何海艷，陳雯燁，楊愛萍，蔣彩云，張睿

1(江蘇經(jīng)貿(mào)職業(yè)技術(shù)學(xué)院 健康學(xué)院，江蘇 南京，211168) 2(南京財(cái)經(jīng)大學(xué) 食品學(xué)院，江蘇 南京，210023)

高血壓是一種常見的慢性疾病，臨床綜合特征表現(xiàn)為體循環(huán)動(dòng)脈壓增高，會(huì)損傷人體眼睛、心臟、大腦、腎臟等器官，并引發(fā)動(dòng)脈瘤、心肌梗死和心力衰竭等心血管并發(fā)癥[1]。研究表明，氧化應(yīng)激是導(dǎo)致高血壓產(chǎn)生的主要原因。氧化應(yīng)激或活性氧自由基如超氧化物、羥基自由基等會(huì)攻擊身體的健康細(xì)胞，導(dǎo)致其失去結(jié)構(gòu)和功能[2]；高血壓會(huì)使氧化應(yīng)激水平升高，加速了與之相關(guān)的活性氧釋放，因此，抗氧化劑在高血壓治療中發(fā)揮著重要的作用。另外，血管緊張素轉(zhuǎn)換酶(angiotensin converting enzyme, ACE)在調(diào)節(jié)血壓中起著關(guān)鍵作用。ACE通過催化血管緊張素-I轉(zhuǎn)化為血管緊張素-Ⅱ，抑制緩激肽活性，導(dǎo)致血壓升高，因此，抑制ACE活性也可以降低機(jī)體血壓[3]。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黑加侖，購(gòu)自新疆；自發(fā)性高血壓大鼠(SHRs，SPF級(jí)無特定病原體)，北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司；人肝癌細(xì)胞HepG2(BG040)細(xì)胞,上海博谷生物有限公司；沒食子酸、福林酚試劑、血管緊張素轉(zhuǎn)化酶-I(ACE)、6-羥基-2，5，7，8-四甲基色滿-2-羧基(Trolox)、2′，7′-二氯熒光素二乙酸(DCFH-DA)、偶氮二異丁脒鹽酸鹽(AAPH)、N-[3-(2-呋喃基)丙烯酰]-L-苯丙氨酰-甘氨酰-甘氨酸(FAPGG)、FeSO4、水楊酸-乙醇溶液、L-谷氨酰胺等試劑,北京索萊寶科技有限公司；胎牛血清(FBS)、二甲基亞砜(DMSO)、DMEM高糖完全培養(yǎng)基、雙抗(青霉素和鏈霉素)、胰蛋白酶等,美國(guó)Gibco公司；色譜級(jí)甲醇，墨克公司;其他試驗(yàn)所用試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

DF-101S集熱式磁力攪拌器，鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；冷凍離心機(jī)，美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特有限公司；冷凍干燥機(jī)，德國(guó)CHRIST公司；Stirred Cell 8010超濾裝置，美國(guó)Millipore；Stirred Cell 801096孔白色底部透明微孔板，美國(guó)Coming公司；ELX800全自動(dòng)酶標(biāo)儀，美國(guó)Bio-Tek公司；Triple-TOF 5600高分辨質(zhì)譜儀，美國(guó)AB sciex公司。

1.3 黑加侖多酚提取及膜分離

參考許海棠等[9]的方法提取黑加侖粗多酚，并進(jìn)行部分修改。將凍干黑加侖粉碎，按料液比1∶7(g∶mL)加入無水乙醇溶液(含0.1%乙酸)，40 ℃恒溫水浴，攪拌2 h，離心(8 000×g，4 ℃)20 min，收集上清液，濃縮冷凍干燥得到黑加侖多酚粗提物。粗多酚溶解后過截留分子質(zhì)量(molecular weight cutoff, MWCO)為1 kDa的超濾膜超濾，制得分子質(zhì)量<1 kDa的多酚純化物，凍干備用。

1.4 黑加侖多酚含量的測(cè)定

采用福林酚比色方法[10]，測(cè)定樣品多酚含量。吸取一定量黑加侖多酚溶液于10 mL容量瓶?jī)?nèi)，加入福林酚試劑，充分搖勻，反應(yīng)5 min，加入75 g/L的飽和Na2CO3溶液0.4 mL，以蒸餾水定容至刻度并搖勻。避光置于30 ℃恒溫水浴鍋中反應(yīng)1 h后，用酶標(biāo)儀于765 nm 下測(cè)定吸光值。用沒食子酸為標(biāo)準(zhǔn)品，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為：y=0.021 3x+0.002 7(0.1～0.7 mg/mL，R2=0.998 1)，分析樣品中多酚含量。

1.5 羥基自由基清除能力測(cè)定

按照呂旭聰?shù)萚11]的方法，測(cè)定羥基自由基(·OH)清除能力，取不同濃度待測(cè)樣品溶液1 mL，分別加入9 mmol/L FeSO4、9 mmol/L水楊酸-乙醇溶液各1 mL，通過滴加8.8 mmol/L過氧化氫1 mL啟動(dòng)反應(yīng)，在37 ℃水浴下反應(yīng)30 min，用酶標(biāo)儀在波長(zhǎng)510 nm下測(cè)定各濃度溶液的吸光度A，以蒸餾水作為樣品的空白對(duì)照。按公式(1)計(jì)算·OH清除率：

(1)

1.6 氧自由基吸附能力測(cè)定

根據(jù)TAVADYAN等[12]的方法測(cè)定樣品的氧自由基吸附能力(ORAC)。用pH 7.4的PBS將黑加侖多酚樣品稀釋成不同濃度梯度(1 000、500、100、50、10、5 μg/mL)，在96 孔板中加入20 μL樣品、20 μL Trolox標(biāo)準(zhǔn)品(6.25～50 μmol/L)以及120 μL的Fluorescein(熒光指示劑，0.008 μmol/L)，37 ℃培養(yǎng)20 min后，加60 μL，150 mmol/L AAPH，在激發(fā)波長(zhǎng)485 nm，發(fā)射波長(zhǎng)530 nm下，間隔2 min測(cè)1次，測(cè)60 min，以PBS為空白對(duì)照。

(2)

式中:AUC，熒光衰減曲線下面積分面積，μmol TE/mg DW。

1.7 細(xì)胞抗氧化活性(cellular antioxidant activity, CAA)實(shí)驗(yàn)

CAA根據(jù)SAKULNARMRAT等[13]的方法進(jìn)行部分調(diào)整，具體操作步驟如下：

將HepG2細(xì)胞以6×104cells/孔的數(shù)量種到96孔板中。將粗提物和純化物溶于DMEM培養(yǎng)液中。細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，棄掉培養(yǎng)液，每孔用100 μL的PBS溶液清洗1次，并加入100 μL含有25 μmol/L DCFH-DA的樣品液處理1 h后，棄掉樣品液，加入100 μL 600 μmol/L的AAPH工作液。96孔板置于多功能酶標(biāo)儀上讀取熒光值，溫度37 ℃。發(fā)射波長(zhǎng)538 nm，激發(fā)波長(zhǎng)在485 nm，每5 min測(cè)試1次，持續(xù)1 h。每個(gè)孔板均設(shè)置空白組和對(duì)照組，對(duì)照組不添加樣品，只添加DCFH-DA工作液和AAPH工作液；空白組僅添加DCFH-DA工作液。按照公式(3)計(jì)算CAA unit。

(3)

1.8 ACE活性的測(cè)定

根據(jù)IKARASHI等[14]方法分析黑加侖多酚的ACE抑制活性。依次在96孔板中加入40 μL不同濃度的黑加侖多酚HEPES樣品溶液，50 μL 1.0 mmol/L的FAPGG/HEPES溶液，10 μL ACE。40 μL的HEPES緩沖液作為樣品對(duì)照。于37 ℃下預(yù)熱5 min，在340 nm波長(zhǎng)下測(cè)定30 min，每30 s讀取1次，測(cè)試5 min,根據(jù)公式(4)計(jì)算樣品的ACE抑制活性。

(4)

式中：ΔA樣品和ΔA空白分別代表樣品和空白每分鐘ACE活性變化速率。

1.9 體內(nèi)降壓效果評(píng)價(jià)

根據(jù)汪麗[15]的方法進(jìn)行微調(diào)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，取15只10周齡雄性自發(fā)性高血壓大鼠進(jìn)行測(cè)試。飼養(yǎng)條件：將大鼠置于SPF動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室，分籠飼養(yǎng)，每籠3～4只，自由進(jìn)食、飲水。室溫控制在約25 ℃，濕度65%，12 h光照/黑暗，保持安靜，排除其他干擾。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分為4組(n=5)，分別灌胃1 mL 0.9%生理鹽水(對(duì)照組)、卡托普利(captopril)(10 mg/kg bw)、黑加侖粗品、小于1 kDa多酚組分(100 mg/kg bw)。采用夾尾法測(cè)量SHRs的血管收縮壓(systolic blood pressure, SBP)，結(jié)果以灌胃后2、4、6、8、24 h SHRs的SBP減去灌胃前SBP表示。

1.10 質(zhì)譜分析黑加侖多酚成分

利用高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(HPLC-Q-TOF-MS-MS)分析和鑒定<1 kDa的多酚組分。液相色譜條件為：色譜柱Infinity Lab Poroshell 120 EC-C18(2.1 mm×100 mm，2.7 μm)；柱溫35 ℃；流速0.5 mL/min；進(jìn)樣體積10 μL；流動(dòng)相：A：水，B：甲醇；洗脫條件：10%～80% B(0～15min)，80%～95% B(15～20 min)，95% B(20～25 min)，10% B(25～26 min)；檢測(cè)波長(zhǎng)為287 nm。質(zhì)譜條件：ESI負(fù)離子模式；噴射電壓4 000 V，噴射壓力138 kPa；碰撞能量35 V，錐孔電壓40 V；干燥氣流速10 L/min；干燥氣溫度335 ℃；掃描質(zhì)量范圍m/z：100～1 000。采用PEAKS VIEW(Version 8.0)軟件解析質(zhì)譜數(shù)據(jù)。

1.11 統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS 19.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析Duncan多重比較，顯著差異選用P<0.05。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差來表示；采用Origin Pro 2016制圖。

2 結(jié)果與討論

2.1 黑加侖多酚的羥基自由基清除能力

從圖1可以看出，多酚粗提物、<1 kDa多酚的羥基自由基清除率均與樣品濃度呈正相關(guān)，此結(jié)果與段鳳敏等[16]研究的青毛茶中茶多酚提取液濃度對(duì)羥基自由基(·OH)清除效果的研究結(jié)果一致。與粗多酚相比，<1 kDa多酚羥基自由基清除能力提高了1.9～9.47 μg/mL，同時(shí)<1 kDa多酚羥基自由基清除能力的IC50值(7.12±0.13 mg/mL)明顯低于粗多酚的IC50值(75.49±3.87 mg/mL)。這個(gè)結(jié)果與馬艷弘等[17]的研究結(jié)果比較相似，測(cè)得純化草莓多酚清除羥自由基的IC50值為0.17 mg/mL，粗多酚的IC50值則顯著高于純化多酚，達(dá)到0.76 mg/mL。

A-粗多酚;B-<1 kDa多酚圖1 黑加侖多酚對(duì)·OH清除能力的影響Fig.1 ·OH scavenging ability of blackcurrant polyphenols注：不同小寫字母表示具有顯著性差(P<0.05)(下同)

2.2 黑加侖多酚的總抗氧化能力

ORAC法是評(píng)價(jià)食品抗氧化的標(biāo)準(zhǔn)方法，用于檢測(cè)抗氧化物質(zhì)對(duì)過氧化氫自由基的清除能力。結(jié)果得出，黑加侖粗多酚的ORAC值為(467.69±1.83) μmol TE/mg DW，<1 kDa組分的多酚ORAC值為(492.74±1.55) μmol TE/mg DW。數(shù)據(jù)表明，<1 kDa組分比粗提物更能有效地清除過氧化氫自由基。本研究結(jié)果略高于LIU等[18]研究的矮櫻桃多酚的總抗氧化能力(94.79～205.68 μmol TE/g DW)，同時(shí)也高于CARBONNEAU等[19]研究紅高粱和白高粱多酚的ORAC值(103.8±2.1 μmol TE/g和4.2±0.2 μmol TE/g)。

表1 黑加侖多酚的總抗氧化能力Table 1 Total antioxidant capacity of black currantpolyphenols

注：不同小寫字母代表有顯著性差異(P<0.05)(下同)

2.3 黑加侖多酚的細(xì)胞內(nèi)抗氧化能力

CAA檢測(cè)可以評(píng)估活細(xì)胞內(nèi)多酚抗氧化活性，能夠反映多酚降低細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激的能力，以半數(shù)有效量(EC50)表示樣品的細(xì)胞抗氧化能力的大小。從圖2可以看出，黑加侖多酚的細(xì)胞內(nèi)抗氧化活性與濃度呈正相關(guān)(P<0.05)。粗多酚對(duì)HepG2細(xì)胞的EC50值為(6.38±0.17) mmol QE/100 g DW，<1 kDa組分的EC50值為(5.14±0.08) mmol QE/100 g DW，<1 kDa多酚組分的細(xì)胞抗氧化活性效果較好。研究認(rèn)為，黑加侖多酚具有一定的抗氧化活性，這是因?yàn)楹诩觼龆喾幽軌蚍乐笵CFH和膜脂的氧化，減少HepG2細(xì)胞中DCFH的形成，從而對(duì)AAPH產(chǎn)生的過氧自由基起到抗氧化作用。黑加侖多酚的細(xì)胞內(nèi)抗氧化活性略優(yōu)于紅茶多酚(CAA值59.3 μmol QE/100 mg DW)[20]，差于蔬菜(CAA值為0.93～5.61 μmol QE/100 g)[21]，但經(jīng)過純化后多酚的抗氧化效果可以達(dá)到和這些蔬菜相近的抗氧化效果，可以采用膜分離的純化方法提高黑加侖多酚的抗氧化活性。

A-粗多酚;B-<1 kDa多酚圖2 黑加侖多酚細(xì)胞內(nèi)的抗氧化能力Fig.2 Cellular antioxidant activity of blackcurrant polyphenols

2.4 黑加侖多酚的ACE抑制活性

從圖3可以看出，黑加侖多酚可以顯著抑制ACE的活性。ACE抑制率隨著多酚濃度的升高而增強(qiáng)，在5.6～550 μg/mL濃度范圍內(nèi)具有顯著性差異(P<0.05)，濃度在550 μg/mL以上的粗多酚對(duì)ACE的抑制率達(dá)到73.17%，半數(shù)抑制濃度(IC50)為(342.91±4.22) μg/mL。<1 kDa組分的ACE的抑制活性也與濃度呈正相關(guān)，濃度為550 μg/mL時(shí)ACE抑制率達(dá)到84.25%，IC50值為(225.66±1.82) μg/mL，ACE抑制活性顯著優(yōu)于粗提物(P<0.05)。這一結(jié)果與OBOH等[22]研究紫洋蔥多酚結(jié)果相一致，紫洋蔥多酚(IC50=0.59 mg/mL)對(duì)ACE的抑制作用優(yōu)于白洋蔥多酚(IC50=0.66 mg/mL)和大蒜(IC50=0.96 mg/mL)。因此，黑加侖多酚可能會(huì)通過抑制ACE達(dá)到降血壓的作用[23]。

A-粗多酚;B-<1 kDa多酚圖3 黑加侖多酚的ACE抑制活性Fig.3 ACE inhibitions of blackcurrant polyphenols

2.5 大鼠降壓效果

降低機(jī)體SBP是抗高血壓藥物的一個(gè)重要特征，黑加侖多酚的降血壓效果如圖4所示。

圖4 黑加侖多酚對(duì)SHRs收縮壓的影響Fig.4 Effect of blackcurrant polyphenols on systolic bloodpressure of SHRs注：*表示與SHR組相比具有顯著性差異(P<0.05)。

灌胃SHRs黑加侖多酚6 h后SHRs的SBP顯著降低(P<0.05)，其中，分子量<1 kDa多酚降低SBP的效果顯著優(yōu)于粗多酚，并且在4～8 h平均降低SHRs的SBP達(dá)到(24.4±2.8) mm Hg，對(duì)照組卡托普利降低了(28.6±2.3) mm Hg的SBP。由此可見，多酚對(duì)于SHRs血壓的治療能在灌胃后4～8 h內(nèi)保持穩(wěn)定，從而能起到很好的降血壓作用。SEOK-CHUN等[24]研究了一種海生藻類多酚在8 h內(nèi)對(duì)SHRs收縮壓的影響，結(jié)果顯示，該多酚能夠降低SHRs中的SBP，從而表現(xiàn)出良好的降壓作用。ALASHI等[25]研究添加蔬菜面包的降血壓效果也得到類似的結(jié)論，蔬菜中多酚能使降壓作用維持在8 h以內(nèi)。另外，王著等[26]研究石榴多酚的降血壓作用發(fā)現(xiàn)不同給藥時(shí)間點(diǎn)均能顯著降低SHRs的舒張壓，也體現(xiàn)了植物多酚的降血壓作用。

2.6 黑加侖多酚組分分析

采用HPLC-Q-TOF-MS/MS鑒定<1 kDa組分多酚的組成，總離子色譜圖如圖5所示，<1 kDa組分有6個(gè)明顯的色譜峰。其中，峰1母離子384 m/z，子離子含有飛燕草素特征峰338 m/z，參考SYLWIA等[8]的研究結(jié)果，鑒定峰1為飛燕草素-3-葡萄糖苷。峰2母離子497.3 m/z，子離子449為矢車菊素的特征峰，鑒定為矢車菊素-3-葡萄糖苷；峰3母離子696.4 m/z，子離子610 m/z為蕓香糖苷的特征峰、289 m/z 為矢車菊素的特征峰，鑒定為矢車菊素-3-蕓香糖苷；峰4母離子723.5 m/z，子離子449為牽?；ㄋ亍⑹|香糖苷的特征峰，鑒定為芍藥素-3-蕓香糖苷；峰5母離子836.6 m/z，子離子451 m/z 和225 m/z 為蕓香糖苷、芍藥素的特征峰，鑒定為飛燕草素-3-蕓香糖苷；峰6母離子949.7 m/z，子離子449為牽牛花素、蕓香糖苷的特征峰，鑒定為牽?；ㄋ?3-蕓香糖苷-5-葡萄糖(表2)。

圖5 <1 kDa的多酚純化物質(zhì)譜分析總離子色譜圖Fig.5 Total ion chromatography of less than 1 kDapurified polyphenols by mass spectrometry

表2 <1 kDa組分的結(jié)構(gòu)鑒定分析Table 2 Structural identification of less than1 kDa fraction

正是由于黑加侖多酚中含有飛燕草素-3-葡萄糖苷等6種花青素，使得其具備了相應(yīng)的降血壓效果。例如，因含有飛燕草素、矢車菊素糖苷等花青素，洛神葵提取物具備了較好的自由基清除能力和ACE抑制活性[27]，VENDRAME等[28]也認(rèn)為花青素在調(diào)節(jié)機(jī)體血壓方面發(fā)揮著重要的作用。

3 結(jié)論

本研究中利用較為簡(jiǎn)便的膜分離法制備了分子量<1kDa的黑加侖多酚純化物，并研究了粗提物和純化物的抗氧化、降血壓能力。結(jié)果發(fā)現(xiàn)粗多酚和純化后分子量<1 kDa的多酚的·OH清除能力的IC50值分別為(75.49±3.87) mg/mL和(7.12±0.13) mg/mL；粗多酚的ORAC值為(467.69±1.83) μmol TE/mg DW，多酚純化物的ORAC值為(492.74±1.55) μmol TE/mg DW；粗多酚和純化物對(duì)細(xì)胞的抗氧化活性的EC50值分別為(6.38±0.17) mmol QE/100 g DW和(5.14±0.08) mmol QE/100 g DW；粗多酚和多酚純化物的ACE抑制活性的IC50分別為(342.91±4.22) μg/mL和(225.66±1.82) μg/mL，動(dòng)物研究得出粗多酚和分子量<1 kDa的多酚純化物均表現(xiàn)出了與對(duì)照組相似的降壓趨勢(shì)，且在灌胃4～8 h，<1 kDa的多酚具有與商業(yè)化降血壓藥卡托普利(劑量為10 mg/kg bw)相似的降血壓效果。研究結(jié)果表明黑加侖粗多酚及<1 kDa組分均具有良好的降血壓作用，其作用機(jī)制與抗氧化能力和血管緊張素轉(zhuǎn)化酶的抑制性密切相關(guān)。最后本文研究利用HPLC-Q-TOF-MS-MS鑒定出<1 kDa組分中含有飛燕草素-3-葡萄糖苷、矢車菊素-3-葡萄糖苷、矢車菊素-3-蕓香糖苷、芍藥素-3-蕓香糖苷、飛燕草素-3-蕓香糖苷、牽?；ㄋ?3-蕓香糖苷-5-葡萄糖6種花青素。這些組分可能是起到降血壓作用的重要原因，這有待進(jìn)一步研究。本研究為后續(xù)黑加侖多酚作為天然降血壓藥物和功能食品的開發(fā)原料提供了一定的理論基礎(chǔ)和現(xiàn)實(shí)依據(jù)。