貴州省兩棲類新記錄種
——中華湍蛙及其蝌蚪描述

李仕澤， 劉京， 徐寧， 魏剛， 王斌

(1.茅臺(tái)學(xué)院食品科學(xué)與工程系，貴州仁懷564500； 2. 貴陽學(xué)院， 貴州省生物多樣性與應(yīng)用生態(tài)學(xué)特色 重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴陽550005； 3.中國(guó)科學(xué)院成都生物研究所，成都610041)

湍蛙屬AmolopsCope， 1865物種廣泛分布于喜馬拉雅山脈東部和南部，東至中國(guó)大陸東南部，南至馬來半島，目前該屬已報(bào)道59種(Frost，2019)，我國(guó)分布32種，貴州省記錄的湍蛙屬物種3種，即水城湍蛙A.shuichengicusLyu & Wang， 2019、崇安湍蛙A.chunganensis(Pope，1929)和華南湍蛙A.ricketti(Boulenger，1899)。水城湍蛙僅分布在貴州水城(Frost，2019)，崇安湍蛙僅分布在貴州雷山和江口(費(fèi)梁等，2012；魏剛等，2017)，華南湍蛙在貴州大部分地區(qū)均有分布(伍律等，1986)。

2015年7月，在貴州梵凈山國(guó)家級(jí)自然保護(hù)區(qū)(108°35′19″E，27°55′8″N，海拔1 032 m)采集到2號(hào)雄性湍蛙屬標(biāo)本；2018年7月，在貴州雷公山國(guó)家級(jí)自然保護(hù)區(qū)(108°20′24″E，26°20′59″N，海拔686 m)采集到1號(hào)湍蛙屬蝌蚪標(biāo)本，2018年8月，采集到1號(hào)雌性湍蛙屬標(biāo)本。經(jīng)形態(tài)比較和分子系統(tǒng)發(fā)育分析鑒定為中華湍蛙A.sinensisLyu， Wang， and Wang， 2019，為貴州省湍蛙屬新記錄。本研究對(duì)貴州分布的中華湍蛙進(jìn)行了詳細(xì)形態(tài)學(xué)描述，對(duì)該物種的蝌蚪形態(tài)特征進(jìn)行了首次描述，并對(duì)貴州省湍蛙屬物種的分布進(jìn)行了厘定，為該物種的系統(tǒng)學(xué)和譜系地理學(xué)研究提供了新信息。

1 材料與方法

1.1 材料

4號(hào)標(biāo)本取肌肉組織保存于95%的乙醇中(表1)。標(biāo)本浸泡于福爾馬林溶液，保存于中國(guó)科學(xué)院成都生物研究所(CIB)。

1.2 形態(tài)鑒定與測(cè)量

對(duì)3號(hào)成體標(biāo)本及1號(hào)蝌蚪標(biāo)本用游標(biāo)卡尺測(cè)量形態(tài)特征，精確到0.01 mm。蝌蚪分期依據(jù)Gosner(1960)的方法，測(cè)量依據(jù)《中國(guó)兩棲動(dòng)物檢索及圖鑒》(費(fèi)梁等，2005)。

1.3 分子生物學(xué)及分子系統(tǒng)學(xué)方法鑒定

采用高鹽法提取肌肉樣品總DNA。利用PCR擴(kuò)增并測(cè)定了線粒體COⅠ基因部分片段。擴(kuò)增引物參照Che等(2012)的Chmf4(5’-TYTCWACWAAYCAYAAAGAYATCGG-3’)和Chmr4(5’-AC-YTCRGGRTGRCCRAARAATCA-3’)。30 μL PCR反應(yīng)體系：15 μL mix，上、下游引物各1 μL，基因組DNA 1 μL，滅菌水12 μL。PCR反應(yīng)條件為：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，48 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 7 min。PCR產(chǎn)物分別用上、下游引物測(cè)序，所得序列上傳到GenBank(表1)。

1.4 分子系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系重建

下載GenBank中湍蛙屬部分物種和蛙科Ranidae部分相近物種的COⅠ基因序列，結(jié)合本文序列，進(jìn)行分子系統(tǒng)發(fā)育分析(表1)。所有序列在Clustal X 1.8(Thompsonetal.，1997)中進(jìn)行比對(duì)，采用默認(rèn)配置，比對(duì)后的序列進(jìn)行人工校對(duì)。系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建采用最大似然法(maximum likelihood，ML)。構(gòu)建ML樹前，利用jModeltest 2(David，2008)基于AIC標(biāo)準(zhǔn)選擇最適核苷酸替代模型。ML樹的構(gòu)建在PhyML 3.0(Guindonetal.，2012)中完成，并進(jìn)行1 000次bootstrap重抽樣分析，檢驗(yàn)各節(jié)點(diǎn)置信度。

表1 樣品信息表Table 1 Samples and the GenBank accession numbers of COⅠ gene sequences

注Note：*模式產(chǎn)地type locality

1.5 遺傳距離

用MEGA 6.0(Tamuraetal.，2013)的Kimura雙參數(shù)模型計(jì)算表1所列湍蛙屬物種間的遺傳距離。

2 結(jié)果

2.1 形態(tài)學(xué)分析結(jié)果

比較了貴州采集的湍蛙標(biāo)本和文獻(xiàn)所列湍蛙屬物種的形態(tài)鑒定特征，發(fā)現(xiàn)本研究采集的標(biāo)本形態(tài)特征與中華湍蛙模式產(chǎn)地標(biāo)本相符：雄蛙體長(zhǎng)56.1～58.0 mm，雌蛙體長(zhǎng)51.8 mm，其他部位量度見表2。頭體扁平，頭寬大于頭長(zhǎng)，吻端鈍圓，吻棱明顯，鼻孔位于吻眼之間，略近吻端。鼻間距大于眼間距，鼓膜小于第3指吸盤，位于眼后。顳褶顯著，自眼后角經(jīng)鼓膜背緣到肩胛部。犁骨齒發(fā)達(dá)，位于內(nèi)鼻孔之間。舌后端缺刻深。

表2 貴州中華湍蛙標(biāo)本形態(tài)量度Table 2 Morphological measurements of Amolops sinensis specimens collected from Guizhou province

前肢長(zhǎng)，指長(zhǎng)順序?yàn)?<2<4<3，指端具吸盤，前緣有橫溝，關(guān)節(jié)下瘤顯現(xiàn)，第2、3、4指指基下瘤明顯，掌突2，位于第2指基部和掌心，大而扁平。指間無蹼。后肢長(zhǎng)，后肢貼體前伸時(shí)，脛跗關(guān)節(jié)達(dá)眼，左右跟部重疊，趾端均具吸盤和橫溝，關(guān)節(jié)下瘤明顯，趾間全蹼，第1、5趾游離側(cè)具緣膜，內(nèi)蹠突長(zhǎng)圓形，無外蹠突。

皮膚粗糙，背部散有痣粒，體側(cè)疣粒大而多。口角后端有1～2個(gè)頜腺。雄蛙上頜緣有小白刺，腹部光滑有細(xì)粒，胸腔上部及咽部有黑色斑。

生活時(shí)背面有黃綠色和褐色相間的斑紋。四肢背面有深色橫紋，股部4～5條，脛部5～6條。兩眼前角間有一白點(diǎn)。頜腺略帶黃色。腹面乳白色。

雄蛙第1指基內(nèi)緣有乳白色婚墊，婚墊上具婚刺，無聲囊及雄性線。

1號(hào)蝌蚪標(biāo)本(標(biāo)本號(hào)：CIBLS20180717001)處于發(fā)育階段第32期，全長(zhǎng)36.1 mm、頭體長(zhǎng)12.9 mm、頭寬10.4 mm、吻長(zhǎng)6.0 mm、眼間距3.7 mm、吸盤寬8.2 mm、尾長(zhǎng)23.0 mm、尾寬4.2 mm、尾高6.5 mm、吻至出水孔距離12.0 mm。生活時(shí)體背面灰色，腹面乳白色，吻端圓，體扁；鼻孔近眼，眼位于頭背側(cè)，出水孔位于左側(cè)，游離管較長(zhǎng)，肛孔開口于尾基腹面中央。口寬大，位于頭腹面，口后有一大吸盤，吸盤橫徑大于口寬；上、下唇進(jìn)口角處有唇乳突，唇齒式為Ⅲ∶1+1/1+1∶Ⅱ (圖1：E、F)。

2.2 分子系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系和遺傳距離

PCR擴(kuò)增共獲得中華湍蛙線粒體COⅠ基因序列 3條，長(zhǎng)度573 bp。序列中保守位點(diǎn)354個(gè)，簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)191個(gè)，T、C、A、G含量分別為32.5%、25.8%、25.5%、16.2%，A+T含量高于G+C含量。本文所用最適核苷酸替代模型為GTR+G+I。ML樹顯示，貴州梵凈山和雷公山所采的湍蛙標(biāo)本與中華湍蛙模式產(chǎn)地(廣東省英德市)的標(biāo)本聚合構(gòu)成單系(圖2)，且有較高的支持率(99%)。基于Kimura雙參數(shù)模型估算的湍蛙屬部分物種間的遺傳距離(表3)表明，本研究中所采用的湍蛙屬物種間的遺傳距離為6.5%～25.0%，平均遺傳距離為13.5%；貴州所采湍蛙標(biāo)本與中華湍蛙模式產(chǎn)地標(biāo)本間的遺傳距離為1.2%，遠(yuǎn)小于湍蛙屬物種間的遺傳距離。分子系統(tǒng)發(fā)育分析和遺傳距離結(jié)果均支持采集于貴州梵凈山和雷公山的湍蛙標(biāo)本為中華湍蛙。

2.3 生境描述

中華湍蛙在貴州梵凈山國(guó)家級(jí)自然保護(hù)區(qū)和貴州雷公山國(guó)家級(jí)自然保護(hù)區(qū)內(nèi)主要分布于海拔600～1 100 m的山間水流較為湍急的河流，常棲于河流內(nèi)石頭上或河邊樹枝上(圖1：G)。與其同域分布的兩棲類有棘指角蟾Megophrysspinata、棘腹蛙Quasipaaboulengeri、武陵瘰螈Paramesotritonwulingensis、大綠臭蛙Odorranagraminea和黃崗臭蛙Odorranahuanggangensis。

圖1 貴州中華湍蛙及生境Fig. 1 Amolops sinensis and its habitat in Guizhou province

A. 背面觀(♂)， B. 腹面觀(♂)， C. 背面觀(♀)， D. 腹面觀(♀)， E. 蝌蚪背面觀， F. 蝌蚪腹面觀， G. 梵凈山生境

A. dorsal view (♂)， B. ventral view (♂)， C. dorsal view (♀)， D. ventral view (♀)， E. dorsal view of tadpole， F. ventral view of tadpole， G. habitat ofA.sinensisin the Fanjingshan National Nature Reserve

3 討論

Boulenger(1899)將福建省武夷山的2號(hào)湍蛙標(biāo)本定名為華南湍蛙，此后相繼在中國(guó)南方、印度支那北部和中部報(bào)道了此物種的分布(費(fèi)梁等，2012；Frost，2019)。分子系統(tǒng)學(xué)的發(fā)展極大地提高了人們對(duì)隱存種的識(shí)別能力(Funketal.，2012)。被鑒定為華南湍蛙的白刺湍蛙AmolopsalbispinusSung， Hu， Wang， Liu， and Wang， 2016、逸仙湍蛙AmolopsyatseniLyu， Wang， and Wang， 2019和中華湍蛙均為隱存種。華南湍蛙分布廣泛，是否還存在隱存種需進(jìn)一步研究。

華南湍蛙在貴州省廣泛分布于印江、松桃、雷山、貴定、都勻、綏陽、赤水和石阡等地區(qū)(伍律等，1986)。本文基于形態(tài)比較和分子系統(tǒng)發(fā)育分析發(fā)現(xiàn)，分布于貴州省梵凈山和雷公山原鑒定為華南湍蛙的物種應(yīng)為中華湍蛙，為貴州省湍蛙屬物種新記錄。印江、松桃、赤水和石阡同屬武陵山脈，雷山、都勻和貴定屬苗嶺山脈，因此推測(cè)分布于這些地區(qū)的此前被鑒定為華南湍蛙的湍蛙物種可能為中華湍蛙，而綏陽屬于大婁山脈，因此分布于該地區(qū)的華南湍蛙是否應(yīng)為中華湍蛙或?yàn)橥耐軐匐[存種還需進(jìn)一步研究。

中華湍蛙梵凈山及雷公山種群與模式產(chǎn)地廣東英德種群相比，在形態(tài)上，梵凈山及雷公山種群雄蛙個(gè)體較大(雄蛙頭體長(zhǎng)58.1～58.0 mm)，而模式產(chǎn)地種群的雄蛙頭體長(zhǎng)40.2～46.5 mm；后肢貼體前伸時(shí)，脛跗關(guān)節(jié)僅達(dá)眼，而模式產(chǎn)地種群后肢貼體前伸時(shí)，脛跗關(guān)節(jié)達(dá)吻端；在分子上2個(gè)種群間成單系，遺傳距離為1.2%，說明2個(gè)種群間已產(chǎn)生分化。從地理分布上看，中華湍蛙貴州種群分布于武陵山脈和苗嶺山脈，中華湍蛙的模式產(chǎn)地廣東省處于南嶺山脈最南端，中間隔以雪峰山及苗嶺。中華湍蛙貴州種群與模式產(chǎn)地種群在形態(tài)及分子上存在一定差異的原因是否由長(zhǎng)期的地理隔離造成，還需進(jìn)一步研究。

圖2 基于線粒體COⅠ基因序列構(gòu)建的湍蛙屬最大似然系統(tǒng)發(fā)育樹
Fig. 2 Maximum likelihood tree forAmolopsconstructed based onCOⅠgene sequences

支上的數(shù)字代表重抽樣支持率； CIBFJS20150717005、CIBLS20180804003、CIBLS20180717001為本研究中貴州所采樣品編號(hào)， 其余物種序列信息見表1

Numbers beside nodes indicate bootstrap values； CIBFJS20150717005， CIBLS20180804003 and CIBLS20180717001 are the samples collected in this study (Guizhou province)； the sequence information of other species are shown in table 1

表3 基于線粒體COⅠ基因計(jì)算本研究中的湍蛙屬物種間Kamura-2-parameter距離Table 3 COⅠ gene sequence-based genetic distance analysis of 11 Amolop species examined in this study

注：*來自貴州湍蛙屬物種樣品

Note：*Amolopsspecies were from Guizhou province