高效氯氰菊酯降解菌米曲霉SSCL-3的分離篩選及降解能力研究

陳 銳，門 欣，瞿 佳，鄧 媛，趙玲俠，孫曉宇，沈衛(wèi)榮

(1.陜西省微生物研究所微生物資源研究中心,陜西 西安 710043；2.陜西省科學院秦嶺天然產物工程中心,陜西 西安 710043)

【研究意義】菊酯是一種被廣泛使用的殺蟲劑，主要應用于家庭、農業(yè)、及環(huán)境等區(qū)域內蚊、蠅、蚜蟲、鱗翅目害蟲等的毒殺。菊酯分為天然除蟲菊素及擬除蟲菊酯類，擬除蟲菊酯為天然除蟲菊素的衍生物，目前共有30余種。高效氯氰菊酯是氯氰菊酯的一個異構體，因其生產成本低、藥效高以及對哺乳類動物毒性低等特點，在我國廣泛使用。菊酯類農藥有觸殺作用，通過作用于神經突觸和神經纖維，擾亂昆蟲電位性鈉離子通道使之過度興奮、運動失調繼而麻痹死亡[1]。過去普遍認為菊酯屬低毒殺蟲劑，對環(huán)境友好，但目前許多研究表明菊酯對斑馬魚、蜜蜂、水藻等有較高毒性[2-4]，導致脊椎動物內分泌紊亂[5]，干擾免疫系統(tǒng)[6]，具遺傳毒性[8]，危及孕婦及胎兒[7]。【本研究切入點】利用微生物降解土壤中殘留的菊酯類農藥是一種經濟的方法，并且該方法不產生二次污染[9]。微生物可將復雜有機分子最終分解成為H2O和CO2，利用微生物增殖速度快的特點，在短時內快速降低土壤中農藥殘留的水平，使土壤恢復健康狀態(tài)[10]。【前人研究進展】已有研究表明細菌[11]、真菌[12]均具有效降解菊酯類農藥的潛能。但目前均處于實驗室研究階段，尚未發(fā)現適宜應用的生產型菌株?！緮M解決的關鍵問題】本研究從土壤中篩選獲得一株真菌菌株，該菌可利用高效氯氰菊酯作為其碳源，對多種菊酯類農藥均有作用，或能解決土壤中殘留菊酯類農藥的問題。

1.1 材料

1.1.1 樣本 樣本來源于陜西省周至設施棚室、果園及秦嶺田峪植物根際或露地土壤，共收集土壤樣本70余份。

1.1.2 無機鹽培養(yǎng)基 硫酸銨 0.4 g，硝酸銨 1.2 g，磷酸二氫鉀 0.5 g，磷酸氫二鉀1.5 g，硫酸鎂 0.5 g，氯化鈉 0.5 g，酵母提取物0.05 g，pH 7.0，蒸餾水定容至1 L。121 ℃ 滅菌20 min。

1.1.3 產毒培養(yǎng)基(AFPA) 蛋白胨 1 g，酵母粉1 g，檸檬酸鐵0.05 g，四氯醌0.0002 g，瓊脂2 g，加蒸餾水定容至1 L，121 ℃ 滅菌20 min。滅菌后加入1.5 %的氯霉素。

1.2 方法

1.2.1 高效氯氰菊酯降解菌的分離 在100 mL液體無機鹽培養(yǎng)基搖瓶中加入1 mL高效氯氰菊酯(終濃度1 g/L，10 %懸浮劑)混勻。加入土樣5 g，28 ℃ 150 r/min 連續(xù)培養(yǎng)7 d，轉接1 mL 發(fā)酵液至新搖瓶(含高效氯氰菊酯1g/L 100 mL液體無機鹽培養(yǎng)基)，連續(xù)轉接3次。將發(fā)酵液梯度稀釋，取100 μl涂布于含高效氯氰菊酯(1 g/L)的無機鹽固體培養(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng)，待菌落形成。真菌進行PDA平板劃線純化3次，再接種于PDA斜面保藏。

1.2.2 菌株降解能力的初步測定 將真菌孢子接種于PDA液體培養(yǎng)基，28 ℃ 150 r/min搖瓶震蕩發(fā)酵24 h，形成微小的菌絲球懸液。90 mL無機鹽培養(yǎng)液中分別加入終濃度為500 mg/L的高效氯氰菊酯，接入菌絲球懸液10 mL，以無菌培養(yǎng)液作為空白對照，3次重復，28 ℃，150 r/min震蕩培養(yǎng)，第0、12、24小時測定高效氯氰菊酯含量。標準試劑購自沈陽化工研究院(含量大于99.5 %)，方法參照文獻[13]。菌懸液5 mL加石油醚10 mL萃取。振蕩器震蕩1 min，靜置10 min。吸取上層有機相，紫外235 nm測定高效氯氰菊酯濃度。

1.2.3 降解菌的形態(tài)鑒定 梯度稀釋孢子懸液，將適量孢子接種于MA及CYA平板，觀察其生長及菌落形態(tài)。取少量菌絲接種于PDA插片平板，待菌絲長至蓋玻片上后，鏡檢觀察。取少量菌絲接種于PDA插片平板，待菌絲長至蓋玻片上后，鏡檢觀察。

1.2.4 黃曲霉毒素測定 取少量孢子接種于AFPA平板， 28 ℃ 培養(yǎng)，觀察平板背面色澤變化[14]。將菌株在PDA液體培養(yǎng)基中進行發(fā)酵，第 24、48、120、168、240小時各取樣1次，120 ℃滅菌，測定發(fā)酵液中黃曲霉毒素的含量[15]。

1.2.5 降解菌的ITS rDNA序列鑒定 取搖瓶菌絲球2 mL，離心取菌體，液氮研磨法提取菌株的基因組(TIANGEN DP305)。PCR擴增ITS序列，引物采用ITS1及ITS4序列，測序(奧科)。測序結果在GenBank數據庫中進行比對，用系統(tǒng)發(fā)育樹軟件Clustal X及MEGA 4構建分類系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.6 降解菌的生長特性 搖瓶生長曲線：轉接孢子斜面至平板劃線3次活化菌株，培養(yǎng)120 h待生成孢子。將孢子重懸至生理鹽水，梯度稀釋至10-5，接1 mL孢子懸液入PDA液體搖瓶中， 28 ℃，150 r/min培養(yǎng)，每12 h取樣1次，測至96 h，設3個重復。將100 mL菌體過濾至定量濾紙，70 ℃ 烘干恒重，稱重計算菌絲生長情況。產孢量測定：以麩皮 50 g，稻殼5 g，水40 mL，豆粕0.1 g∶葡萄糖1 g∶植物油0.5 mL的比例配制固體培養(yǎng)基，107 ℃，滅菌 2 h。取搖瓶菌絲球懸液接種固體發(fā)酵，接種量5 %，28 ℃ 240 h靜置培養(yǎng)，待孢子充分形成。取培養(yǎng)發(fā)酵固體物1 g，放入49 mL 0.5 %的吐溫-80生理鹽水液中(加玻璃珠)，震蕩混勻，梯度稀釋，涂布于PDA平板，28 ℃，培養(yǎng)48 h，菌落形成計數，計算產孢量。

1.2.7 HPLC法對高效氯氰菊酯殘留量測定 準確稱取 0.0500 g 高效氯氰菊酯標準品，乙腈溶解，定容至10 mL容量瓶，終濃度5000 mg/L，梯度稀釋，HPLC測定，制作標準曲線。

高效氯氰菊酯乳油500 μl加入90 mL無機鹽培養(yǎng)基中(終濃度為500 mg/L)，接入菌絲球懸液 10 mL，28 ℃、150 r/min震蕩培養(yǎng)。0、12 、24 h分別取樣測定高效氯氰菊酯含量。在50 mL發(fā)酵液中加入等量石油醚，震蕩萃取1.5 h，轉入分液漏斗，取下層有機相，上層水相轉入三角瓶，萃取3次。合并有機相，加入無水硫酸鈉去除水份，再轉入250 mL燒瓶，56 ℃負壓旋轉蒸干。分3次加入石油醚溶解，定容至20 mL，待HPLC測定[16]。HPLC檢測：色譜柱依利特C18柱，粒徑5 μm，流動相：水+乙腈(80:20)，流速：1 mL/min，檢測波長：235 nm，進樣量：10 μl，柱溫：35 ℃。

1.2.8 降解菌株對其他菊酯類農藥耐藥能力測定 在50 mL無機鹽培養(yǎng)基中分別加入不同濃度的氯菊酯(25 %粉劑)、溴氰菊酯(2.5 %粉劑)、氯氟氰菊酯(10 %粉劑)、氰戊菊酯(20 %乳油)、聯苯菊酯(5 %乳油)(終濃度為50、100、150、200、250 mL/L)的，接入菌絲球懸液5 mL，28 ℃、150 r/min 培養(yǎng)48 h，觀察菌株的生長耐受情況。

1.2.9 菌劑制備及土壤室內試驗驗證 將固體發(fā)酵物平攤在臺面，自然條件下晾干。按照 固體發(fā)酵物∶葡萄糖∶麩皮∶高嶺土=2∶1∶4∶3，攪拌混合均勻，作為出發(fā)菌劑。在室內進行初步土壤降解試驗，土壤盒尺寸為45 cm×30 cm× 20 cm，土壤為無菌營養(yǎng)土，重量約4 kg。首先在土壤中人工添加高效氯氰菊酯，使高效氯氰菊酯含量達到400 mg/kg，再加入菌劑40 g攪拌均勻，保持室內溫度20～34 ℃，定期輕翻土壤、噴施補充水份，保持土壤濕度40 %～60 %，一個月之后測定土壤高效氯氰菊酯殘留量。

2 結果與分析

2.1 高效氯氰菊酯降解菌的分離

從土壤中分離獲得1株在1 g/L高效氯氰菊酯平板上正常生長的微生物菌株，形態(tài)觀察為真菌。該菌不可在單純無機鹽平板上生長，可以認為該菌以高效氯氰菊酯作為其唯一碳源，是化能異養(yǎng)型菌株，將該菌命名為SSCL-3。

2.2 SSCL-3降解能力初步測定

第0、12及24小時取發(fā)酵液，石油醚震蕩萃取，取有機相，紫外分光光度計235 nm測定吸光度。與空白對照相比，SSCL-3顯著降低了高效氯氰菊酯在發(fā)酵液中的含量，12 h發(fā)酵液中殘留量為70 %，空白對照為99 %。24 h時殘留量為27 %，空白對照為89 %，具有顯著差異(圖1，P<0.01)，SSCL-3可有效降解高效氯氰菊酯。根據標準曲線的適用范圍來看，當發(fā)酵液中高效氯氰菊酯含量低于100 mg/L時，殘留量計算值不可取信，因此，為了準確確定發(fā)酵后SSCL-3的降解率，需進行HPLC測定。

表1 發(fā)酵第0、12 及24 小時發(fā)酵液中高效氯氰菊酯殘留濃度Table 1 β-Cypermethrin residual quantity in fermentation at 0 hour 12 hour and 24 hour

圖1 高效氯氰菊酯殘留率Fig.1 β-Cypermethrin residual rate in fermentation at 0 hour 12 hour and 24 hour

2.3 降解菌SSCL-3形態(tài)鑒定

高效氯氰菊酯降解菌SSCL-3在MA平板上生長緩慢，在CYA平板上生長快，絨狀，菌絲松散，背面無色。具有濃密孢子，起初黃綠色，后期褐色。PDA插片鏡檢觀察其分生孢子囊泡膨大形成球形，頂端放射狀生出小梗，分生孢子圓形。顯示該菌為曲霉(Aspergillussp.)[17](圖2)。形態(tài)接近黃曲霉與米曲霉，需要對其進行進一步鑒定。

圖2 SSCL-3菌株形態(tài)鑒定Fig.2 Morphological identification of strain SSCL-3

2.4 黃曲霉毒素測定

在產毒培養(yǎng)基AFPA上接種培養(yǎng)，該菌背面未產生亮黃色物質，培養(yǎng)基呈初始淡黃色(圖3)。黃曲霉毒素測定顯示該菌發(fā)酵至72 h仍不產生黃曲霉毒素。

圖3 菌株SSCL-3在AFPA培養(yǎng)基上的特征Fig.3 The characteristic on AFPA of strain SSCL-3

2.5 降解菌SSCL-3的ITS序列鑒定

將降解菌ITS 1～4之間序列基因擴增測序，經GenBank數據庫比對，與米曲霉及黃曲霉其同源性可達99.79 %。選取CBS、ATCC、NRRL等庫藏曲霉屬菌株核酸序列作為參考，用系統(tǒng)發(fā)育樹軟件Clustal X及MEGA4構建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖4)。系統(tǒng)發(fā)育樹顯示該菌為曲霉屬(Aspergillussp.)。ITS鑒定顯示接近米曲霉與黃曲霉，產毒試驗證明該菌不產黃曲霉毒素，因此可以鑒定該菌為米曲霉(Aspergillusoryzae)。將該序列提交基因bank，登錄號為： MK 163533。

圖4 SSCL-3與模式菌株建樹Fig.4 Phylogenetic tree of strain SSCL-3

2.6 降解菌SSCL-3的生長特性

該菌以孢子懸液接種，28 ℃，150 r/min培養(yǎng)，于48 h進入對數生長期，大約在60 h進入平臺期，平臺期可一直維持至72 h(圖5)。在固體發(fā)酵過程中，適當的稻殼有利于通氣，易于菌絲深入培養(yǎng)基，大量孢子一般形成于第7天，形成大約 3×1010/g的孢子。

圖5 SSCL-3菌株菌絲生長特性Fig.5 Mycelial growth characteristics of strain SSCL-3

2.7 米曲霉SSCL-3對高效氯氰菊酯的降解率測定

不同濃度標準品經HPLC測定，繪制標準曲線Y=617.54x+2032.1 (R2=0.9999)，曲線適用范圍為5～1000 mg/L。經石油醚萃取，HPLC法測定，搖瓶發(fā)酵24 h后測定高效氯氰菊酯殘留量(圖6)。12 h后高效氯氰菊酯在SSCL-3發(fā)酵液中殘留量為 74.6 %，與無菌對照具極顯著差異(P<0.05)。24 h后，SSCL-3發(fā)酵液中殘留量為11.1 %，空白對照的殘留量為 85.4 %，具有極顯著差異(P<0.01)?？梢哉J為米曲霉在無機鹽培養(yǎng)基中將高效氯氰菊酯作為碳源進行分解利用。

*同列差異達,顯著水平(P<0.05)，**同列差異達極顯著水平(P<0.01)*Values are significantly different at the 0.05 probability level；** values are significantly different at the 0.01 probability level

2.8 米曲霉SSCL-3對其他菊酯類農藥耐受測定

對某一種菊酯農藥有降解能力的微生物對其他菊酯類農藥也具有一定的降解能力[18]，為了驗證米曲霉SSCL-3對其他菊酯類家族的耐受能力，制備了其他5種菊酯類農藥：氯菊酯、溴氰菊酯、氯氟氰菊酯、氰戊菊酯、聯苯菊酯。將不同濃度的菊酯農藥加入無機鹽培養(yǎng)基，通過觀察菌絲球在其中生長是否受到抑制或增殖判斷米曲霉SSCL-3是否能耐受該濃度的菊酯類農藥。米曲霉SSCL-3具有廣泛的菊酯類農藥的耐受能力，并且可能具有降解其他菊酯類農藥的潛能(表2)，降解能力待進一步檢測驗證。

表2 米曲霉SSCL-3對其他菊酯類農藥的耐受

2.9 菌劑制備及土壤室內試驗

SSCL-3固體發(fā)酵后期形成大量褐色孢子，干燥后與麩皮、葡萄糖、高嶺土復配后形成棕色菌劑。土壤室內實驗中依照土壤重量的百分之一施用菌劑，保持室內溫度20～34 ℃，保持土壤相當的濕度及松散度定期進行補水及翻動，可以在土壤盒內觀察到白色菌絲迅速布滿土壤表面的過程。經石油醚萃取，HPLC法測定，土壤中400 mg/L的高效氯氰菊酯被降解至222.8 mg/L，降解率達45.60 % (表3)。延長測定時間或降低土壤中受測高效氯氰菊酯的原始含量有利于菌劑對高效氯氰菊酯的降解。

表3 土壤室內試驗高效氯氰菊酯殘留量及降解率Table 3 β-Cypermethrin residual quantity and degradation rate in soil at lab

3 討 論

農業(yè)生產過程中使用農藥可有效控制作物蟲害，提高作物產量，促進經濟發(fā)展。然而不當使用農藥亦引起了一些新問題[19]。殘留于土壤中的農藥一部分發(fā)生降解轉化，其余則通過各種途徑進入環(huán)境，或累積于土壤或揮發(fā)進入大氣或進入地表、地下水或被植物吸收[20-21]。農藥殘留物引起了生態(tài)改變，造成脊椎動物發(fā)育和生殖畸形或慢性細胞毒性等問題[22]。研究表明氯氰菊酯在土壤中的消解動態(tài)均符合一級動力學方程，原始沉積量與施藥量、施藥次數密切相關[23]。

微生物法降解土壤殘留農藥對于恢復生態(tài)環(huán)境、降低脊椎動物風險具有重要意義[24-25]。目前發(fā)現對菊酯類農藥具有降解能力的微生物有很多，Tallur等[26]報道微球菌屬(Micrococcussp.)菌株CPN-1可將1000 mg/L的氯氰菊酯在8 d內降解90 %。趙浩宇等[27]報道小鏈小桿菌屬(Catellibacteriumsp.)菌株CC-5可將500 mg/L的氯氰菊酯在7 d內降解56 %。在室內土壤實驗中據Akbar.等[28-29]報道氯氰菊酯(200 mg/L)在42 d內可被醋酸鈣不動桿菌(Acinetobactercalcoaceticus)菌株MCm531、鞘氨醇菌屬(Sphingomonassp.)菌株RCm6、副短短芽孢桿菌(Brevibacillusparabrevis)菌株FCm9、巨大芽孢桿菌(Bacillusmegaterium)菌株JCm2、紅球菌屬(Rhodococcussp.)菌株JCm5或人蒼白桿菌(Ochrobactrumanthropic)菌株JCm1降解90 %以上。陳少華等[30]報道在田間試驗中金色鏈霉菌(Streptomycesaureus)菌株HP-S-01可將氯氰菊酯(50 mg/L)降低81.1 %。Tallur、趙浩宇及陳少華等[26-27,30-31]均研究了氯氰菊酯在細菌(微球菌、芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、鏈球菌、地衣芽孢桿菌和鞘氨醇單胞菌)中的降解途徑。細菌主要通過羧酸酯酶的酯鍵水解作用產生羧酸和醇。經過羧酸酯酶的作用可將氯氰菊酯水解，3-苯氧基苯甲酸是氯氰菊酯細菌降解的主要代謝產物之一。而3-苯氧基苯甲酸屬雌激素類物質，具有相當的生殖毒性[32]。在本研究中除米曲霉SSCL-3以外也發(fā)現無色桿菌(Achromobactersp.)、惡臭假單胞菌(Pseudomonasputida)、貝萊斯芽孢桿菌(Bacillusvelezensis)、噬線沙雷氏菌(Serratianematodiphila)等菌株，對氯氰菊酯具有一定的降解性能。但部分菌株具有條件致病性如蒼白桿菌(Ochrobactrumanthropi)[33]、克雷伯氏菌屬(Klebsiellasp.)[34]等，部分不形成孢子的細菌例如鞘氨醇桿菌(Sphingobacteriumsp.)[35]、韓國假單胞菌(Pseudomonaskoreensis)[36]等，不利于應用型研究的開展。目前有關真菌降解菊酯類農藥的研究報道不多，但真菌可產生大量孢子有利于生產制備及其在土壤環(huán)境中定殖。本研究獲得的米曲霉經驗證不產生黃曲霉毒素，是較為合適的應用型菌株。其代謝途徑及盆栽、田間試驗需進一步進行研究。

4 結 論

本研究篩選獲得一株可分解利用高效氯氰菊酯的微生物菌株SSCL-3，該菌株可在含1000 mg/L的高效氯氰菊酯無機鹽培養(yǎng)基中正常生長。經鑒定確定該菌為米曲霉(Aspergillusoryzae)，不產生黃曲霉毒素。經紫外分光光度法及HPLC證實，在含高效氯氰菊酯500 mg/L無機鹽液體培養(yǎng)基中，28 ℃、150 r/min搖瓶培養(yǎng)24 h，高效氯氰菊酯的降解率為88.9 %。米曲霉SSCL-3可在其他多種菊酯類農藥中正常生長。土壤室內試驗證明：土壤水分含量保持40 %～60 %，室內溫度20～34 ℃、30 d條件內，米曲霉SSCL-3可將土壤中400 mg/L的高效氯氰菊酯降解45.6 %，顯示該菌具有解決土壤殘留高效氯氰菊酯問題的潛能。