陳興麟，李 麗，林河通

(1.自然資源部第三海洋研究所，福建 廈門 361005; 2.福建農(nóng)林大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，福建 福州 350002)

龍須菜(Gracilarialemaneiformis)是江蘺屬(Gracilaria)下的一個(gè)種。瓊膠是許多紅藻類植物合成的一種生物高聚物，是其細(xì)胞壁的主要成分[1]，在常溫環(huán)境下呈凝膠狀[2]。瓊膠及其他海藻細(xì)胞壁多糖具有的生理學(xué)功能與陸生植物的半纖維素類似，但具有更大的柔韌性，因此能耐受強(qiáng)烈的波浪和涌流[3-4]。細(xì)胞壁中的瓊膠不僅能幫助紅藻抵抗病菌侵染、干旱環(huán)境，維持細(xì)胞內(nèi)的離子平衡，還可以使紅藻能在更廣的溫度、鹽度和pH下生存[3, 5]。瓊膠寡糖的制備通常分為化學(xué)法和酶解法?；瘜W(xué)法的降解條件不易控制、容易帶來環(huán)境污染，并且產(chǎn)物不均一。而酶解法制備瓊膠寡糖，反應(yīng)條件溫和、能耗低。因?yàn)槊复呋哂袑Ｒ恍裕軌蜻x擇性地切斷糖苷鍵，因此降解產(chǎn)物也較為均一[6]。瓊膠寡糖由于分子量較小，水溶性比瓊膠多糖好，更有利于人體吸收，并具有一些獨(dú)特的生理功能，例如，較強(qiáng)的抗氧化活性[7]、改善人體腸道菌群[8-9]等，具有很強(qiáng)的開發(fā)潛力。腸道菌群對(duì)人體的健康有重要的作用，雖然目前在界定有益菌和有害菌的界線上仍然存在爭(zhēng)議，但是乳酸菌Lactobacillus普遍認(rèn)為是益生菌[10]，可以廣泛的應(yīng)用于食品工業(yè)，例如酸奶[11]、烘焙[12]和谷物制品[13]等。

微生物轉(zhuǎn)錄組是指微生物在某一時(shí)刻所轉(zhuǎn)錄出的所有RNA的總和，可以進(jìn)一步揭示微生物在特定條件下基因的動(dòng)態(tài)表達(dá)與調(diào)控[14]。通過比較微生物在不同環(huán)境、不同刺激物作用下轉(zhuǎn)錄組的差異，可以研究其基因表達(dá)的變化，進(jìn)而研究環(huán)境及刺激物對(duì)微生物的影響及作用機(jī)理[15]。轉(zhuǎn)錄組通常以RNA-seq進(jìn)行測(cè)序，即通過反轉(zhuǎn)錄酶將樣品中的RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，再通過構(gòu)建cDNA測(cè)序文庫進(jìn)行測(cè)序，從而獲得相應(yīng)的RNA序列信息及表達(dá)量[16]。基因本體(gene ontology，GO)是一套國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)化的基因功能描述的分類系統(tǒng)，是生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域最成功的本體之一[17]。GO可分為三大類，即生物過程(biological process，BP)，分子功能(molecular function，MF)和細(xì)胞組分(cellular component，CC)，分別用來描述基因編碼的產(chǎn)物所參與的生物過程、所具有的分子功能及所處的細(xì)胞環(huán)境[18]。GO注釋是將一個(gè)基因和一個(gè)GO條目聯(lián)系起來，每個(gè)條目有唯一的標(biāo)示符(由“GO：”加上7個(gè)數(shù)字組成)。目前，GO已經(jīng)廣泛應(yīng)用在基因集合富集分析、基因功能比較與分析、蛋白質(zhì)互作預(yù)測(cè)[19-20]和帕金森疾病的研究[21]等諸多領(lǐng)域。

福建省是中國(guó)龍須菜生產(chǎn)大省，龍須菜最主要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值是提取瓊膠。而由瓊膠進(jìn)一步降解而成的寡糖，具有更多的生理活性以及更高的價(jià)值。通過制備寡糖可以實(shí)現(xiàn)龍須菜產(chǎn)業(yè)鏈的高值化利用。本研究以深海瓊膠酶制備的海藻寡糖為試驗(yàn)物，檢測(cè)其促乳酸菌Lactobacillusplantarum增長(zhǎng)的效果，并通過對(duì)乳酸菌轉(zhuǎn)錄組的測(cè)序來研究其促生長(zhǎng)機(jī)理，進(jìn)一步拓展海藻寡糖的應(yīng)用領(lǐng)域，也為海洋生物制品在食品營(yíng)養(yǎng)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用基礎(chǔ)研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

新瓊四糖(NA4)、新瓊六糖(NA6)由本課題組利用深海瓊膠酶，通過酶解瓊膠制備而成，純化后純度達(dá)95%以上；混合寡糖(NAOS)由本課題組以深海細(xì)菌Flammeovirgasp.OC4發(fā)酵龍須菜制得，為新瓊二糖、瓊膠三糖、新瓊四糖、瓊膠五糖、新瓊六糖的混合物；低聚果糖(FOS)購(gòu)自成都艾科達(dá)化學(xué)試劑有限公司；低聚木糖(XOS)購(gòu)自源葉生物科技有限公司；葡萄糖(GLC)購(gòu)自Sigma公司；乳酸菌Lactobacillusplantarum由本課題組前期從酸奶中分離得到。

1.2 培養(yǎng)基

MRS肉湯培養(yǎng)基：Peptone 1%(質(zhì)量分?jǐn)?shù)，下同)，Beef extract 0.8%，Yeast Extract 0.4%，葡萄糖 2%，K2HPO40.2%，檸檬酸二銨 0.2%，乙酸鈉 0.5%，MgSO40.002%，MnSO40.000 4%，Tween-80 0.01%。

2×MRS肉湯培養(yǎng)基：Peptone 2%，Beef extract 1.6%，Yeast Extract 0.8%，葡萄糖 4%，K2HPO40.4%，檸檬酸二銨 0.4%，乙酸鈉 1.0%，MgSO40.004%，MnSO40.000 8%，Tween-80 0.02%。

1.3 主要儀器及試劑盒

全自動(dòng)生長(zhǎng)曲線分析儀Bioscreen C(MBR, Oy Growth Curves Ab Ltd)；Total RNA Extractor(Trizol)試劑盒(上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司)；Epicenter Ribo-zero magnetic kit(bacteria)購(gòu)自Epicenter公司；VAHTSTMmRNA-seq V2 Library Prep Kit for Illumina?、VAHTSTMDNA Clean Beads購(gòu)自南京諾唯贊生物科技有限公司。

1.4 方法

1.4.1 乳酸菌種子液的培養(yǎng) 將添加了1.5%瓊脂的MRS肉湯培養(yǎng)基于118 ℃滅菌15 min，然后制備MRS平板。將乳酸菌Lactobacillusplantarum在平板上劃線培養(yǎng)，取單菌落接種于MRS肉湯培養(yǎng)基中，37 ℃搖培20 h，4 ℃保存待用。另外，取部分菌液，于100 ℃煮沸30 min，作為滅活菌體對(duì)照。

1.4.2 各種寡糖促乳酸菌增長(zhǎng)的效果 Bioscreen C可裝載2個(gè)檢測(cè)板，每個(gè)檢測(cè)板有100個(gè)孔(10×10)，每個(gè)孔分別裝載100 μL的培養(yǎng)系統(tǒng)，包含：50 μL的滅菌2×MRS肉湯培養(yǎng)基，5 μL乳酸菌保存液(對(duì)照組為滅活液)，相應(yīng)濃度的各種寡糖和雙蒸水(double distilled water，ddw)。各寡糖液均提前經(jīng)過了0.22 μm微孔濾膜過濾除菌，適量加入使體系終濃度分別為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 g/L。如表1所示，101～200號(hào)在第一個(gè)檢測(cè)板上，201～224號(hào)在第二個(gè)檢測(cè)板上。根據(jù)加入寡糖種類的不同，一共可以分為7個(gè)組。第一組(101～120號(hào))添加的寡糖為NAOS。第二組(121～140號(hào))和第三組(141～160號(hào))添加的寡糖分別為NA4和NA6。第四組(161～180號(hào))、第五組(181～200號(hào))、第六組(201～220號(hào))添加的寡糖分別為FOS、XOS和GLC。第七組(221～224號(hào))為對(duì)照組，不額外添加任何寡糖。兩個(gè)檢測(cè)板同時(shí)放入全自動(dòng)生長(zhǎng)曲線分析儀(Bioscreen C)中，37 ℃水平搖培48 h，每2 h采集一次OD600值數(shù)據(jù)。

表1 乳酸菌Lactobacillus plantarum生長(zhǎng)速率實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

續(xù)表1

注：“*”表示空白對(duì)照：加入滅活菌體；“**”表示陰性對(duì)照：加入適量ddw替代寡糖液。

1.4.3 乳酸菌RNA的提取 如表2所示，設(shè)置5個(gè)處理組，每組2個(gè)重復(fù)，分別為：4H組，添加NA4至終濃度為0.6 g/L；6H組，添加NA6至終濃度為0.6 g/L；4L組，添加NA4至終濃度為0.2 g/L；6L組，添加NA6至終濃度為0.2 g/L；C組，不添加寡糖。分別取500 μL乳酸菌種子液，12 100 r/min離心去除上清，然后用100 μL ddw重懸菌體后，吸取100 μL菌液加入裝有5 mL培養(yǎng)基的試管中，37 ℃搖培12 h?？瞻捉M添加等量的100 μL ddw。待搖培結(jié)束后，馬上收集菌體，用Total RNA Extractor(Trizol)試劑盒提取RNA。

表2 Lactobacillus plantarum的培養(yǎng)條件及分組情況

1.4.4 乳酸菌轉(zhuǎn)錄組的測(cè)序與分析 依次用Epicenter Ribo-zero magnetic kit(bacteria)試劑盒純化RNA，用VAHTSTMmRNA-seq V2 Library Prep Kit for Illumina?試劑盒構(gòu)建測(cè)序文庫，將構(gòu)建好的文庫在Illumina HiSeq X-ten測(cè)序平臺(tái)完成測(cè)序，測(cè)序模式為2×150 bp雙端測(cè)序。將測(cè)序儀得到的原始圖像數(shù)據(jù)文件，通過CASAVA堿基識(shí)別(base calling)分析轉(zhuǎn)化為原始測(cè)序序列(sequenced reads)，即為Raw Data，以 FASTQ文件格式存儲(chǔ)。對(duì)測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)量進(jìn)行可視化評(píng)估，并使用Trimmomatic進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，依次去除帶N堿基的序列、reads中的接頭序列、Q值<20的低質(zhì)堿基。為避免測(cè)序產(chǎn)物為污染，隨機(jī)從Clean數(shù)據(jù)中抽取不低于9 800條序列與NCBI的NT數(shù)據(jù)庫進(jìn)行blastn比對(duì)，計(jì)算其物種分布。若與原始樣品一致，則進(jìn)行基因結(jié)構(gòu)、表達(dá)水平、表達(dá)差異等分析，并進(jìn)一步將差異表達(dá)基因進(jìn)行GO功能分類。

2 結(jié)果與討論

2.1 各種寡糖促乳酸菌增長(zhǎng)的效果

如圖1a所示，OD600值隨著NA4、FOS、NA6、NAOS、XOS和GLC濃度的升高而升高，達(dá)到最高值后，再提高濃度會(huì)導(dǎo)致OD600值的降低，此結(jié)果與Lu等(2015)的研究結(jié)果相似[22]。這可能是由于過高的寡糖濃度會(huì)產(chǎn)生較高的滲透壓，從而導(dǎo)致脫水作用而抑制菌株生長(zhǎng)。不同寡糖的最適作用濃度并不一致，因此本研究均選取促乳酸菌增長(zhǎng)效果最為顯著的濃度進(jìn)行進(jìn)一步分析，即0.4 g/L的GLC，0.8 g/L的NAOS，以及0.6 g/L的NA4、NA6、FOS、XOS。在各自的最適濃度下進(jìn)行比較，促乳酸菌增長(zhǎng)效果最好的依次是NA4、FOS、NA6、NAOS、XOS、GLC，它們效果都好于對(duì)照組(圖1b)。由于MRS肉湯培養(yǎng)基中已經(jīng)含有GLC，額外的添加量產(chǎn)生的促生長(zhǎng)效果有限。而其余各種寡糖顯示了更好的促乳酸菌增長(zhǎng)效果，說明不同的寡糖之間存在著協(xié)同增效作用。FOS被認(rèn)為是一種重要的益生元，但在相同濃度下，NA4有著更好的促增長(zhǎng)效果，說明NA4有進(jìn)一步作為健康食品的應(yīng)用潛力。

為了比較不同種類寡糖的促增長(zhǎng)作用，通常需要先確定各自寡糖的最適作用濃度。根據(jù)傳統(tǒng)方法，通常是比較一段時(shí)間內(nèi)的OD600值的高低，選取數(shù)值高的濃度為合適的作用濃度[22]。但這不夠嚴(yán)謹(jǐn)。如圖1b所示，盡管在48 h時(shí)XOS和GLC組的OD600值一致，但從整體生長(zhǎng)曲線上看XOS卻是更好的生長(zhǎng)促進(jìn)劑。值得注意的還有，在不同實(shí)驗(yàn)組中達(dá)到OD600值最高點(diǎn)的時(shí)間并不一致，如FOS組用了26 h，而NA4組只需要20 h。因此，最優(yōu)選濃度應(yīng)該是通過測(cè)定不同組別生長(zhǎng)曲線的最高點(diǎn)來確定。本實(shí)驗(yàn)中，通過Bioscreen C每2 h測(cè)定一次OD600值，同時(shí)篩選124組不同條件下乳酸菌的生長(zhǎng)曲線，從而盡可能的消減誤差值。相比于傳統(tǒng)的搖瓶或試管培養(yǎng)，此方法所需的寡糖用量很小，可以在不進(jìn)行大規(guī)模純化的情況下研究寡糖促乳酸菌的增長(zhǎng)效果。

圖1 寡糖促乳酸菌Lactobacillus plantarum的增長(zhǎng)效果

2.2 乳酸菌RNA的提取

由于相比于NAOS，NA4和NA6成分單一、促乳酸菌增長(zhǎng)的效果較好。而相比于FOS及XOS，其相關(guān)研究較少。故選取NA4和NA6做進(jìn)一步研究。設(shè)置了4H組，它的NA4濃度為促乳酸菌生長(zhǎng)效果最好的0.6 g/L。設(shè)置了6H組，它的NA6濃度也為促乳酸菌生長(zhǎng)效果最好的0.6 g/L，以及4L組和6L組，處于三分之一的最適濃度下。在試管中培養(yǎng)12 h后，提取各自乳酸菌RNA。如圖2所示，提取的Total RNA條帶清晰，且大部分集中在1 000 bp以下的區(qū)域，符合后續(xù)實(shí)驗(yàn)的要求。

圖2 乳酸菌Lactobacillus plantarum的RNA提取

2.3 RNA-seq測(cè)序數(shù)據(jù)分析

本次實(shí)驗(yàn)中，每一組高通量測(cè)序獲得的原始測(cè)序總數(shù)據(jù)量都在4.55 Gb以上，其中堿基質(zhì)量值在Q10(識(shí)別正確率為90%)的比例均在99.93%以上，質(zhì)量值在Q30(識(shí)別正確率為99.9%)的比例也都高于94.39%。經(jīng)過一系列嚴(yán)格的校正和過濾后，各組得到的高質(zhì)量reads數(shù)在3 098萬條與3 949萬條之間，平均讀長(zhǎng)在145 bp以上。經(jīng)校正后的各組數(shù)據(jù)堿基質(zhì)量值在Q10的比例均達(dá)到99.99%以上，Q30的比例也都在97.23%以上。各組的GC含量相對(duì)一致，都在45.07%與45.66%之間，符合物種內(nèi)GC含量相對(duì)一致的規(guī)律。綜上所述，本次高通量測(cè)序的數(shù)據(jù)在測(cè)序深度和準(zhǔn)確度上符合做進(jìn)一步分析的要求。

為進(jìn)一步確認(rèn)樣品無污染，隨機(jī)從高質(zhì)量數(shù)據(jù)中抽取不低于9 800條序列進(jìn)行比對(duì)分析，比對(duì)結(jié)果如表3所示。從表中可以看出，各組之間的序列的比對(duì)結(jié)果較為一致，序列比對(duì)上的前7個(gè)物種分別是Lactobacillusplantarum，Lactobacilluspentosus，Lactobacillusparacasei，Lactobacillusbuchneri，Lactobacillusphage，Lactobacillushelveticus，Lactobacillusparaplantarum，都是乳桿菌屬。其中，97%以上的序列比對(duì)結(jié)果為L(zhǎng)actobacillusplantarum，與實(shí)驗(yàn)室前期菌株鑒定結(jié)果一致，說明檢測(cè)結(jié)果符合預(yù)期。

2.4 主成分分析

主成分分析(principal component analysis, PCA)被廣泛用于處理多維度的基因表達(dá)數(shù)據(jù)[23]。隨著高通量測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，海量的組學(xué)數(shù)據(jù)越來越多的出現(xiàn)，需要使用PCA對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行降維處理，使結(jié)果可視化，更好的闡明其生物學(xué)機(jī)理[24]。為對(duì)各組樣品的表達(dá)情況做一整體分析，采用PCA方法對(duì)其進(jìn)行可視化處理(圖3)。如圖所示，除了4L1和4L2組內(nèi)差異較大，其他的各組都按照其生物學(xué)重復(fù)聚集至相對(duì)較近的位置，說明試驗(yàn)重復(fù)性較好。各組之間分散至立方體的不同位置，說明寡糖的添加確實(shí)對(duì)其生理代謝產(chǎn)生了一定的影響。

表3 不同實(shí)驗(yàn)組序列的blastn比對(duì)結(jié)果

圖3 各樣本主成分分析

2.5 組間差異表達(dá)基因分析

基因表達(dá)水平的直接體現(xiàn)就是其轉(zhuǎn)錄的豐度情況，轉(zhuǎn)錄的豐度越高，則基因表達(dá)水平越高[25]。在RNA-seq分析中，我們可以通過定位到基因組區(qū)域或基因外顯子區(qū)的測(cè)序序列(reads)的計(jì)數(shù)來估計(jì)基因的表達(dá)水平。Reads計(jì)數(shù)除了與基因的真實(shí)表達(dá)水平成正比外，還與基因的長(zhǎng)度和測(cè)序深度成正相關(guān)。為了使不同實(shí)驗(yàn)組、不同基因之間的基因表達(dá)水平具有可比性，需要對(duì)各基因的表達(dá)情況進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化[26-27]。有研究表明，一些數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化方法，如RPKM等，反而使誤差加大，從而對(duì)診斷的結(jié)果產(chǎn)生不利影響[28]。目前，許多研究采用TPM(transcripts per million)來計(jì)量在RNA池中某個(gè)基因轉(zhuǎn)錄的比例[29]。TPM同時(shí)考慮了測(cè)序深度和基因長(zhǎng)度以及不同樣本對(duì)reads計(jì)數(shù)的影響，是常用的基因表達(dá)水平估算方法。TPM計(jì)算公式[30]如下：

(1)

(2)

式(1、2)中：gl為基因外顯子長(zhǎng)度(gene length)，readl為引入的均一化長(zhǎng)度值(默認(rèn)為1 000)，nr為比對(duì)到該基因上的序列數(shù)(number of reads)，G為求和符號(hào)的上界，即所有基因，T為求和值。

為了揭示不同處理對(duì)乳酸菌的基因表達(dá)的影響，利用DEGseq軟件分析不同處理組(TPM-E)和對(duì)照組(TPM-C)樣本間的差異表達(dá)基因(differentially expressed genes, DEGs)。篩選的差異表達(dá)基因必須達(dá)到以下2個(gè)要求：(i)log2(TPM-E/TPM-C)>1，即差異表達(dá)倍數(shù)至少為2倍；(ii)pValue<0.05。在本研究中，我們把在各處理組上調(diào)表達(dá)的基因定義為“上調(diào)基因”，相反地，在各處理組下調(diào)表達(dá)的基因即為“下調(diào)基因”。

如圖4所示，4L組對(duì)比C組，有13個(gè)基因表達(dá)上調(diào)，22個(gè)基因表達(dá)下調(diào)。而隨著NA4濃度的增高，4H組比C組，表達(dá)上調(diào)的基因增加至27個(gè)，表達(dá)下調(diào)的基因增加至28個(gè)。這說明隨著NA4濃度增加至最適促生長(zhǎng)濃度，其對(duì)乳酸菌Lactobacillusplantarum的生理代謝產(chǎn)生的影響逐步加大。而6L組和6H組也呈現(xiàn)出類似的趨勢(shì)。6L組對(duì)比C組，有2個(gè)基因表達(dá)上調(diào)，12個(gè)基因表達(dá)下調(diào)。當(dāng)NA6的濃度增加到0.6 g/L，表達(dá)上調(diào)的基因增加至18個(gè)，表達(dá)下調(diào)的基因仍為12個(gè)。如果NA4和NA6對(duì)比，NA4帶給乳酸菌生理的影響更大，當(dāng)我們比較相同濃度下乳酸菌的代謝情況時(shí)發(fā)現(xiàn)，濃度為0.2 g/L時(shí)，4L組比6L組，上調(diào)基因有9個(gè)，下調(diào)基因有1個(gè)。這可能是因?yàn)镹A4分子量小，更容易被乳酸菌吸收。因此，這和前述實(shí)驗(yàn)檢測(cè)的乳酸菌生長(zhǎng)曲線，NA4有較好的促生長(zhǎng)能力規(guī)律一致。

圖4 不同組之間差異表達(dá)基因統(tǒng)計(jì)

2.6 差異表達(dá)基因的功能注釋

2.6.1 4H組差異表達(dá)基因的注釋 在對(duì)篩選出的DEGs相應(yīng)蛋白進(jìn)行GO功能注釋分析中，利用topGO完成GO富集分析并繪制顯著性GO有向無環(huán)圖。GO分析結(jié)果顯示，在55個(gè)DEGs中，有31個(gè)基因至少能關(guān)聯(lián)到MF的一個(gè)GO功能條目，有24個(gè)基因至少能關(guān)聯(lián)到CC的一個(gè)GO功能條目，以及27個(gè)基因至少能關(guān)聯(lián)到BP的一個(gè)GO功能條目。基于GO二級(jí)分類的功能分類，已注釋的差異表達(dá)基因可以劃分為19個(gè)二級(jí)小類(圖5)，它們隸屬于BP、MF及CC這三個(gè)分支。在MF中，基因數(shù)目最多的類別是“催化活性”(catalytic activity)，該分類包括了22個(gè)差異表達(dá)基因，其次是“結(jié)合作用”(binding)，其包含了17個(gè)差異表達(dá)基因，排在第三位的是“轉(zhuǎn)運(yùn)活性”(transporter activity)，共有9個(gè)DEGs；在CC分支中，細(xì)胞相關(guān)組分(cell，cell part)和細(xì)胞膜組分(membrane)是DEGs對(duì)應(yīng)的蛋白活動(dòng)的兩大主要場(chǎng)所；在BP分支中，“細(xì)胞內(nèi)過程”(cellular process)、“代謝過程”(metabolic process)和“單組織過程”(single-organism process)這三個(gè)類別所占比例最多。

圖5 4H組和C組轉(zhuǎn)錄組間差異表達(dá)基因的GO二級(jí)分類統(tǒng)計(jì)

2.6.2 6H組差異表達(dá)基因的注釋 GO分析結(jié)果顯示，在30個(gè)差異表達(dá)基因中，有16個(gè)基因至少能關(guān)聯(lián)到MF的一個(gè)GO功能條目，有17個(gè)基因至少能關(guān)聯(lián)到CC的一個(gè)GO功能條目，以及15個(gè)基因至少能關(guān)聯(lián)到BP的一個(gè)GO功能條目?；贕O二級(jí)分類的功能分類，已注釋的DEGs可以劃分為17個(gè)二級(jí)小類(圖6)，它們隸屬于BP、MF及CC這3個(gè)分支。在MF分支中，基因數(shù)目最多的類別是“催化活性”(catalytic activity)，該分類包括了13個(gè)DEGs，其次是“結(jié)合作用”(binding)，其包含了10個(gè)DEGs，排在第三位的是“轉(zhuǎn)運(yùn)活性”(transporter activity)，共有6個(gè)DEGs；在CC分支中，細(xì)胞相關(guān)組分(cell，cell part)和細(xì)胞膜組分(membrane)是DEGs對(duì)應(yīng)的蛋白活動(dòng)的兩大主要場(chǎng)所；在BP分支中，“細(xì)胞內(nèi)過程”(cellular process)、“代謝過程”(metabolic process)和“單組織過程”(single-organism process)這3個(gè)類別所占比例最多。

2.6.3 4L組差異表達(dá)基因的注釋 GO分析結(jié)果顯示，在35個(gè)DEGs中，有25個(gè)基因至少能關(guān)聯(lián)到MF的一個(gè)GO功能條目，有21個(gè)基因至少能關(guān)聯(lián)到CC的一個(gè)GO功能條目，以及21個(gè)基因至少能關(guān)聯(lián)到BP的一個(gè)GO功能條目?；贕O二級(jí)分類的功能分類，已注釋的DEGs可以劃分為21個(gè)二級(jí)小類(圖7)，它們隸屬于BP、MF及CC這3個(gè)分支。在MF分支中，基因數(shù)目最多的類別是“結(jié)合作用”(binding)，其包含了18個(gè)DEGs，其次是“催化活性”(catalytic activity)，該分類包括了14個(gè)DEGs，排在第三位的是“結(jié)構(gòu)分子活性”(structural molecule activity)，共有6個(gè)DEGs；在CC分支中，細(xì)胞相關(guān)組分(cell，cell part)和細(xì)胞膜組分(membrane)是DEGs對(duì)應(yīng)的蛋白活動(dòng)的兩大主要場(chǎng)所；在BP分支中，“細(xì)胞內(nèi)過程”(cellular process)、“代謝過程”(metabolic process)和“單組織過程”(single-organism process)這3個(gè)類別所占比例最多。

圖6 6H組和C組轉(zhuǎn)錄組間差異表達(dá)基因的GO二級(jí)分類統(tǒng)計(jì)

圖7 4L組和C組轉(zhuǎn)錄組間差異表達(dá)基因的GO二級(jí)分類統(tǒng)計(jì)

2.6.4 6L組差異表達(dá)基因的注釋 GO分析結(jié)果顯示，在14個(gè)DEGs中，有8個(gè)基因至少能關(guān)聯(lián)到MF的一個(gè)GO功能條目，有6個(gè)基因至少能關(guān)聯(lián)到CC的一個(gè)GO功能條目，以及5個(gè)基因至少能關(guān)聯(lián)到BP的一個(gè)GO功能條目?；贕O二級(jí)分類的功能分類，已注釋的DEGs可以劃分為17個(gè)二級(jí)小類(圖8)，它們隸屬于BP、MF及CC這三個(gè)分支。在MF分支中，基因數(shù)目最多的類別是“結(jié)合作用”(binding)，其包含了6個(gè)DEGs，其次是“催化活性”(catalytic activity)，該分類包括了4個(gè)DEGs，排在第三位的是“結(jié)構(gòu)分子活性”(structural molecule activity)，共有3個(gè)DEGs；在CC分支中，細(xì)胞相關(guān)組分(cell，cell part)和細(xì)胞膜組分(membrane)等是DEGs對(duì)應(yīng)的蛋白活動(dòng)的兩大主要場(chǎng)所；在BP中，“細(xì)胞內(nèi)過程”(cellular process)、“代謝過程”(metabolic process)和“單組織過程”(single-organism process)這三個(gè)類別所占比例最多。

圖8 6L組和C組轉(zhuǎn)錄組間差異表達(dá)基因的GO二級(jí)分類統(tǒng)計(jì)

2.6.5 討論 從各組DEGs的GO注釋結(jié)果來看，有著極大的相似性。在CC分支中，各組注釋到的最相關(guān)條目均為“細(xì)胞相關(guān)組分”和“細(xì)胞膜組分”；在BP分支中，各組注釋到的最相關(guān)條目均為“細(xì)胞內(nèi)過程”、“代謝過程”、“單組織過程”。而在MF分支中，發(fā)現(xiàn)當(dāng)處于最佳促生長(zhǎng)的寡糖濃度時(shí)(即4H組和6H組)，DEGs數(shù)目最多的類別依次為“催化活性”、“結(jié)合作用”、“轉(zhuǎn)運(yùn)活性”；而當(dāng)寡糖濃度較低時(shí)(即4L組和6L組)，DEGs數(shù)目最多的類別則變?yōu)椤敖Y(jié)合作用”、“催化活性”、“結(jié)構(gòu)分子活性”。說明NA4和NA6在促乳酸菌生長(zhǎng)的作用機(jī)理上有很大的相似性，對(duì)其影響最大的是“結(jié)合作用”以及“催化活性”。Lactobacillusplantarum在利用各類碳源時(shí)，乳酸菌中一些分解代謝物的蛋白與基因模塊的結(jié)合起著重要的作用，例如，在FOS的利用中，LacI-GalR蛋白家族的Ccp A與基因位點(diǎn)cre的結(jié)合起了重要的調(diào)節(jié)作用[31]。而在利用多種碳源時(shí)，添加的寡糖會(huì)誘導(dǎo)乳酸菌先合成相關(guān)的催化酶[32]，因此與“催化活性”相關(guān)的基因呈現(xiàn)上調(diào)表達(dá)。同時(shí)，當(dāng)NA4和NA6濃度升高時(shí)，對(duì)細(xì)胞內(nèi)的“轉(zhuǎn)運(yùn)活性”有更高的影響，將進(jìn)一步通過基因敲除手段驗(yàn)證其作用機(jī)理。

3 結(jié)論

(1)通過全自動(dòng)生長(zhǎng)曲線分析儀篩選出乳酸菌Lactobacillusplantarum對(duì)各種寡糖的最適應(yīng)用濃度，其中，GLC的最適應(yīng)用濃度為0.4 g/L，NAOS為0.8 g/L，NA4、NA6、FOS、XOS均為0.6 g/L。

(2)在各個(gè)寡糖的最適濃度下，促乳酸菌增長(zhǎng)的效果最好的依次是NA4、FOS、NA6、NAOS、XOS、GLC。

(3)完成了10組乳酸菌轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，通過對(duì)差異表達(dá)基因的比較分析及GO注釋，發(fā)現(xiàn)NA4和NA6在促乳酸菌生長(zhǎng)的作用機(jī)理上有很大的相似性，對(duì)其影響最大的是“結(jié)合作用”以及“催化活性”。當(dāng)寡糖濃度升高時(shí)對(duì)細(xì)胞內(nèi)的“轉(zhuǎn)運(yùn)活性”有更高的影響。