與分析

2.1 pET28a-StToxE原核表達(dá)載體的構(gòu)建及其鑒定

以玉米大斑病菌的cDNA為模板、StToxE的特異引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，在1500 bp的位置擴(kuò)增出一條的清晰、明亮、單一的條帶，與1470 bp理論值 的相同(圖1-A)。將StToxE基因與pET28a載體的連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α并獲得轉(zhuǎn)化子，以DH5α、DH5α-pET28a和DH5α-pET28a-StToxE菌體為模板進(jìn)行的PCR篩選，在隨機(jī)挑取的菌落中均擴(kuò)增出了1470 bp的條帶，而對(duì)照組DH5α、DH5α-pET28a均沒(méi)有擴(kuò)增出條帶(圖1-B)，證明隨機(jī)挑選的轉(zhuǎn)化菌落均為DH5α-pET28a-StToxE轉(zhuǎn)化子。提取DH5α-pET28a-StToxE轉(zhuǎn)化子質(zhì)粒后，HindIII和EcoR I雙酶切鑒定，發(fā)現(xiàn)5400和1470 bp的2個(gè)條帶，分別與載體pET28a和StToxE基因大小相同。經(jīng)過(guò)華大基因測(cè)序，堿基序列正確。

1～4：StToxE基因的擴(kuò)增結(jié)果；5～11：DH5α-pET28a-StToxE；12：pET28a-StToxE重組質(zhì)粒Hind III和EcoR I雙酶切；M：DL2000；M1：1Kb Marker

2.2 pET28-StToxE表達(dá)載體的誘導(dǎo)表達(dá)及Western Blot檢測(cè)

通過(guò)高溫煮沸裂解細(xì)菌菌體獲得的上清液進(jìn)行SDS-PAGE電泳和考馬斯亮藍(lán)染色，發(fā)現(xiàn)條帶數(shù)目沒(méi)有明顯差異，但在72 kD區(qū)域條帶存在明顯加粗(圖2-A)，初步確定StTOXE蛋白已經(jīng)表達(dá)。由于表達(dá)蛋白攜帶His標(biāo)簽，我們利用Western Blot試驗(yàn)進(jìn)一步檢測(cè)了StTOXE融合蛋白，結(jié)果發(fā)現(xiàn)BL21-pET28a上清液中未檢測(cè)到任何條帶，而B(niǎo)L21-pET28a-StToxE轉(zhuǎn)化子中檢測(cè)到72 kD的條帶(圖2B)。綜合考馬斯亮藍(lán)染色和Western Blot試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步確定StTOXE蛋白在BL21細(xì)胞中表達(dá)，且StTOXE蛋白約為72 kD。

1:BL21-pET28a表達(dá)蛋白; 2: BL21-pET28a-StToxE表達(dá)蛋白

2.3 不同濃度ITPG對(duì)StTOXE融合蛋白表達(dá)的影響

BL23-pET28-StToxE轉(zhuǎn)化子在不同濃度ITPG誘導(dǎo)4 h后，Western Blot檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)隨著ITPG濃度的增加蛋白表達(dá)量逐漸增加，ITPG濃度在0.2 mmol/L時(shí)有明顯的條帶形成，0.4～0.6 mmol/L時(shí)達(dá)到最大；隨后雜交條帶逐漸變淺，表明融合蛋白表達(dá)量逐漸減少(圖3)；灰度分析顯示：以0.2 mmol/L為對(duì)照，ITPG濃度達(dá)到0.4和0.6 mmol/L時(shí)顯著高于對(duì)照，表明蛋白表達(dá)量較高，而其它ITPG濃度條件下蛋白表達(dá)量均降低，ITPG濃度達(dá)到0.1 mmol/L，蛋白表達(dá)量顯著低于對(duì)照組(圖4)。

圖4 StTOXE融合蛋白Western blot的灰度分析結(jié)果Fig.4 Gray analysis results of StTOXE fusion protein Western blot

2.4 StTOXE表達(dá)蛋白的可溶性檢測(cè)

離心收集誘導(dǎo)表達(dá)后的含有pET28a-StToxE表達(dá)質(zhì)粒的大腸桿菌BL21 (DE3)，取上清及沉淀分別進(jìn)行SDS-PAGE和考馬斯亮藍(lán)染色、Western blot檢測(cè)，結(jié)果顯示沉淀中在72 kD發(fā)現(xiàn)一條清晰條帶，在上清中沒(méi)有出現(xiàn)同等大小的條帶(圖3-A)；Western blot結(jié)果也僅在72 kD位置檢測(cè)到一條清晰的條帶，而上清中為檢測(cè)出StTOXE蛋白(圖3-B)。因此，StTOXE融合蛋白僅存在于沉淀中，在上清中無(wú)明顯表達(dá)，表明重組蛋白以包涵體的形式存在，且重組蛋白單體為可溶性蛋白(圖5)。

1:裂解上清；2:裂解沉淀；M:PageRulerTM prestained protein lader；M1:Western blot marker(PR1800)

圖3 不同ITPG濃度條件下StTOXE融合蛋白的Western blot檢測(cè)(M:Western blot marker)Fig.3 Western blot detection of StTOXE fusion protein under different concentrations of ITPG

3 討 論

毒素是植物病原真菌重要的致病因子，也是植物病原真菌的研究熱點(diǎn)。董金皋等[17]的研究發(fā)現(xiàn)玉米大斑病菌可以產(chǎn)生致病毒素，且該毒素具有寄主專化性活性；張利輝等[18]在研究玉米大斑病菌2號(hào)小種毒素成份時(shí)指出玉米大斑病毒素中含有寄主選擇性毒素組份。本研究從玉米大斑病菌野生型菌種Wt01-23中克隆獲得了StToxE基因，構(gòu)建了原核表達(dá)載體pET28a-StToxE，并在大腸桿菌BL21 (DE3)中進(jìn)行了原核表達(dá)，通過(guò)分別收集破碎細(xì)胞的上清和沉淀，分析了表達(dá)蛋白的形式和可溶性。

由于構(gòu)建的pET-28a (+)載體的StToxE無(wú)終止子，且StTOXE融合蛋白在N端和C端分別各含有1個(gè)His-Tag，在N端還有1個(gè)T7-Tag，結(jié)合前期利用生物信息學(xué)工具分析StToxE融合蛋白獲得數(shù)據(jù)(數(shù)據(jù)另行發(fā)表)理論分子量約為55 kD。通過(guò)對(duì)誘導(dǎo)表達(dá)蛋白SDS-PAGE和Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示StTOXE融合蛋白的大小約為72 kD，比理論值大30.9 %。在前人研究結(jié)果中顯示表達(dá)蛋白分子量與預(yù)測(cè)值存在差異的情況并不少見(jiàn)[19-22]，甚至有文獻(xiàn)報(bào)道SDS-PAGE檢測(cè)結(jié)果超過(guò)預(yù)測(cè)值的70 %～100 %[23-24]，這個(gè)結(jié)果產(chǎn)生的原因His是堿性氨基酸帶有正電荷，而6個(gè)His的標(biāo)簽所帶的正電荷就更多，從而降低了泳動(dòng)速率，導(dǎo)致表觀分子質(zhì)量變大；另外，具有結(jié)合DNA的活性的蛋白，也會(huì)進(jìn)一步增加蛋白的分子質(zhì)量[24]，從而導(dǎo)致電泳結(jié)果和預(yù)測(cè)值有較大差異。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)在低濃度時(shí)StTOXE外源蛋白的表達(dá)量隨IPTG 濃度增加而逐漸升高，在IPTG 濃度為0.4～0.6 mmol/L時(shí)達(dá)到最大值，此后隨著IPTG 濃度的增加表達(dá)量反而下降，可能是因?yàn)楦邼舛鹊腎PTG 會(huì)對(duì)細(xì)菌菌體的生長(zhǎng)造成毒害作用，同時(shí)為了節(jié)約研究成本，選擇0.5 mmol/L為最適誘導(dǎo)濃度。另外，在37 ℃條件下，StTOXE融合蛋白全部以包涵體形式存在于宿主菌中。包涵體的形成是外源蛋白高效表達(dá)時(shí)的普遍現(xiàn)象[25]，較高的溫度可以提高翻譯起始效率，增加蛋白表達(dá)量[26]，但是外源蛋白表達(dá)過(guò)快時(shí)往往造成蛋白不能自發(fā)折疊卷曲生成有一定空間結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)，從而形成包涵體，影響蛋白活性。減少包涵體的形成比率可以通過(guò)優(yōu)化培養(yǎng)基、降低誘導(dǎo)溫度[27-28]、使用增溶標(biāo)簽[29]、使用突變菌株[30]等方法，其中，降低誘導(dǎo)溫度是常用的增強(qiáng)蛋白可溶性[31]的有效方法，后期試驗(yàn)中可開(kāi)展通過(guò)降低誘導(dǎo)溫度增加StTOXE融合蛋白溶解性的研究。

4 結(jié) 論

本研究通過(guò)RT-PCR克隆了玉米大斑病菌StToxE基因；將StToxE基因插入PET28原核表達(dá)載體中成功構(gòu)建了StTOXE融合蛋白表達(dá)載體pET28a-StToxE，并將表達(dá)載體轉(zhuǎn)化BL21菌株中獲得BL21-pET28a-StToxE轉(zhuǎn)化子；通過(guò)ITPG誘導(dǎo)、Western Blot檢測(cè)確認(rèn)了StTOXE融合蛋白在BL21菌株中表達(dá)，并發(fā)現(xiàn)ITPG濃度為0.4～0.6 mmol/L時(shí)融合蛋白表達(dá)效率最高；當(dāng)誘導(dǎo)溫度為37 ℃時(shí)StTOXE融合蛋白基本以包涵體形式存在細(xì)胞內(nèi)，且融合蛋白單體為可溶性蛋白。