李 強(qiáng)， 朱清亮， 張海龍， 鄧明明， 胡 慶， 王紫潔

西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 消化內(nèi)科， 四川 瀘州 646000

肝硬化作為一種主要的慢性肝臟疾病，具有高發(fā)病率和死亡率[1]。肝硬化患者易并發(fā)食管胃底靜脈曲張破裂出血，治療上常采用藥物、內(nèi)鏡、經(jīng)頸靜脈肝內(nèi)門體分流術(shù)(TIPS)等治療手段[2]。研究[3-4]發(fā)現(xiàn)肝硬化患者的腸道菌群豐度及多樣性降低，且自身腸道菌群與臨床預(yù)后也具有相關(guān)性，主要為變形菌門中的腸桿菌科、彎曲菌科和巴斯德菌科，厚壁菌門中的腸球菌科和鏈球菌科[5]。近年來肝硬化患者TIPS后相關(guān)并發(fā)癥降低[6-7]，而TIPS后的腸道菌群改變并不清楚。猜想肝硬化患者TIPS后腸道血運(yùn)重建，腸道黏膜循環(huán)改善，對(duì)腸道菌群產(chǎn)生影響。因此，通過高通量測(cè)序方法分析肝硬化患者TIPS前后腸道菌群變化，揭示肝硬化患者腸道菌群特征。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象 選取2018年7月-2019年7月因肝硬化失代償期門靜脈高壓伴食管胃底靜脈曲張破裂出血或(和)難治性腹水、脾功能亢進(jìn)于本院進(jìn)行TIPS的18例患者。肝硬化診斷參考中華醫(yī)學(xué)會(huì)消化病學(xué)分會(huì)制定的《臨床診療指南-消化疾病分冊(cè)》[8]，并根據(jù)病史、臨床表現(xiàn)及輔助檢查(CT及B超)確診。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)入院時(shí)為危重患者、重癥感染、最近1周大量使用過抗生素者；(2)老年患者(>75歲)，合并嚴(yán)重并發(fā)癥(心、肺、腎等重要臟器)者；(3)既往存在原發(fā)胃腸道疾病、消化系統(tǒng)腫瘤、自身免疫性疾病者；(4)TIPS禁忌證者；(5)正在服用益生菌者。本研究方案經(jīng)西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(批號(hào)：KY2019044)，所有參與者都收到了有關(guān)研究的信息并簽署知情同意書。

1.2 研究方法 前期準(zhǔn)備相關(guān)資料及采集糞便的耗材，于手術(shù)前(F0期)常規(guī)收集糞便(3 g)，并在術(shù)后1個(gè)月(F1期)、術(shù)后3個(gè)月(F3期)常規(guī)隨訪檢查時(shí)同步收集患者的糞便，糞便采集選用標(biāo)準(zhǔn)采集器(深圳微科服科技有限公司提供)，將糞便分別保存于-80 ℃冰箱。同時(shí)收集患者術(shù)前及術(shù)后肝功能[ALT、AST、Alb、TBil、DBil、總膽汁酸(TBA)、GGT]和凝血檢驗(yàn)結(jié)果[PT、部分凝血酶時(shí)間(APTT)、PTA、纖維蛋白原(FIB)]。隨訪患者18例，術(shù)前采集糞便18例，術(shù)后第1個(gè)月采集糞便6例，術(shù)后第3個(gè)月采集糞便9例。因患者門診隨訪時(shí)采集糞便困難，部分患者沒有在隨訪同時(shí)采集到糞便，部分患者也未能在3個(gè)時(shí)期同時(shí)采集糞便。

1.3 糞便微生物DNA提取、鑒定以及16S rRNA基因測(cè)序 實(shí)驗(yàn)共收集樣本33例，根據(jù)E.Z.N.A.?soil試劑盒 (美國(guó)，Omega Bio-tek)說明書進(jìn)行總DNA抽提，NanoDrop2000檢測(cè)DNA濃度和純度，利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA提取質(zhì)量；選用338F (5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′)和806R (5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′) 引物對(duì)V3-V4可變區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，2%瓊脂糖凝膠回收PCR產(chǎn)物，利用AxyPrep DNA Gel Extraction Kit (美國(guó)，Axygen Biosciences,) 純化，Tris-HCl洗脫，2%瓊脂糖電泳檢測(cè)及QuantiFluorTM-ST (美國(guó)，Promega) 定量檢測(cè)。根據(jù)Illumina MiSeq 平臺(tái) (美國(guó)，Illumina)將純化后的擴(kuò)增片段構(gòu)建PE 2*300文庫，采用Miseq PE300平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序。

2 結(jié)果

2.1 患者基本情況 18例患者中男14例，女4例。各組TBil水平比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=8.201，P=0.001)；F3顯著高于F1和F0，F(xiàn)1顯著高于F0(P值均<0.05)。各組TBA水平比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=39.482，P<0.001)；F1和F3顯著高于F0(P值均<0.05)(表1)。

表1 不同時(shí)間肝功能、凝血指標(biāo)比較

注：與F0 比較，1)P<0.05；與F1 比較，2)P<0.05。

2.2 物種的組成分析 在研究的糞便樣本中，包括術(shù)前F0期18例，F(xiàn)1期6例，F(xiàn)3期9例。相較于F0時(shí)期菌群組成，F(xiàn)1時(shí)期厚壁菌門增多，F(xiàn)3變形菌門增多，F(xiàn)1及F3時(shí)期放線菌門增加，而梭桿菌門減少，擬桿菌門變化不大(圖1)。

注：圖示檢測(cè)結(jié)果中相對(duì)豐度最高的20個(gè)菌群種類,相對(duì)豐度較低的物種被歸類其他。橫坐標(biāo)是分組名，縱坐標(biāo)表示注釋到該門水平的序列數(shù)目占總注釋數(shù)據(jù)的比率。

圖1各個(gè)分組在門水平上的相對(duì)分布情況

2.3 物種差異分析 對(duì)肝硬化患者3個(gè)時(shí)期糞便樣本進(jìn)行物種差異分析。不同時(shí)期菌群組成見表2。LEfSe差異判別分析方法(圖2)顯示在F0期表現(xiàn)的優(yōu)勢(shì)菌群有鏈球菌屬及鏈球菌(P值均=0.041)、布雷德菌屬(P=0.019)、羅氏菌屬(P=0.027)、放線菌科及放線菌屬(P值均=0.03)；在F1期表現(xiàn)的優(yōu)勢(shì)菌群有根瘤菌科(P=0.009)、雷爾氏菌屬(P=0.02)、腐螺旋菌科及腐螺旋菌屬(P值均=0.009)、SMB53(P=0.025)、Candidatus-Xiphinematobacter(P=0.009)、溶桿菌屬(P=0.009)、奇丁屬科(P=0.009)、沉積物桿菌屬(P=0.009)、柄桿菌科及柄桿菌屬(P值均=0.006)、創(chuàng)傷球菌屬(P=0.009)、毛螺菌屬(P=0.04)、羅斯式菌屬(P=0.02)、瘤胃球菌屬(P=0.043)、瘤胃菌科(P=0.01)；F3期表現(xiàn)的優(yōu)勢(shì)菌群有丁酸弧菌屬(P=0.02)、鞘氨醇單胞菌屬(P=0.003)、布勞特氏菌屬(P=0.03)、糞球菌屬(P=0.002)、芽殖菌屬(P=0.002)。

2.4 樣本Alpha多樣性指數(shù)統(tǒng)計(jì)分析 Alpha多樣性指數(shù)是對(duì)不同樣品中物種多樣性的分析。對(duì)所有樣本進(jìn)行Alpha分析(Chao1、Shannon、Simpson、Ace指數(shù))，研究顯示不同時(shí)期腸道菌群的物種多樣性分析差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均>0.05)(表3)。

表2不同時(shí)期菌群組成

門類F0(n=18)F1(n=6)F3(n=9)厚壁菌門鏈球菌屬、鏈球菌、布雷德菌屬羅斯氏菌屬、瘤胃菌科、瘤胃球菌屬、創(chuàng)傷球菌屬、SMB53、毛螺菌屬丁酸弧菌屬、布勞特氏菌屬、糞球菌屬擬桿菌門奇丁屬科、腐螺旋菌科、腐螺旋菌屬、沉積物桿菌屬芽殖菌屬變形菌門柄桿菌科、柄桿菌屬、雷爾氏菌屬、 溶桿菌屬、根瘤菌科鞘氨醇單胞菌屬疣微菌門Candidatus-Xiphinematobacter放線菌門羅氏菌屬、放線菌科、放線菌屬

表3 不同時(shí)期Alpha指數(shù)比較

注：Chao1指數(shù)及Ace指數(shù)用于估計(jì)物種總數(shù)，代表物種豐富度；Shannon指數(shù)及Simpson指數(shù)代表物種多樣性。

2.5 樣本Beta多樣性指數(shù)統(tǒng)計(jì)分析 Beta多樣性分析是對(duì)不同樣品間的微生物群落構(gòu)成進(jìn)行比較，采用近似F檢驗(yàn)，結(jié)果顯示F0 vs F1(F=2.603,P=0.02)、F0 vs F3(F=1.954,P=0.06)、F1 vs F3(F=0.420,P=0.87)中，僅F0 與 F1期菌群的多樣性差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.6 相關(guān)性熱圖分析 相關(guān)性熱圖分析用于分析臨床指標(biāo)與微生物群之間的相關(guān)性。收集患者術(shù)前的肝功能，血脂(HDL、LDL、TC、TG)，凝血指標(biāo)，血常規(guī)(Hb、WBC、PLT)，門靜脈壓力(PVP)，肌酐(CR)等指標(biāo)，繪制腸道菌群與術(shù)前檢驗(yàn)指標(biāo)的關(guān)系圖，其中與TIPS密切相關(guān)的指標(biāo)PVP在屬水平與雙歧桿菌屬﹑柯林斯菌屬﹑瘤胃球菌屬具有負(fù)相關(guān)性(r值分別為-0.35、-0.38、-0.34，P值分別為0.04、0.02、0.04)，與牛肝菌屬具有正相關(guān)性(r=0.41，P=0.015)，其他檢驗(yàn)指標(biāo)也與不同菌群亦存在相關(guān)性(P值均<0.05)(圖3)。

3 討論

近年來關(guān)于肝硬化與腸道菌群的研究較多，揭示了肝硬化患者腸道菌群變化[9-10]。目前有研究[11]顯示肝硬化患者擬桿菌門豐度降低，厚壁菌門及變形菌門豐度增加。其中肝硬化患者腸肝菌科、產(chǎn)堿桿菌科、鏈球菌科、韋榮式菌科和梭桿菌科的比例增高，同時(shí)擬桿菌門、瘤胃菌科和毛螺菌科的數(shù)量減少[12]，這些菌群的變化提示肝硬化患者菌群在組成方面確實(shí)發(fā)生了變化。另外，在肝性腦病患者中，有較高比例的韋榮式菌科、產(chǎn)堿桿菌科、葡萄球菌科、腸球菌科、紫單胞菌科和乳桿菌科，變形菌門，這些菌群與認(rèn)知水平低下相關(guān)[13-14]。在有益菌群方面，肝硬化患者歐白布拉提菌、糞腸桿菌、羅斯布里亞菌屬和多雷氏菌屬與減少炎癥及改善認(rèn)知有關(guān)[15]。因此，肝硬化患者腸道菌群變化或許揭示某種臨床意義。目前TIPS作為失代償期肝硬化治療的一種手段，臨床運(yùn)用增多，但關(guān)于TIPS前后腸道菌群的變化并不清楚。

本研究發(fā)現(xiàn)，TIPS 3個(gè)時(shí)期指標(biāo)中TBA、TBil存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，考慮其可能與TIPS后肝臟門靜脈灌注減少，支架損傷，支架壓迫小膽管等相關(guān)。而在腸道菌群方面，TIPS后1個(gè)月腸道血運(yùn)重建，腸道菌群發(fā)生明顯改變，以擬桿菌門及變形菌門的菌屬增多，菌群種類較TIPS前有所改善，但變形菌門的增多可能與肝性腦病相關(guān)，具體菌群的作用還需進(jìn)行研究。同時(shí)，TIPS后3個(gè)時(shí)期菌群Alpha多樣性變化無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，物種多樣性在術(shù)后變化不大，這可能與觀察的時(shí)間較短相關(guān)。但在Beta多樣性中，菌群結(jié)構(gòu)組成發(fā)生了變化。相較于F0期，F(xiàn)1期菌群組成增加，F(xiàn)3期相較于F0期無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.06)，可能與樣本量的多少有關(guān)。最后通過相關(guān)性熱圖分析，發(fā)現(xiàn)TIPS前各臨床指標(biāo)與腸道菌群具有相關(guān)性，但能否通過調(diào)節(jié)腸道菌群改善人體各功能指標(biāo)，以及具體的改善機(jī)制需要進(jìn)一步研究。因此，肝硬化患者TIPS后腸道菌群短期內(nèi)發(fā)生了改變，可能是TIPS影響了腸道菌群的改變。

腸道菌群與人體之間的相互作用是非常復(fù)雜的過程。但因腸道菌群種類繁多，功能不清，加之研究的樣本量較少，隨訪時(shí)間短等影響因素較多，未來需要擴(kuò)大樣本量進(jìn)一步探討。