徐 睿，王雪鵬,周 兵

(1.北華大學(xué)，吉林 吉林132013；2.北華大學(xué)附屬醫(yī)院 神經(jīng)外科，吉林 吉林132011；3.吉林大學(xué)校醫(yī)院 綜合外科)

血管性癡呆(VD)是由各種腦血管疾病因素引起腦組織受損、腦循環(huán)障礙、而導(dǎo)致的智能損害綜合癥[1]。氧化應(yīng)激(OS)是由于機(jī)體內(nèi)發(fā)生氧化與抗氧化失衡，從而引起細(xì)胞、組織的氧化損傷，其在血管性癡呆的發(fā)生與發(fā)展的每一個(gè)環(huán)節(jié)中都發(fā)揮重要作用[2,3]。奧拉西坦(OX)是環(huán)羥基氨基丁酸的衍生物，可有效改善血管性癡呆癥狀，可促進(jìn)磷脂酰膽堿和磷脂酰乙醇的合成，增加神經(jīng)細(xì)胞的蛋白質(zhì)與核酸的形成作用，但是該藥臨床應(yīng)用的長(zhǎng)期療效不佳[4,5]。銀杏葉提取物(GBE)是一種傳統(tǒng)而廉價(jià)的中草藥，化學(xué)成分復(fù)雜，是從干的銀杏樹(shù)葉子內(nèi)提取的藥用成分，具有調(diào)節(jié)血管活性、清除自由基、抗氧化、抗血小板凝聚、調(diào)節(jié)血管活性等多種作用[6,7]。γ-氨基丁酸轉(zhuǎn)運(yùn)體-1(GAT-1)與cAMP反應(yīng)原件結(jié)合蛋白(CREB)是腦內(nèi)重要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，在阻斷興奮擴(kuò)散和傳導(dǎo)過(guò)程中發(fā)揮重要作用[8,9]。本文為此具體探討了銀杏葉提取物對(duì)血管性癡呆大鼠記憶力及GAT1、CREB表達(dá)的影響，以明確銀杏葉提取物的作用效果與機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象

SPF級(jí)成年雄性Sprague Dawley(SD)大鼠(30只)購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司(動(dòng)物許可證編號(hào)00010751，4-5周齡，體重140 g-160 g，飼養(yǎng)環(huán)境：溫度在22℃-24℃，相對(duì)濕度40%-60%，食水自由，12/12 h光照黑暗循環(huán))；奧拉西坦(國(guó)藥準(zhǔn)字H20183388，青島金峰制藥有限公司)；銀杏葉提取物標(biāo)準(zhǔn)品(中國(guó)食品藥品檢定研究院，中國(guó))。酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒(寶生物工程有限公司，中國(guó))，抗GAT1抗體與抗CREB抗體(Sigma公司，美國(guó))，氯仿、異丙醇(國(guó)藥集團(tuán))，無(wú)水乙醇(川東化學(xué)試劑廠)。

1.2 動(dòng)物分組與處理

所有大鼠都采用了改良雙側(cè)頸總動(dòng)脈分次結(jié)扎的方法制備大鼠血管性癡呆模型，具體措施如下：用濃度為3%的戊巴比妥鈉注射液(體重40 mg/kg)腹腔注射麻醉大鼠，沿大鼠頸正中線切口切開(kāi)皮膚，分離雙側(cè)頸總動(dòng)脈與迷走神經(jīng)。采用0號(hào)手術(shù)線從血管下穿過(guò)，將右側(cè)頸動(dòng)脈結(jié)扎。縫合頸部手術(shù)切口并腹腔注射青霉素注射液10萬(wàn)，放回籠中常規(guī)飼養(yǎng)。3 d后拆除頸部手術(shù)線，進(jìn)行大鼠左側(cè)頸動(dòng)脈結(jié)扎并進(jìn)行縫合。造模成功標(biāo)準(zhǔn)：跨越平臺(tái)時(shí)間(逃避潛伏期)顯著延長(zhǎng)，跨越平臺(tái)次數(shù)顯著少于正常大鼠，精神變差，反應(yīng)遲鈍。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，無(wú)大鼠死亡。

把造模成功的大鼠隨機(jī)分為三組-對(duì)照組、奧拉西坦組與銀杏組，每組各10只大鼠。對(duì)照組造模成功后給予生理鹽水10 mg/kg·d靜脈注射，連續(xù)2周。奧拉西坦組在造模成功后給予奧拉西坦10 mg/kg·d尾靜脈注射，連續(xù)2周。銀杏組大鼠造模成功后給予銀杏葉提取物10 mg/kg·d尾靜脈注射，連續(xù)2周。每次給藥過(guò)程中，每只大鼠均更換經(jīng)高壓滅菌后導(dǎo)管帽及注射內(nèi)針，預(yù)防感染。

1.3 觀察指標(biāo)

(1)在造模后1 d、7 d與14 d進(jìn)行水迷宮實(shí)驗(yàn)，記錄逃避潛伏期。在水迷宮裝置自動(dòng)記錄大鼠從入水到尋臺(tái)成功的時(shí)間，即逃避潛伏期，如120 s大鼠仍未找到平臺(tái)，則潛伏期為120 s。(2)在造模后14 d處死大鼠，迅速分離雙側(cè)的海馬組織，迅即放入液氮中冷凍，于4 ℃下1 000 rpm，離心15 min，取上清液，采用酶聯(lián)免疫法檢測(cè)海馬組織IL-1β、IL-6的含量。(3)取海馬組織的樣本，提取總蛋白，采用Western blot法檢測(cè)GAT1、CREB蛋白相對(duì)表達(dá)水平，以β-actin作為內(nèi)標(biāo)。(4)取處死大鼠的頸動(dòng)脈組織，制成病理切片，進(jìn)行HE染色。然后選擇3個(gè)含血管組織豐富的區(qū)域進(jìn)行計(jì)數(shù)，取平均值。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

選擇SPSS19.00軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計(jì)量數(shù)據(jù)選擇均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差進(jìn)行表示，計(jì)數(shù)數(shù)據(jù)采用百分比進(jìn)行表示，本研究多組間數(shù)據(jù)對(duì)比用one-way ANOVA分析，兩兩比較用t-test分析與卡方分析等，P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 逃避潛伏期對(duì)比

三組造模后1 d的逃避潛伏期對(duì)比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，銀杏組與奧拉西坦組造模后7 d、14 d的逃避潛伏期低于對(duì)照組，銀杏組低于奧拉西坦組，對(duì)比差異都有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表1。

表1 三組造模后不同時(shí)間點(diǎn)的逃避潛伏期對(duì)比(s，均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差)

注：與對(duì)照組對(duì)比，①P<0.05；與奧拉西坦組對(duì)比，②P<0.05.

2.2 病理染色情況對(duì)比

對(duì)照組：頸動(dòng)脈血管內(nèi)膜與鄰近細(xì)胞層之間距離增寬，血管內(nèi)彈力層和中彈力層扭曲，斑塊基底部存在較多泡沫樣改變，內(nèi)膜下可見(jiàn)增生的平滑肌細(xì)胞及堆積的脂質(zhì)斑塊。銀杏組：頸動(dòng)脈壁管腔厚度基本一致，血管平滑肌排列基本規(guī)律，血管內(nèi)膜基本光滑，血管內(nèi)皮下增生少見(jiàn)。奧拉西坦組：介于對(duì)照組與銀杏組之間。

銀杏組與奧拉西坦組造模后14 d的頸動(dòng)脈微血管密度高于對(duì)照組，銀杏組高于奧拉西坦組，對(duì)比差異都有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表2。

表2 三組造模后14 d的頸動(dòng)脈微血管密度對(duì)比(血管數(shù)/mm2，均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差)

注：與對(duì)照組對(duì)比，①P<0.05；與奧拉西坦組對(duì)比，②P<0.05.

2.3 IL-1β、IL-6含量對(duì)比

銀杏組與奧拉西坦組造模后14 d海馬組織的IL-1β、IL-6低于對(duì)照組，銀杏組低于奧拉西坦組，對(duì)比差異都有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表3。

表3 三組造模后14 d的海馬組織IL-1β、IL-6含量對(duì)比(pg/ml，均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差)

注：與對(duì)照組對(duì)比，①P<0.05；與奧拉西坦組對(duì)比，②P<0.05.

2.4 GAT1、CREB蛋白水平對(duì)比

銀杏組與奧拉西坦組造模后14 d海馬組織的GAT1、CREB蛋白相對(duì)表達(dá)水平高于對(duì)照組，銀杏組高于奧拉西坦組，對(duì)比差異都有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表4與圖1。

表4 三組造模后14 d的海馬組織GAT1、CREB蛋白相對(duì)表達(dá)水平對(duì)比

注：與對(duì)照組對(duì)比，①P<0.05；與奧拉西坦組對(duì)比，②P<0.05.

圖1 三組造模后14 d的海馬組織GAT1、CREB蛋白表達(dá)水平

3 討論

銀杏葉為銀杏的干燥葉，銀杏為銀杏科的多年落葉喬木，味甘、苦、澀，性平[10]。銀杏葉提取物的主要有效成分包括銀杏黃酮和萜類內(nèi)酯，具有斂肺平喘、化濁降脂、活血化瘀、通經(jīng)止痛等功效[11]?，F(xiàn)代研究表明銀杏內(nèi)酯是天然血小板活化因子受體拮抗劑，可減輕血小板聚集、微血栓形成和脂質(zhì)代謝紊亂，穩(wěn)定細(xì)胞膜，減少血管緊張素的滲透，改善缺血患者的微循環(huán)，對(duì)缺血損傷也有很好的保護(hù)作用[12]。還有研究認(rèn)為銀杏葉提取物有抗脂質(zhì)過(guò)氧化、清除自由基作用，能夠調(diào)節(jié)機(jī)體血脂含量，使血漿超氧化物歧化酶活性增強(qiáng)[13]。本研究顯示三組造模后1 d的逃避潛伏期對(duì)比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，銀杏組與奧拉西坦組造模后7 d、14 d的逃避潛伏期低于對(duì)照組(P<0.05)，銀杏組低于奧拉西坦組，對(duì)比差異都有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；銀杏組與奧拉西坦組造模后14 d的微血管密度高于對(duì)照組，銀杏組高于奧拉西坦組，對(duì)比差異都有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，表明銀杏葉提取物的應(yīng)用能改善血管性癡呆大鼠的記憶力，提高頸動(dòng)脈微血管密度。相關(guān)研究也顯示中藥提取物的應(yīng)用可以增加大鼠海馬部位K+介導(dǎo)的乙酰膽堿的釋放，增加大鼠的下丘腦神經(jīng)元鈉鉀電流，提升大鼠對(duì)空間的認(rèn)知能力[14]。

炎癥因子的表達(dá)貫穿血管性癡呆大鼠發(fā)生發(fā)展的全過(guò)程，血清IL-1β、IL-6的表達(dá)與癡呆的嚴(yán)重性密切相關(guān)。本研究顯示銀杏組與奧拉西坦組造模后14 d海馬組織的IL-1β、IL-6低于對(duì)照組，銀杏組低于奧拉西坦組，對(duì)比差異都有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，表明銀杏葉提取物的應(yīng)用能抑制海馬組織炎癥因子的釋放。當(dāng)前也有研究顯示銀杏葉提取物能降低不穩(wěn)定型心絞痛患者血清炎癥因子單核細(xì)胞趨化蛋白-1表達(dá)水平[15]；也可使缺血腦組織中TNF-α含量降低，能顯著減少腦缺血再灌注后中性粒細(xì)胞在缺血區(qū)腦組織浸潤(rùn)，減輕腦水腫[16]。

GAT-1屬于高親和力的GABA 轉(zhuǎn)運(yùn)體，在腦組織中的含量比較高。正常情況下，GAT1能夠有效的向細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)GABA，減低突觸間隙GABA含量，從而終止突觸后抑制效應(yīng)，從而保護(hù)神經(jīng)功能[17]。不過(guò)也有研究顯示GAT1也可發(fā)揮其逆轉(zhuǎn)運(yùn)功能，增強(qiáng)突觸后抑制效應(yīng)，導(dǎo)致神經(jīng)功能受損[18]。GABA可保持相關(guān)神經(jīng)元如感覺(jué)神經(jīng)元等活力，修復(fù)中樞和周?chē)窠?jīng)元損傷，增強(qiáng)神經(jīng)元的再生能力。血管性癡呆可引起炎癥系統(tǒng)的激活和氧化應(yīng)激產(chǎn)生，并對(duì)心、腎組織器官產(chǎn)生損傷，從而抑制GAT-1與GABA的表達(dá)。本研究顯示銀杏組與奧拉西坦組造模后14 d海馬組織的GAT1、CREB蛋白相對(duì)表達(dá)水平高于對(duì)照組，銀杏組高于奧拉西坦組，對(duì)比差異都有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，表明銀杏葉提取物的應(yīng)用能提高海馬組織GAT1、CREB蛋白相對(duì)表達(dá)水平。從機(jī)制上分析，銀杏葉提取物為一種天然藥物，成分多樣，有多靶點(diǎn)、多環(huán)節(jié)的防治優(yōu)勢(shì)，也具有拮抗血小板活化因子、改善微循環(huán)等多種作用，從而可改善血管性癡呆大鼠的認(rèn)知損傷和海馬神經(jīng)元損傷[19,20]。本研究也有一定的不足，因銀杏葉提取物是混合物，其藥理機(jī)制分析還比較困難，且本研究沒(méi)有設(shè)置空白對(duì)照，可能存在研究偏倚，將在后續(xù)研究中深入分析。

總之，銀杏葉提取物在血管性癡呆大鼠中的應(yīng)用可促進(jìn)海馬組織GAT1、CREB表達(dá)，提高頸動(dòng)脈微血管密度，抑制炎癥因子的釋放，從而改善大鼠記憶力。

作者簡(jiǎn)介：徐睿(1994-)，男，吉林長(zhǎng)春人，碩士研究生，主要從事腦血管疾病的研究；王雪鵬(1978-)，男，吉林吉林人，副主任醫(yī)師，醫(yī)學(xué)博士，碩士研究生導(dǎo)師，主要從事腦血管病、腦腫瘤的診斷與治療。