尹哲， 龍莎， 張嘉穎， 於懷龍， 王立強

(華僑大學 生物醫(yī)學學院， 福建 泉州 362021)

單環(huán)刺螠(Urechisunicinctus)體長色紅，是常見的底棲生物，多見于我國黃渤海沿岸U型淺水區(qū)，利用價值極高.對單環(huán)刺螠的生物研究最早集中在螠速激肽Ⅰ-Ⅷ、血凝素、腺苷酸酶等成分的提取和利用方面[1-4].王佃亮等[5]在研究單環(huán)刺螠體內生物活性物質的過程中，發(fā)現(xiàn)其具有一種纖溶活性的蛋白酶.郭金明等[6]在前人研究的基礎上，從單環(huán)刺螠組織液中提取出在體內外均具有較強抗凝、溶栓活性及生物安全性的纖溶酶，并命名為單環(huán)刺螠纖溶酶(UFE).UFE是一種胰蛋白酶樣的絲氨酸蛋白酶，具有纖維蛋白溶解活性，能明顯延長血液凝固時間，產生抗凝血作用[7].現(xiàn)有的研究對UFE的提取部位各異，質量尚未均一化，導致文獻報道中結果數(shù)據(jù)的可信度與重現(xiàn)性較差.本課題組的前期研究表明，單環(huán)刺螠肌體中UFE的總蛋白質量與季節(jié)變化有關，具有季節(jié)累積性.基于此，本文對秋季單環(huán)刺螠體腔液、體壁肌及內臟等不同部位UFE進行分離純化，并對其活性差異進行研究.

1 實驗部分

1.1 實驗動物

單環(huán)刺螠(山東省青島市黃島海域)，清潔級，體質量為(40±10) g(生物學成年個體)；SD大鼠(購自廈門大學實驗動物中心，動物許可證號為SYXK(閩)2013-0006)，SPF級，體質量為(200±20) g，雌雄各半.

1.2 儀器與試劑

高速離心機(美國Beckman公司)；HD-21-88型核酸/蛋白質檢測儀(上海琪特公司)；超聲波清洗機(上海市愛闊特公司)；倒置熒光顯微鏡(日本Nikon公司)；CO2恒溫細胞培養(yǎng)箱(美國Thermo公司)；真空干燥箱(上海和呈儀器制造有限公司)；M600型凝血因子分析儀(北京中勤世帝科學儀器有限公司)；P2-4LD型冷凍干燥機(北京博醫(yī)康試驗儀器有限公司).

凝血酶時間(TT)診斷試劑盒、凝血酶原時間(PT)診斷試劑盒(上海碧云天生物技術有限公司)；Q-Sepharose fast flow陰離子交換層析柱(上海源葉生物科技有限公司)；硫酸根(質量分數(shù)為30.26%)、糖醛酸(質量分數(shù)為25.25%)、氨基糖(質量分數(shù)為7.58%)、Folin-酚試劑、三羥甲基氨基甲烷(Tris)、酪蛋白(賽默上海飛世爾科技有限公司)；SephacrylS 100凝膠柱、Sephadex G-50葡聚糖凝膠、纖維蛋白原(FIB)測定試劑(福建省泉州市華諾生物科技有限責任公司)；標準血漿(上海碧云天生物技術有限公司),乏抗凝血酶-Ⅲ血漿(乏AT-Ⅲ血漿)、乏肝素輔因子-Ⅱ血漿(乏HC-Ⅱ血漿)(上海冠東生物科技有限公司)；肝素鈉(≥2 500.5 mkat·g-1，CAS登錄號為9041-08-1，安徽省合肥市博美生物科技有限公司)；其他試劑均為國產分析純.

1.3 實驗方法

1.3.1 單環(huán)刺螠分組 于秋季購買單環(huán)刺螠成蟲，選擇體表無傷痕，體態(tài)均一的健康個體，于充氣的海水(水溫為(17.6±0.3) ℃，pH值為8.01±0.02，實際鹽度為32%)中暫養(yǎng)3 d，每日換水2次，每次換1/2水.實驗分3批(A～C批)，每批3組，每組10只.

1.3.2 單環(huán)刺螠前處理 將單環(huán)刺螠進行以下處理:A批，剪去一端，擠出內臟，用蒸餾水淋洗后進行組織絞碎，紗布過濾，得內臟勻漿液；B批，避開內臟，在蟲體近頭端處剖開長度約1 cm的小口，倒提蟲體，將體腔液瀝出，紗布過濾，得體腔液；C批，剪去一端，擠出內臟，將剩余體壁肌用蒸餾水淋洗后進行組織絞碎，紗布過濾，得體壁肌勻漿液.以上過程均在4 ℃下進行，處理后于-80 ℃暫存.

1.3.3 UFE的提取純化 將3批樣品在4 ℃下融化，于3 900 r·min-1離心60 min，收集上清液，分別于質量分數(shù)為90%，50%的過硫酸銨溶液中透析除鹽，經0.45 μm 微孔濾膜處理后，冷凍干燥，得酶粗品.分別配制0.2 mol·L-1的酶粗品液上樣SephacrylS 100凝膠柱，以雙蒸水洗脫，收集凝膠柱最上層的淡黃色條帶組分，冷凍干燥，獲得最終酶粗品.用0.02 mol·L-1的Tris-HCl 緩沖液將酶粗品的濃度配制為0.2 mol·L-1后，按柱體積的2%(約5 mL)向Q-Sepharose 陰離子層析柱中加樣，流速為1.2 mL·min-1，使用0.5 mol·L-1的NaCl及0.02 mol·L-1的Tris-HCl緩沖液梯度洗脫；收集的洗脫液以雙蒸水為外相，3 500 D透析袋去離子后冷凍干燥，使雙蒸水溶解層析所得凍干品的質量濃度為0.5 mg·mL-1，按柱體積的2%(約5 mL)向Sephadex G-50凝膠柱上樣，流出速度為每秒0.2滴，每管收集4 mL流出組分，冷凍干燥.然后，分別檢測A～C批的酶活力及比活力.酶活力單位定義:在溫度為37 ℃，pH值為7.8的條件下，每分鐘水解出相當于1 μg 酪氨酸的酶量為1個酶活力單位，即1個酶活力單位=酪氨酸質量/水解時間×稀釋倍數(shù).比活力指單位質量蛋白質所具有的酶活力單位數(shù).

1.3.4 UFE酶活力的測定 用Folin-酚試劑法對酶活力進行測定，以酪蛋白為底物.取1 mL質量分數(shù)為1%的酪蛋白溶液和0.9 mL Tris-HCl緩沖液，加入0.1 mL UFE樣品溶液，混勻后，于37 ℃水浴中反應20 min，加入1 mL質量分數(shù)為15%的三氯乙酸溶液終止反應;靜置離心10 min，取上清液作為樣品溶液.取1 mL質量分數(shù)為1%的酪蛋白溶液和0.9 mL Tris-HCl緩沖液，加入1 mL質量分數(shù)為15%的三氯乙酸溶液，再加入0.1 mL的UFE樣品溶液，靜置離心10 min，取上清液作為對照溶液.取上述樣品溶液和1 mL對照溶液，加入5 mL Folin-酚試劑(甲)及0.5 mL Folin-酚試劑(乙)，混勻于室溫放置30 min后，在560 nm處測定其吸光度D560.以吸光度D560為縱坐標(Y),以蛋白質量為橫坐標(X)，得標準曲線為Y=102.65X-0.214 3，相關系數(shù)R2=0.999 8.

1.3.5 標準血漿、乏AT-Ⅲ血漿、乏HC-Ⅱ血漿凝固時間的測定 選擇生理鹽水作為對照組，按體積比1∶10分別向標準血漿、乏AT-Ⅲ、乏HC-Ⅱ血漿中加入4 mg·mL-1的UFE，以此作為實驗組.將凝血酶原時間試劑和凝血酶時間試劑預溫10 min后，再將各待測組預溫5 min，通過凝血因子分析儀測定凝固時間.

1.3.6 血漿凝血因子活性的測定 選擇生理鹽水為空白對照，70 μg·mL-1肝素鈉為陽性對照，3批UFE樣品的質量濃度為70 μg·mL-1，使用凝血因子試劑盒測定血漿凝血因子活性.

1.3.7 大鼠血體外復鈣凝血時間的測定 選擇生理鹽水作為空白對照，2 mg·mL-1肝素鈉作為陽性對照，氯化鈣溶液的質量濃度分別為3，10 mg·mL-1，UFE的質量濃度為2 mg·mL-1.大鼠股動脈取血，每5 mL血液中加入0.1 mL質量分數(shù)為5%的草酸鉀溶液，以制備抗凝血.每組加入0.9 mL抗凝血，空白對照組中加入1 mL生理鹽水，陽性對照組中加入1 mL肝素鈉，實驗組中加入1 mL UFE溶液，于37 ℃恒溫水浴條件下，分別加入0.1 mL不同質量濃度的氯化鈣溶液；每隔30 s檢查血液狀態(tài)，當血液不再流動時，記錄凝血時間.

1.3.8 大鼠血液中鈣離子濃度的測定 選擇雌雄大鼠，正常喂養(yǎng)3 d后，實驗組分別尾靜脈注射4，16 mg·mL-1的UFE溶液，空白對照組注射0.5 mL的生理鹽水，陽性對照組注射4 mg·mL-1的肝素鈉；30 min后股動脈采血，于3 000 r·min-1離心15 min，并通過甲基-百里酚藍比色法測定上清液中鈣離子的質量濃度[6].

1.4 統(tǒng)計分析

樣品批次mavmexA批(內臟)40.80±1.217.87±0.37B批(體腔液)40.18±1.978.80±0.25C批(體壁肌)39.75±2.3020.37±1.07

2 結果與分析

2.1 單環(huán)刺螠不同部位的分離純化

2.1.1 樣品參數(shù)統(tǒng)計 單環(huán)刺螠的基本參數(shù)統(tǒng)計(體腔液密度為1 g·cm-3),如表1所示.表1中：n為檢測次數(shù)；mav為單環(huán)刺螠的平均質量；mex為單環(huán)刺螠提取部位的質量.由表1可知：不同部位來源樣品的質量不同，體腔液和內臟占單環(huán)刺螠質量的比例較為接近，體壁肌則為單環(huán)刺螠體質量的主要構成.

2.1.2 粗酶液的吸光度 不同部位來源的樣品粗酶液，如圖1所示.由圖1可知：B批樣品經過濾、離心處理后，與另外兩批相比，顏色鮮紅，質地粘稠.不同部位樣品經SephacrylS 100凝膠柱后，其吸光度D560如圖2所示.由圖2可知：C批樣品蛋白的D560最低，A批次之，B批的D560最高，可達0.841.因此，體腔液的外觀及其粗酶液的D560值均優(yōu)于其他部位.

圖1 樣品粗酶液 圖2 不同部位樣品的吸光度 Fig.1 Sample crude enzyme solution Fig.2 Optical density values of sample from different parts

2.1.3 樣品純化參數(shù) 不同部位來源樣品分離純化過程中的相關參數(shù)，如圖3所示.圖3中：mt為總蛋白質量；k為純化倍數(shù)；與A批組相比，“a”表示P<0.01；與B批組相比，“b”表示P<0.01；與C批組相比，“c”表示P<0.01.由圖3可知：不同部位來源樣品的參數(shù)存在一定差異，體腔液中提取的總蛋白質量為39.8 mg，UFE的比活力為4 695.94 mkat·g-1，純化倍數(shù)為13.8，均高于體壁肌、內臟中所得.

(a) 總蛋白質量 (b) 比活力 (c) 純化倍數(shù)圖3 不同部位來源樣品分離純化過程中的相關參數(shù)Fig.3 Relevant parameters during separation and purification of samples from different parts

表2 UFE抗凝血酶活性的比較(n=6)Tab.2 Comparison of UFE antithrombin activity (n=6)

2.2 不同部位來源的UFE活性差異驗證

2.2.1 UFE抗凝血酶活性 比較不同部位UFE的凝血酶原時間和凝血酶時間可知其抗凝血酶活性.UFE抗凝血酶活性的比較，如表2所示.表2中：tP,tT分別為凝血酶原時間和凝血酶時間；相比標準血漿， “**”表示P<0.01；相比乏AT-Ⅲ血漿，“a”表示P<0.05，“aa”表示P<0.01；相比乏HC-Ⅱ血漿，“bb”表示P<0.01.由表2可知：加入B批UFE后，標準血漿、乏AT-Ⅲ及乏HC-Ⅱ血漿的凝血酶原時間和凝血酶時間均極顯著延長(P<0.01)；加入A批UFE后，標準血漿和乏HC-Ⅱ血漿的凝血酶時間極顯著性延長(P<0.01)，而乏AT-Ⅲ血漿的凝血酶時間和凝血酶原時間顯著延長(P<0.05)；加入C批UFE的作用不顯著.同時，分析數(shù)據(jù)可知，在相同條件下，UFE對凝血酶時間的作用更為明顯，凝血酶時間大于凝血酶原時間.

2.2.2 UFE對血漿凝血因子活性的影響 UFE對血漿凝血因子活性的影響結果，如表3所示.表3中：對照組、肝素鈉組、UFE組A批、UFE組B批、UFE組C批的纖維蛋白原(FIB)的質量濃度分別為(2.69±0.20)，(2.09±0.19)，(2.37±0.21)，(2.23±0.34),(2.49±0.26) g·L-1，與對照組相比，肝素鈉組與3批UFE組的FIB質量濃度均低于對照組，未達顯著水平，且不具有統(tǒng)計學意義；相比對照組，“*”表示P<0.05，“**”表示P<0.01；相比肝素鈉組，“a”表示P<0.05，“aa”表示P<0.01.由表3可知：UFE組B批能夠極顯著降低各凝血因子活性(P<0.01)，UFE組A批能夠極顯著降低除凝血因子Ⅱ之外的各凝血因子活性(P<0.01)，UFE組C批能夠顯著降低除凝血因子Ⅱ之外的各凝血因子活性(P<0.05).此外，與肝素鈉組相比，UFE組B批能夠極顯著地降低凝血因子Ⅱ，Ⅺ的活性(P<0.01)，對其他因子不具有統(tǒng)計學意義.

凝血因子凝血因子活性對照組肝素鈉組UFE組A批UFE組B批UFE組C批因子Ⅱ102.37±5.1853.66±6.85**89.85±5.05aa74.32±5.09**aa97.63±5.19aa因子Ⅴ101.13±6.7538.13±5.92**59.48±6.35**44.86±7.73**83.25±6.82*因子Ⅶ100.53±8.5652.17±7.10**70.37±7.49**56.97±7.67**82.85±7.30*因子Ⅷ102.08±8.0451.12±6.43**58.20±6.64**48.64±6.39**69.93±7.45*因子Ⅸ101.39±5.4634.07±4.83**60.18±5.02**aa49.07±6.84**67.39±6.84*因子Ⅹ103.07±2.4748.14±5.86**65.04±5.33**56.69±6.08**88.27±8.52*因子Ⅺ101.74±5.0728.08±6.14**57.62±6.81**aa45.67±5.89**aa65.33±4.68*因子Ⅻ102.66±8.1323.06±7.61**30.09±7.47**a27.64±8.73**48.41±8.91**aa

圖4 UFE對大鼠體外復鈣凝血時間的影響Fig.4 Effect of UFE on recalcification time of rat calcium in vitro

2.2.3 UFE對大鼠血體外復鈣凝血時間的影響 UFE對大鼠血體外復鈣凝血時間的影響,如圖4所示.圖4中：ρ(CaCl2)為氯化鈣的質量濃度.由圖4可知：與對照組相比，加入不同質量濃度的氯化鈣溶液的肝素鈉組均能明顯延長凝血時間；相較于對照組，UFE組B批對延長凝血時間的影響最顯著，UFE組A批延長凝血時間的效果弱于UFE組B批，強于UFE組C批；加入10 mg·mL-1氯化鈣的各組延長凝血時間作用均強于3 mg·mL-1的氯化鈣的實驗組，說明氯化鈣的質量濃度越高，延長作用越強，凝血時間越長.

2.2.4 UFE對大鼠血液中鈣離子濃度的影響 UFE對大鼠血液中鈣離子濃度的影響，如表4所示.表4中：c(Ca2+)表示鈣離子濃度；相比對照組，“**”表示P<0.01；相比肝素鈉組，“aa”表示P<0.01.由表4可知：UFE能夠降低血液中鈣離子的濃度， 并存在濃度依賴關系，濃度越高，作用越顯著； 與對照組相比，各批UFE組能夠極顯著地降低大鼠血液中鈣離子的濃度(P<0.01)，肝素鈉組未達到顯著水平(P>0.05)；不同質量濃度的UFE降低作用不同，UFE組B批(4，16 mg·mL-1)、UFE組A批(16 mg·mL-1)作用極顯著(P<0.01)，對鈣離子的降低作用強于肝素鈉組；3批UFE作用各異，UFE組B批對大鼠血液中鈣離子濃度的影響最大.

表4 UFE對大鼠血液中鈣離子濃度的影響(n=6)Tab.4 Effect of UFE on calcium ionconcentration in rat blood (n=6)

3 討論

單環(huán)刺螠的體壁、消化道和體腔液中均含有豐富的氨基酸，并包含人體需要的各種必需氨基酸[8-11].現(xiàn)有文獻報道中關于單環(huán)刺螠纖溶酶的來源部位各異，而具有針對性的抗凝機制研究鮮有報道，極大限制了UFE的精準開發(fā)與應用.該實驗對不同部位纖溶酶的分離純化及活性的對比研究，驗證了前期針對纖溶酶在體內積累規(guī)律研究所獲得的結果.單環(huán)刺螠生殖細胞年周期發(fā)育分為增殖期、生長期、成熟期、排放期和休止期，單環(huán)刺螠的小生殖期為9月中旬至10月中旬(秋季)，生殖細胞的發(fā)生主要在體腔液中進行[12-14].該實驗發(fā)現(xiàn)秋季單環(huán)刺螠體腔液中纖溶酶的總蛋白質量豐富，故有待進一步研究單環(huán)刺螠生殖細胞發(fā)育階段對機體內環(huán)境的影響.該實驗還發(fā)現(xiàn)，UFE能顯著降低血漿部分凝血因子的活性，推測UFE可能與AT-Ⅲ結合，引起AT-Ⅲ構象的改變，使AT-Ⅲ更易與凝血因子結合，從而滅活或抑制凝血因子的活性；對HT-Ⅱ產生鈍化作用，使降低血漿中的凝血因子Ⅱ的作用較小.Ca2+是內環(huán)境平衡必不可少的活性離子，Ca2+作為凝血因子Ⅳ在凝血過程中發(fā)揮著重要作用[15].本研究進一步驗證UFE可通過降低血液中Ca2+的濃度來延長大鼠血復鈣凝血時間.

通過對比不同部位提取的UFE對AT-Ⅲ、HT-Ⅱ、凝血因子和鈣離子的影響可知，體腔液、體壁肌、內臟中的UFE在凝血作用機制方面的效應強度各不相同，體腔液中提取的UFE作用最強；比較不同部位來源的單環(huán)刺螠纖溶酶在總蛋白質量、活性作用方面的差異，初步證實體腔液中UFE總蛋白質量最多，且活性優(yōu)于體壁肌及內臟中所得酶，可以彌補UFE質量穩(wěn)定性的不足.實驗隨機選擇多個單環(huán)刺螠的不同部位進行參數(shù)比較，后續(xù)工作可增加每一部位的陰性對照來研究每個部位的專屬性.