靶向沉默ANXA3對大鼠嗎啡鎮(zhèn)痛耐受及炎癥反應(yīng)的影響

梁冰，方潔

河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院麻醉科，鄭州 450000

嗎啡對各種急慢性疼痛及癌癥疼痛具有顯著的鎮(zhèn)痛效果，已被廣泛應(yīng)用于臨床。但長期反復(fù)使用嗎啡會導(dǎo)致嗎啡鎮(zhèn)痛效能降低，產(chǎn)生嗎啡耐受現(xiàn)象，而且可能伴隨痛覺過敏以及觸發(fā)疼痛等多種并發(fā)癥。此外，研究發(fā)現(xiàn)，嗎啡可激活背根神經(jīng)節(jié)和脊髓中膠質(zhì)細(xì)胞，釋放趨化因子及炎性因子，導(dǎo)致其鎮(zhèn)痛效能降低[1-2]，極大地限制了嗎啡在臨床上的應(yīng)用。因此，深入研究嗎啡鎮(zhèn)痛耐受的分子機(jī)制，尋找能降低嗎啡鎮(zhèn)痛耐受的藥物或者分子，對于改善嗎啡鎮(zhèn)痛耐受具有重要意義。

ANXA3是Annexins家族成員之一，在細(xì)胞發(fā)育及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中具有重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，ANXA3在活化的小膠質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)升高，且在切斷軸突后的舌下神經(jīng)核中表達(dá)上調(diào)[3]。有研究發(fā)現(xiàn)，ANXA3在慢性壓迫損傷誘導(dǎo)的神經(jīng)疼痛模型中表達(dá)明顯升高，抑制ANXA3能緩解大鼠熱痛覺過敏[4]，而過表達(dá)ANXA3可促進(jìn)神經(jīng)元細(xì)胞死亡[5]。以上研究結(jié)果均提示ANXA3在神經(jīng)系統(tǒng)中發(fā)揮重要作用，但其對嗎啡鎮(zhèn)痛耐受的作用尚未見報道。本研究通過鞘內(nèi)注射ANXA3 siRNA，觀察ANXA3對嗎啡鎮(zhèn)痛效能、脊髓腰膨大內(nèi)炎性因子產(chǎn)生、細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶(external signal regulated kinase，ERK)和c-Jun氨基端激酶(c-Jun N-terminal kinase，JNK)磷酸化的影響，探討了ANXA3對嗎啡鎮(zhèn)痛耐受的作用及可能的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物及材料 30只SPF級雄性SD大鼠購自河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院動物室，體重200～225 g。熱痛覺測試儀(Life Sciences公司，美國)；鹽酸嗎啡(沈陽第一制藥廠)；腫瘤壞死因子α(TNF-α)、白細(xì)胞介素(IL)-1β和IL-6酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)試劑盒(R&D公司，美國)；RNA提取試劑Trizol(Invitrogen公司，美國)；PrimeScriptTMRT reagent Kit反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa，日本)；SYBR熒光PCR試劑(Qiagen公司，德國)；磷酸化ERK(p-ERK)和磷酸化JNK(p-JNK)抗體(CST公司，美國)；GAPDH和β-actin(Abcam公司，美國)；辣根過氧化酶標(biāo)記的二抗(北京中杉金橋公司)。本實(shí)驗(yàn)過程符合單位及國家有關(guān)實(shí)驗(yàn)動物管理和使用規(guī)定。

1.2 方法

1.2.1 鞘內(nèi)置管術(shù) 參照Yaksh等[6]的方法對所有大鼠進(jìn)行鞘內(nèi)置管手術(shù)。SD大鼠按照60 mg/kg的劑量經(jīng)腹腔注射2%戊巴比妥鈉麻醉后，鈍性分離L5-6棘突兩側(cè)的肌肉，暴露L5-6椎間隙。將已經(jīng)消毒并充滿生理鹽水的PE10導(dǎo)管輕柔地向上置入，深度2.0～2.5 cm。將導(dǎo)管縫扎固定在皮下筋膜上，經(jīng)皮下隧道自頸部引出，露出2 cm固定于頸部，整個過程中需注意防止導(dǎo)管折疊。采用生理鹽水沖洗導(dǎo)管，熱熔封口。術(shù)后依次縫合傷口。24 h后，將20 μl的2%利多卡因緩慢注射到大鼠體內(nèi)，10 s后，大鼠的左右后肢不能抬高，針刺無退縮反射，10 min后左右肢體運(yùn)動恢復(fù)正常，說明導(dǎo)管放置正確。術(shù)后所有大鼠均單籠飼養(yǎng)，5 d后開始實(shí)驗(yàn)。此外，本研究進(jìn)行了預(yù)實(shí)驗(yàn)，證實(shí)連續(xù)7 d鞘內(nèi)注射15 μg鹽酸嗎啡溶液能夠成功制備大鼠嗎啡耐受模型。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)分組 30只大鼠采用隨機(jī)數(shù)字表法分為3組，每組10只。①嗎啡組：鞘內(nèi)注射10 μl DEPC溶劑，30 min后鞘內(nèi)注射10 μl鹽酸嗎啡溶液(生理鹽水配置，濃度為1.5 g/L)；②陰性對照組：鞘內(nèi)注射10 μl生理鹽水，30 min后鞘內(nèi)注射10 μl鹽酸嗎啡溶液；③ANXA3 siRNA組：鞘內(nèi)注射含有10 μg ANXA3 siRNA的溶液10 μl，30 min后鞘內(nèi)注射10 μl鹽酸嗎啡溶液。每天上午8:30給藥，連續(xù)給藥7 d。

1.2.3 足底輻射熱痛覺測試儀測定大鼠熱縮足反射潛伏期(PWL) 將大鼠置于透明測定裝置內(nèi)安靜30 min，大鼠可在裝置內(nèi)自由活動。測試前預(yù)熱熱痛覺測試儀使其紅外光聚焦于3 mm玻璃板高度并預(yù)熱3 min。光源照射在大鼠左足后爪中外1/3交界處時計(jì)時，至大鼠因疼痛將后爪挪開停止計(jì)時并精確到0.01 s，記錄此次大鼠的PWL，單次輻射最長時間為15 s(截止時間)。每只大鼠重復(fù)測量5次，間隔5 min，去掉最大值和最小值，取平均值即為該大鼠的PWL。分別于第1、3、5、7天，在每次給藥前和給藥后30 min測定大鼠的PWL。計(jì)算最大可能鎮(zhèn)痛效應(yīng)百分?jǐn)?shù)(%MPE)%。%MPE=(給藥后PWL－基礎(chǔ)PWL)/(截止時間PWL－基礎(chǔ)PWL)×100%。

1.2.4 標(biāo)本收集 在實(shí)驗(yàn)第7天給藥后1 h，將各組大鼠用戊巴比妥鈉麻醉，在冰上迅速分離并留取脊髓腰膨大，液氮凍存，用于測定炎性因子及相關(guān)蛋白的表達(dá)水平。

1.2.5 RT-PCR測定ANXA3、TNF-α、IL-1β和IL-6 mRNA表達(dá)水平 采用Trizol試劑提取脊髓組織總mRNA，采用酶標(biāo)儀測定A260/A280并計(jì)算mRNA的濃度。按說明書將5 μg的RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。然后用SYBR Green進(jìn)行RT-PCR，每組設(shè)3個復(fù)孔。PCR反應(yīng)條件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 45 s，58 ℃ 45 s，72 ℃45 s，35個循環(huán)；72 ℃ 10 min。以GAPDH為內(nèi)參照，采用2-ΔΔCt法計(jì)算目的基因的相對表達(dá)水平。

1.2.6 Western blotting檢測ANXA3、p-ERK、p-JNK蛋白表達(dá)水平 將脊髓組織置于RIPA裂解液中勻漿，提取組織中的蛋白。4 ℃、12 000 r/min離心25 min收集上清液，采用BCA試劑盒測定各組蛋白濃度。取蛋白(50 μg/孔)進(jìn)行SDS-PAGE電泳，分離蛋白，將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜上。室溫下采用5% BSA封閉1 h，加入抗ANXA3、p-ERK、p-JNK和β-actin抗體，4 ℃過夜孵育，洗膜后加入二抗反應(yīng)1 h。PVDF膜采用發(fā)光試劑ECL顯色，X線膠片曝光。掃描膠片，采用Image J軟件分析各條帶的光密度值。

1.2.7 ELISA檢測TNF-α、IL-1β和IL-6蛋白濃度將脊髓組織經(jīng)勻漿、超聲處理。離心后收集上清液儲存于-80 ℃。按照試劑盒說明書測定TNF-α、IL-1β和IL-6蛋白濃度。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 11.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。數(shù)據(jù)以表示，大鼠%MEP結(jié)果采用重復(fù)測量資料的方差分析，其他指標(biāo)則采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較，方差齊采用LSD檢驗(yàn)，方差不齊則采用Dunnett T3檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠的%MPE水平比較 第1天，各組大鼠%MPE水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。第3、5、7天，陰性對照組與嗎啡組%MPE水平無明顯差異；ANXA3 siRNA組的%MPE水平均高于陰性對照組(P<0.05)。3組%MPE均隨時間延長而逐步降低(P<0.05，表1)。

表1 各組大鼠%MPE水平變化(%，±s，n=10)Tab.1 The change of %MPE level in each group of rats (%, ±s, n=10)

表1 各組大鼠%MPE水平變化(%，±s，n=10)Tab.1 The change of %MPE level in each group of rats (%, ±s, n=10)

與嗎啡組比較，(1)P<0.05；與陰性對照組比較，(2)P<0.05；與第1天比較，(3)P<0.05；與第3天比較，(4)P<0.05；與第5天比較，(5)P<0.05。

組別 第1天 第3天 第5天 第7天 F P嗎啡組 75.56±4.34 70.03±2.96 32.22±4.76(3)(4) 16.12±1.11(3)(4) (5) 1808.658 <0.001陰性對照組 81.06±7.48 71.75±5.98 43.56±2.69(3)(4) 13.81±1.25(3)(4)(5) 242.652 <0.001 ANXA3 siRNA組 80.71±4.86 78.27±8.50(1)(2) 64.37±5.94(1)(2) (3)(4) 39.96±3.27(1)(2)(3)(4)(5) 176.416 <0.001 F 1.174 3.674 656.751 815.445 P 0.332 0.046 <0.001 <0.001

2.2 各組大鼠脊髓組織ANXA3 mRNA和蛋白表達(dá)水平比較 嗎啡組、陰性對照組及ANXA3 siRNA組ANXA3 mRNA相對表達(dá)水平分別為1.01±0.03、1.14±0.08和0.47±0.09，陰性對照組與嗎啡組比較無明顯差異；與陰性對照組比較，ANXA3 siRNA組ANXA3 mRNA表達(dá)水平降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。嗎啡組、陰性對照組及ANXA3 siRNA組ANXA3蛋白相對表達(dá)水平分別為0.99±0.02、1.15±0.21和0.38±0.05，陰性對照組與嗎啡組比較無明顯差異；與陰性對照組比較，ANXA3 siRNA組ANXA3蛋白表達(dá)水平降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖1)。

2.3 各組大鼠脊髓組織TNF-α、IL-1β和IL-6 mRNA相對表達(dá)水平及蛋白濃度比較 與嗎啡組比較，陰性對照組TNF-α、IL-1β及IL-6 mRNA相對表達(dá)水平無明顯差異；與陰性對照組比較，ANXA3 siRNA組TNF-α、IL-1β及IL-6 mRNA相對表達(dá)水平降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。與嗎啡組比較，陰性對照組TNF-α、IL-1β及IL-6蛋白濃度無明顯差異；ANXA3 siRNA組TNF-α、IL-1β及IL-6蛋白濃度較陰性對照組明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，表2)。

圖1 各組大鼠脊髓組織ANXA3蛋白表達(dá)水平Fig.1 The expression levels of ANXA3 protein in each group of rats NC.陰性對照

表2 各組大鼠脊髓組織TNF-α、IL-1β和IL-6的mRNA相對表達(dá)水平及蛋白濃度比較(±s，n=10)Tab.2 The relative expression level and protein concentration of TNF-α, IL-1β and IL-6 in each group (±s, n=10)

表2 各組大鼠脊髓組織TNF-α、IL-1β和IL-6的mRNA相對表達(dá)水平及蛋白濃度比較(±s，n=10)Tab.2 The relative expression level and protein concentration of TNF-α, IL-1β and IL-6 in each group (±s, n=10)

與嗎啡組比較，(1)P<0.05；與陰性對照組比較，(2)P<0.05。

組別 TNF-α IL-1β IL-6 mRNA 蛋白(pg/g) mRNA 蛋白(pg/g) mRNA 蛋白(pg/g)嗎啡組 1.00±0.03 404.97±21.83 1.01±0.04 518.24±47.51 1.01±0.03 850.94±89.84陰性對照組 1.07±0.16 394.93±54.18 1.04±0.11 534.26±49.78 1.10±0.14 794.92±98.32 ANXA3 siRNA組0.52±0.05(1)(2)210.15±19.86(1)(2) 0.49±0.09(1)(2)313.42±42.19(1)(2) 0.43±0.08(1)(2) 434.68±49.15(1)(2)F 18.418 75.536 28.561 89.277 30.360 52.774 P 0.003 <0.001 <0.001 <0.001 0.001 <0.001

2.4 各組大鼠脊髓組織p-ERK、p-JNK蛋白相對表達(dá)水平比較 陰性對照組p-ERK蛋白相對表達(dá)水平(1.07±0.12)與嗎啡組(1.03±0.02)比較無明顯差異；與陰性對照組比較，ANXA3 siRNA組p-ERK蛋白相對表達(dá)水平(0.55±0.04)明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖2A)。陰性對照組p-JNK蛋白相對表達(dá)水平(1.15±0.04)與嗎啡組(0.99±0.03)比較無明顯差異；ANXA3 siRNA組p-JNK蛋白表達(dá)水平(0.68±0.07)明顯低于陰性對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖2B)。

圖2 各組大鼠脊髓組織p-ERK蛋白(A)、p-JNK蛋白(B)的表達(dá)水平Fig.2 The expression level of p-ERK protein (A) and p-JNK protein (B) in each group

3 討 論

嗎啡鎮(zhèn)痛的耐受性使其在臨床上的應(yīng)用受到了明顯限制[7]，因此深入研究嗎啡鎮(zhèn)痛耐受的機(jī)制、提高其鎮(zhèn)痛效能是基礎(chǔ)和臨床研究共同關(guān)注的問題。本研究采用連續(xù)7 d鞘內(nèi)注射嗎啡建立大鼠嗎啡鎮(zhèn)痛耐受動物模型，探討了ANXA3在嗎啡鎮(zhèn)痛耐受中的作用及其可能機(jī)制。

熱痛覺過敏是嗎啡鎮(zhèn)痛耐受的一種并發(fā)癥[8]。前期有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，ANXA3缺失能緩解神經(jīng)疼痛模型大鼠的熱痛覺過敏[4]。本研究采用%MPE值評價嗎啡鎮(zhèn)痛的效能，結(jié)果表明沉默ANXA3(ANXA3 siRNA組)使嗎啡鎮(zhèn)痛耐受性降低，嗎啡鎮(zhèn)痛效能增加，表明ANXA3在嗎啡鎮(zhèn)痛耐受及其并發(fā)癥中均具有重要作用。

炎癥反應(yīng)在嗎啡鎮(zhèn)痛耐受中也發(fā)揮重要作用。有研究發(fā)現(xiàn)，在嗎啡鎮(zhèn)痛耐受模型中，促炎因子TNF-α及IL-1β表達(dá)水平明顯升高[9-10]。采用中和抗體或者酶抑制劑阻斷炎性因子產(chǎn)生能夠有效緩解嗎啡耐藥性[11]。有研究發(fā)現(xiàn)，ANXA3能上調(diào)TNF-α及IL-6表達(dá)，促進(jìn)炎癥反應(yīng)發(fā)生[12]。本研究發(fā)現(xiàn)，沉默ANXA3后TNF-α、IL-1β及IL-6水平明顯降低，說明在嗎啡鎮(zhèn)痛耐受模型中，ANXA3能抑制炎性因子的產(chǎn)生，與上述研究結(jié)果一致。

ERK和JNK信號通路與病理性疼痛密切相關(guān)[13]。研究發(fā)現(xiàn)，大鼠注射嗎啡后，其中樞及周圍神經(jīng)系統(tǒng)中ERK和JNK信號通路顯著激活[14-15]。阻斷ERK信號通路能降低神經(jīng)病理性疼痛的發(fā)生并增強(qiáng)嗎啡的鎮(zhèn)痛效能[16]。抑制JNK信號通路能明顯減弱嗎啡鎮(zhèn)痛耐受[17]。JNK缺失大鼠的嗎啡鎮(zhèn)痛效果及熱痛覺過敏明顯低于野生型大鼠[18]。本研究發(fā)現(xiàn)，沉默ANXA3能抑制ERK及JNK信號通路的激活，其蛋白磷酸化水平(p-ERK、p-JNK)明顯下調(diào)，提示ANXA3可能通過調(diào)控ERK和JNK信號通路參與嗎啡鎮(zhèn)痛耐受性的調(diào)節(jié)。

綜上所述，本研究結(jié)果顯示，嗎啡耐受可誘導(dǎo)ANXA3表達(dá)上調(diào)，沉默ANXA3可降低嗎啡鎮(zhèn)痛耐受并抑制炎性因子的產(chǎn)生。此外，ANXA3缺失抑制ERK及JNK信號通路的激活，提示ANXA3可能通過調(diào)控ERK及JNK信號通路在嗎啡鎮(zhèn)痛耐受的形成中發(fā)揮作用，為其在神經(jīng)性疼痛中的應(yīng)用及防治嗎啡鎮(zhèn)痛耐受的藥物靶點(diǎn)提供了新的理論依據(jù)。