李婧宜，王賽楠，董艷梅

(北京大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院·口腔醫(yī)院，牙體牙髓科 國(guó)家口腔疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心 口腔數(shù)字化醫(yī)療技術(shù)和材料國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室 口腔數(shù)字醫(yī)學(xué)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 北京 100081)

保存活髓是牙髓病首選的治療方法和重要研究方向[1]。牙髓牙本質(zhì)復(fù)合體作為牙齒特有的結(jié)構(gòu)，具有防御機(jī)能，輕度而溫和的炎癥反應(yīng)會(huì)啟動(dòng)牙髓的自我修復(fù)[2]，嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)會(huì)造成不可逆的牙髓損傷，導(dǎo)致牙髓壞死。在牙髓炎癥反應(yīng)過程中，炎癥因子的種類和表達(dá)量影響炎癥的進(jìn)展和轉(zhuǎn)歸[3]。白細(xì)胞介素(interleukin，IL)-1β、IL-2、IL-12、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)介導(dǎo)細(xì)胞免疫特別是巨噬細(xì)胞的吞噬活動(dòng)[4-5]，其大量表達(dá)提示牙髓的不可逆性炎癥[6]；而IL-10、IL-4等因子的上調(diào)對(duì)于炎癥能起到抑制作用，可促進(jìn)牙髓組織的修復(fù)[7]。使用脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)刺激牙髓可以模擬牙髓炎癥反應(yīng)，低濃度的LPS能夠顯著上調(diào)牙髓細(xì)胞炎癥相關(guān)基因IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α的表達(dá)[8-11]。使用LPS誘導(dǎo)動(dòng)物牙髓組織炎癥，組織病理學(xué)切片可觀察到牙髓組織不同程度的炎癥反應(yīng)[12-13]。

非甾體類抗炎藥(non-steroidal anti-inflammatory drugs，NSAIDs)可通過抑制環(huán)氧酶(cyclooxygenase，COX)-1、COX-2抑制前列腺素的合成和血管舒張，進(jìn)而達(dá)到抗炎鎮(zhèn)痛作用[14]。非特異性NSAIDs同時(shí)抑制COX-1和COX-2，代表藥物有阿司匹林、布洛芬，全身用藥時(shí)因其抑制正常組織中的COX-1，對(duì)胃腸道、心血管等有副作用[15]。特異性NSAIDs僅選擇性抑制COX-2，在發(fā)揮抗炎鎮(zhèn)痛作用的同時(shí)，大大降低了胃腸道反應(yīng)，心血管疾病的風(fēng)險(xiǎn)較低，成為臨床上常用抗炎藥物[16-17]，代表藥物有美洛昔康、雙氯芬酸、羅非昔布等。目前NSAIDs對(duì)炎癥牙髓的研究較少，其作用尚不明確，非特異性和特異性NSAIDs的作用效果是否存在差別尚不清楚。因此，本研究將分別選取非特異性NSAIDs阿司匹林和特異性NSAIDs 美洛昔康，觀察二者對(duì)牙髓細(xì)胞增殖、分化、礦化和炎癥因子的影響，目的是研究NSAIDs對(duì)炎癥牙髓的抗炎和修復(fù)作用。

1 材料與方法

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)所用材料包括：高血糖DMEM培養(yǎng)液(Dulbecco’s modified eagle medium，DMEM)、Ⅰ型膠原酶、青霉素-鏈霉素、胰蛋白酶-乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA)、L-谷氨酰胺(Gibco公司，美國(guó))、胎牛血清(fetal bovine se-rum，F(xiàn)BS)(Hyclone公司，美國(guó))。阿司匹林購(gòu)自北京Solarbio生物公司,美洛昔康購(gòu)自北京BioRuler公司，LPS(大腸桿菌)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。

1.2 人牙髓細(xì)胞的培養(yǎng)

收集無齲、完整的人類第三磨牙(18～25歲)，進(jìn)行人牙髓細(xì)胞(human dental pulp cells，hDPCs)的培養(yǎng)。參照Gronthos等[18]采用的取材方法，將拔除牙齒立即置于DMEM培養(yǎng)液內(nèi)，3 h內(nèi)完成牙髓取材和原代細(xì)胞培養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)研究方案通過北京大學(xué)口腔醫(yī)院生物醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審查。

待hDPCs生長(zhǎng)融合達(dá)80%左右時(shí)，PBS溶液輕柔漂洗3次，加入2.5 g/L 胰蛋白酶-EDTA消化液，37 ℃消化30～60 s；在倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞突起收縮、細(xì)胞呈亮圓形，加入含有血清的培養(yǎng)液終止消化。收集細(xì)胞懸液，1 000 r/min 離心5 min，棄上清；加入新鮮DMEM培養(yǎng)液，按照1 ∶3比例接種傳代。取4～6代hDPCs用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 MTT檢測(cè)hDPCs的增殖

分別使用含有不同濃度(1、10、100 μmol/L)的阿司匹林或美洛昔康的培養(yǎng)基培養(yǎng)hDPCs，采用 MTT法檢測(cè)hDPCs的增殖活性。細(xì)胞按密度3×103個(gè)/孔等量接種于96孔板中，每組5個(gè)復(fù)孔，37 ℃、5%(體積分?jǐn)?shù))CO2細(xì)胞孵育箱培養(yǎng)，隔天換液。第 1、3、5、7天，每孔加入180 μL新鮮DMEM培養(yǎng)液、20 μL 5 g/L MTT溶液，培養(yǎng)4 h后，每孔加入150 μL二甲基亞砜，置 37 ℃搖床上振蕩10 min至結(jié)晶物充分溶解，酶標(biāo)儀以波長(zhǎng)490 nm測(cè)定光密度值(D)。

1.4 Real-time PCR檢測(cè)hDPCs炎癥基因和成牙分化基因的表達(dá)

采用real-time PCR法檢測(cè)炎癥基因TNF-α、IL-6和成牙分化基因牙本質(zhì)基質(zhì)蛋白(dentin matrix protein-1，DMP-1)、牙本質(zhì)涎磷蛋白(dentin sialophosphoprotein，DSPP)表達(dá)的情況。將hDPCs分別按密度1×106個(gè)/孔、1×105個(gè)/孔接種于6孔板中，37 ℃、5%CO2細(xì)胞孵育箱中孵育。用含有1 mg/L LPS的培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h后獲得LPS刺激后的hDPCs(LPS-hDPCs)，用含有不同濃度(1、10、100 μmol/L)NSAIDs(阿司匹林或美洛昔康)的培養(yǎng)基培養(yǎng)LPS-hDPCs，在6 h和7 d用Trizol裂解細(xì)胞，提取總RNA。使用Prime Script RT Master Mix反轉(zhuǎn)錄試劑盒，各組均用500 ng總RNA在10 μL反應(yīng)體系中進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。目的基因?yàn)門NF-α、IL-6和DMP-1、DSPP，將管家基因GAPDH作為內(nèi)參，引物序列見表1。Real-time PCR為每管20 μL的擴(kuò)增反應(yīng)體系，95 ℃ 3 min預(yù)變性同時(shí)激活DNA聚合物，95℃變性3 s，60 ℃退火及延伸20 s，共40個(gè)循環(huán)。每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

表1 引物序列表Table 1 PCR primer sequences

DMP-1, dentin matrix protein-1;DSPP, dentin sialophosphoprotein;IL-6, interleukin-6;TNF-α, tumor necrosis factor-α;GAPDH, glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase.

1.5 茜素紅染色檢測(cè)礦化結(jié)節(jié)

礦化誘導(dǎo)液(osteogenic-induced medium，OM)的配制： 2.16 g β-甘油磷酸鈉粉末溶于10 mL磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer solution，PBS)；100 mg維生素C溶于10 mL PBS；3.92 mg地塞米松粉末溶于1 mL無水乙醇，完全溶解后加入9 mL PBS中。各組分溶液分別使用0.22 μmol/L孔徑針頭過濾器過濾除菌，分裝，-20 ℃保存；使用時(shí)每100 mL培養(yǎng)基分別加入1 mL、1 mL和200 μL。

將hDPCs以1×105的密度接種于12孔板中，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，至于37 ℃、5% CO2的孵育箱中孵育過夜，待細(xì)胞貼壁。待細(xì)胞匯合至80%～90%時(shí)，分別加入含有1 mg/L LPS和NSAIDs的礦化誘導(dǎo)液，14 d后進(jìn)行體外礦化檢測(cè)。吸凈待測(cè)孔中培養(yǎng)基，PBS沖洗3次，20 g/L 多聚甲醛固定過夜，Milli-Q水沖洗3次，室溫下加入等量40 mmol/L pH 4.2的茜素紅溶液染色10～20 min，去離子水沖洗去除特異性染色。倒置顯微鏡下觀察、拍照。

將茜素紅染色后的孔板徹底晾干，加入1 mL 100 mmol/L氯化十六烷基吡啶溶液，室溫下?lián)u床輕搖，徹底溶解孔板底染色。各孔分別吸取150 μL紫色溶液轉(zhuǎn)移至96孔板中。酶標(biāo)儀內(nèi)測(cè)定562 nm波長(zhǎng)下各孔光密度值并進(jìn)行記錄。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 24.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。采用單因素方差(ANOVA)分析分別對(duì)各組細(xì)胞的增殖情況、基因表達(dá)情況、礦化結(jié)節(jié)情況進(jìn)行總體分析，多重比較采用Bonferroni檢驗(yàn)，如果數(shù)據(jù)方差不齊則采用秩和檢驗(yàn)(Kruskal-WallisHtest)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 NSAIDs促進(jìn)hDPCs增殖

通過MTT法檢測(cè)1、10、100 μmol/L阿司匹林或美洛昔康培養(yǎng)hDPCs后不同時(shí)間點(diǎn)的活細(xì)胞數(shù)量，結(jié)果顯示，從第5天起1～100 μmol/L阿司匹林和美洛昔康對(duì)細(xì)胞增殖均具有顯著促進(jìn)作用，該促進(jìn)作用具有濃度依賴性，隨濃度升高促進(jìn)作用減弱。經(jīng)單因素ANOVA分析，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖1)。

2.2 NSAIDs抑制LPS-hDPCs IL-6、TNF-α表達(dá)

使用real-time PCR檢測(cè)LPS-hDPCs炎癥基因IL-6、TNF-α表達(dá)，結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，LPS組使用LPS刺激牙髓細(xì)胞后6 h，IL-6、TNF-α表達(dá)量顯著升高(圖2)；與LPS組相比，阿司匹林1～100 μmol/L和美洛昔康1～100 μmol/L組TNF-α表達(dá)量均顯著下降，阿司匹林各組間TNF-α表達(dá)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，美洛昔康各組間TNF-α表達(dá)量差異亦無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，圖2A)，阿司匹林100 μmol/L和美洛昔康1～100 μmol/L組IL-6表達(dá)量顯著下降(圖2B)。與阿司匹林100 μmol/L組相比，美洛昔康100 μmol/L組6 h時(shí)IL-6和TNF-α表達(dá)量顯著下降,經(jīng)單因素ANOVA分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。選擇美洛昔康100 μmol/L組進(jìn)行后續(xù)分化及礦化實(shí)驗(yàn)。

2.3 美洛昔康促進(jìn)LPS-hDPCs成牙本質(zhì)向分化

使用real-time PCR檢測(cè)LPS-hDPCs成牙本質(zhì)向分化基因DMP-1、DSPP表達(dá)，結(jié)果顯示，美洛昔康組在7 d時(shí)DMP-1、DSPP表達(dá)量顯著高于對(duì)照組和LPS組，經(jīng)單因素ANOVA分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖3)。

2.4 美洛昔康促進(jìn)LPS-hDPCs礦化

使用茜素紅染色檢測(cè)LPS-hDPCs礦化，結(jié)果顯示，2周時(shí)陰性對(duì)照組鏡下無可見紅染礦化結(jié)節(jié)(圖4A)， 2周時(shí)陽性對(duì)照組鏡下可見少量散在紅染礦化結(jié)節(jié)(圖4B)，LPS組僅可見單個(gè)散在紅染礦化結(jié)節(jié)(圖4C)，LPS+美洛昔康組可見散在紅染礦化結(jié)節(jié)(圖4D)。

通過氯化十六烷基吡啶充分溶解染色的礦化結(jié)節(jié)后半定量檢測(cè)所示(圖4E)，LPS組鈣含量明顯低于對(duì)照組，LPS+美洛昔康組鈣含量顯著高于LPS組，經(jīng)單因素ANOVA分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，說明LPS會(huì)抑制hDPCs的礦化，美洛昔康能夠促進(jìn)LPS-hDPCs的礦化。

3 討論

抗炎藥物的種類和濃度影響其生物安全性。本研究首先對(duì)不同濃度阿司匹林或美洛昔康對(duì)hDPCs增殖活性進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)阿司匹林或美洛昔康在1～100 μmol/L的濃度時(shí)能夠促進(jìn)細(xì)胞增殖，濃度越高促進(jìn)增殖效果越弱。有研究顯示，低濃度阿司匹林對(duì)于骨髓間充質(zhì)細(xì)胞具有促增殖作用。當(dāng)阿司匹林濃度大于5 mmol/L時(shí)，會(huì)抑制牙髓細(xì)胞的增殖[19]。酪洛芬在低濃度時(shí)對(duì)牙髓細(xì)胞增殖無抑制作用[20]。對(duì)比幾種NSAIDs(美洛昔康、帕瑞昔布、洛諾昔康、雙氯芬酸和撲熱息痛)對(duì)脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的影響發(fā)現(xiàn)，低濃度時(shí)(10-6μmol/L)對(duì)細(xì)胞沒有抑制作用，且特異性NSIADs(美洛昔康、帕瑞昔布)有促進(jìn)細(xì)胞增殖作用[21]。另外，有學(xué)者研究NSAIDs對(duì)馬骨間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖作用，也觀察到了藥物作用的濃度依賴性[22]。美洛昔康口服劑量為7.5 mg/d和15 mg/d時(shí)，血液藥物濃度波動(dòng)范圍分別為0.4～1.0 mg/L和0.8～2.0 mg/L(分別為穩(wěn)態(tài)時(shí)的最小和最大血藥濃度)[17]。本研究選擇既往研究中NSAID相對(duì)安全且有效的藥物濃度，證實(shí)1～100 μmol/L的阿司匹林或美洛昔康對(duì)hDPCs的增殖具有較好地促進(jìn)作用。

在炎癥過程中，一些炎癥因子表達(dá)的短時(shí)間輕度升高，對(duì)細(xì)胞分化或組織修復(fù)具有一定的促進(jìn)作用[23]，而反復(fù)或高濃度的炎癥因子刺激會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞的衰老和凋亡。有研究顯示，在感染、創(chuàng)傷以及腫瘤形成過程中，IL-6、TNF-α的表達(dá)都有升高，多種細(xì)胞(如巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、纖維細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞)都可以分泌合成IL-6細(xì)胞因子，TNF-α、IL-6隨著牙髓組織炎癥的加重而表達(dá)上升[24-25]。本研究發(fā)現(xiàn)，阿司匹林或美洛昔康可以顯著下調(diào)LPS刺激的hDPCs表達(dá)的炎癥基因IL-6、TNF-α，且美洛昔康效果更佳。COX-1在正常組織和細(xì)胞中就有表達(dá)，較少受到調(diào)控，而COX-2主要在炎癥組織中表達(dá)。有研究顯示，COX-2主要在牙髓中的炎癥部位高表達(dá)，相比于其他部位由巨噬細(xì)胞表達(dá)COX-2，牙髓中的COX-2更多由成纖維細(xì)胞表達(dá)，而在健康牙髓中極少發(fā)現(xiàn)[26-27]。更有研究發(fā)現(xiàn)，IL-1β和TNF-α可以有效上調(diào)COX-2表達(dá)[28-29]，COX-2可能是介導(dǎo)微生物引起牙髓炎癥的重要因子[5]。美洛昔康可選擇性抑制COX-2，可能是其抑制牙髓炎癥效果更佳的原因。

除抗炎作用外，NSAIDs對(duì)成牙或成骨修復(fù)等方面也有一定的作用。相關(guān)研究顯示，非特異性NSAID阿司匹林可以有效提高堿性磷酸酶的活性，上調(diào)成骨相關(guān)基因，促進(jìn)牙髓干細(xì)胞向成骨方向分化。高濃度的阿司匹林(5 mmol/L)通過抑制MARK的p38、JNK信號(hào)通路而抑制牙髓干細(xì)胞成牙向分化[19]；低濃度的阿司匹林(75 mg/L)可以促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨向分化[30]。特異性NSAID美洛昔康對(duì)小鼠根尖周骨質(zhì)的形成沒有抑制作用[31-32]。Kirschneck等[33]發(fā)現(xiàn)，美洛昔康可以有效抑制正畸過程中的牙根外吸收，抑制炎癥外吸收中的IL-1、IL-6等基因的表達(dá)。將美洛昔康應(yīng)用于脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞時(shí)，相比于其他的NSAIDs可以有效促進(jìn)細(xì)胞增殖和堿性磷酸酶活性，增強(qiáng)礦物質(zhì)形成[22]。本研究顯示，100 μmol/L美洛昔康可以促進(jìn)LPS刺激后的hDPCs的DSPP、DMP-1表達(dá)。DSPP是牙本質(zhì)中主要的非膠原基質(zhì)蛋白，參與成牙本質(zhì)礦化的成核過程；DMP-1是一種多功能蛋白，可以通過調(diào)控成核過程參與羥基磷灰石的礦化。美洛昔康作為COX抑制劑，可以抑制前列腺素的一個(gè)亞型前列腺素E2(prostaglandin E2，PGE2)的生成，既往研究顯示，PGE2對(duì)牙髓細(xì)胞的作用具有濃度依賴性，高濃度會(huì)抑制細(xì)胞的分化和礦化[34]。美洛昔康可能是通過調(diào)節(jié)PGE2的形成，在抑制牙髓細(xì)胞炎癥反應(yīng)的同時(shí)，促進(jìn)牙髓細(xì)胞的成牙本質(zhì)向分化和礦化，具體機(jī)制還需進(jìn)一步研究。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)美洛昔康能夠促進(jìn)牙髓細(xì)胞增殖，在有效抑制LPS刺激下牙髓細(xì)胞炎癥因子升高的同時(shí)，可促進(jìn)牙髓細(xì)胞的成牙本質(zhì)向分化和礦化。美洛昔康可能在牙髓炎癥中發(fā)揮抗炎和促進(jìn)修復(fù)的作用。有關(guān)美洛昔康對(duì)牙髓損傷修復(fù)的作用效果和機(jī)制仍需進(jìn)一步探究。