牛佳卉,付夢琪,周 茜,王亞旭,吳夢穎,趙 文*,王 頡
(河北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院,河北省農(nóng)產(chǎn)品加工工程技術(shù)中心,河北 保定 071001)
糖尿病腎?。╠iabetic nephropathy,DN)是糖尿病首要的微血管并發(fā)癥[1],是導(dǎo)致終末期腎衰竭常見病因[2],其主要病變包括基底膜增厚、系膜彌漫性增生、腎間質(zhì)纖維化以及足細(xì)胞病變[3]。在其發(fā)病過程中常伴有蛋白尿、血壓偏高,機(jī)體腫脹導(dǎo)致的水腫、腎功能衰退等問題,且發(fā)病率逐年增高[4]。DN的發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜,多種因素相互作用,其中包括血糖和血脂代謝紊亂、免疫功能低下、血管內(nèi)皮功能障礙、氧化應(yīng)激損傷和細(xì)胞凋亡等因素[5]。
由于人民生活水平提高、飲食結(jié)構(gòu)不斷發(fā)生調(diào)整、生活節(jié)奏的加快以及各種環(huán)境因素的影響,糖尿病在全球發(fā)病率逐年上升,且逐漸低齡化。國際糖尿病聯(lián)盟官網(wǎng)公布[6],2017年全球糖尿病患者已經(jīng)達(dá)到4.25億,其中30%~40%發(fā)展成糖尿病腎病,并且最終可能會導(dǎo)致人體的腎功能衰竭[2]。目前還未研究出來能夠根治糖尿病的治療方法,而良好的飲食是預(yù)防糖尿病及延緩誘發(fā)糖尿病腎病的重要保障,因此,人通過膳食對糖尿病進(jìn)行防控具有重要意義。
亞麻籽又稱胡麻籽,富含α-亞麻酸以及亞麻膠、木酚素等功能性成分[7]。亞麻籽油是亞麻籽經(jīng)提煉所獲取的油類產(chǎn)物,不飽和脂肪酸通常60%之上,主要是α-亞麻酸和亞油酸[8-10],其中α-亞麻酸可在體內(nèi)轉(zhuǎn)化為二十碳五烯酸(eicosapentaenoic acid,EPA)和二十二碳六烯酸(docosahexaenoic acid,DHA)(魚油有效成分),所以被人們稱為“陸地上的魚油”。研究表明,亞麻籽油中這些不飽和脂肪酸有多種益用,包括降低膽固醇血脂[11-13]、抗腫瘤、護(hù)眼健腦益智[14-16]、抗炎抗病毒[17]等功效。故本實驗通過觀察亞麻籽油對由鏈尿佐菌素(streptozocin,STZ)誘導(dǎo)的糖尿病腎病大鼠的影響,探究其保護(hù)作用,從調(diào)節(jié)糖代謝途徑和抗氧化途徑初探其保護(hù)作用機(jī)制,并與魚油進(jìn)行對比,評價亞麻籽油能否對糖尿病腎病大鼠起到緩解癥狀的作用,以期進(jìn)一步研究其營養(yǎng)功能價值,為亞麻籽和亞麻籽油的合理開發(fā)應(yīng)用提供實驗依據(jù)。
SD雄性大鼠,SPF級,體質(zhì)量(160~180)g,購自北京維通利華公司,生產(chǎn)許可證號:SCXK(京)2016-0006。
冷榨亞麻籽油(α-亞麻酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)56%) 錫林郭勒盟紅井源油脂有限責(zé)任公司;魚油軟膠囊(EPA含量18.3 g/100 g DHA含量12 g/100 g) 湯臣倍健股份有限公司。
鏈脲佐菌素(streptozocin,STZ) 美國Sigma公司;蛋白定量試劑盒(考馬斯亮藍(lán)法)、糖化血清蛋白(glycated serum protein,GSP)、丙酮酸激酶(pyruvate kinase,PK)、己糖激酶(hexokinase,HK)、丙二醛(maleic dialdehyde,MDA)、還原型谷胱甘肽(glutathione,GSH)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、尿素氮(blood urea nitrogen,BUN)、肌酐(creatinine,CRE)、尿蛋白試劑盒南京建成生物工程研究所;葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白4(glucose transporter-4,GLUT-4)、胰島素(insulin,INS)、晚期糖基化終末產(chǎn)物(advanced glycation end products,AGEs)試劑盒 上海源葉生物科技有限公司;白細(xì)胞介素6(interleukin-6,IL-6)、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、轉(zhuǎn)化生長因子β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1) 武漢博士德生物工程有限公司。
1500-823型酶標(biāo)儀、902-ULTS型超低溫冰箱(-80 ℃)美國Thermo Scientific公司;組織切片機(jī)浙江金華華??平虄x器廠;微量手動移液器 德國Eppendorf公司;IID型超聲細(xì)胞破碎儀 寧波新芝生物科技股份有限公司;ECLIPSE E100型生物顯微鏡日本Nikon公司;血糖儀 艾科來國際貿(mào)易有限公司。
1.3.1 動物模型的建立及分組
糖尿病腎病大鼠建模[18-19]:SD大鼠經(jīng)適應(yīng)性飼養(yǎng)后,分出10 只大鼠作為陰性對照組,其余禁食不禁水12 h進(jìn)行造模。造模方法為將STZ溶于pH 4.5的0.l mol/L檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液中,一次性腹腔注射60 mg/kg STZ,陰性對照組在相同條件下腹腔注射同劑量檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液。72 h后取尾血,選取血糖值不低于16.7 mmol/L的大鼠為模型動物。
劑量設(shè)計:以預(yù)實驗中亞麻籽油的最佳有效劑量作為中劑量,在此基礎(chǔ)上以3為倍數(shù)設(shè)計低、高劑量。
分組:選取血糖值不低于16.7 mmol/L的模型大鼠隨機(jī)分為5 組,每組10 只,分別為模型組、亞麻籽油低(0.3 mL/100 gmb)、中(0.6 mL/100 gmb)、高(0.9 mL/100 gmb)劑量組和魚油組(0.6 mL/100 gmb)。連續(xù)灌胃30 d,陰性對照組和模型組灌胃蒸餾水。每周記錄體質(zhì)量,并觀察其生長情況。每周尾靜脈采血,測空腹血糖值(空腹10 h)。
1.3.2 動物處理及樣本的采集
第30天大鼠單籠飼養(yǎng),禁食不禁水,收集24 h尿液。記錄尿量,離心取上清液,4 ℃保存待測。后麻醉動物,腹主動脈取血后處死,分離血清,-80 ℃冷凍備用。分離胰腺、腎臟、肝臟和睪丸并稱質(zhì)量。取右側(cè)腎臟和肝臟分別制成質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%腎組織勻漿液和肝組織勻漿,3 000 r/min離心5 min取上清液待測。將左側(cè)腎臟、胰腺于10%的甲醛溶液中固定,進(jìn)行病理組織形態(tài)學(xué)檢查。
1.3.3 測定指標(biāo)
1.3.3.1 臟器指數(shù)
采用1.3.2節(jié)中禁食后的大鼠,肝臟、胰臟和睪丸的臟器指數(shù)分別按式(1)~(3)計算。
1.3.3.2 空腹血糖、糖耐量及血糖曲線下面積
空腹血糖:每周大鼠空腹尾靜脈取血,血糖儀測血糖[20]。
糖耐量:取尾血,測定空腹血糖[20]。給予大鼠葡萄糖溶液2 g/kgmb,測定各組0、0.5、1、2 h的血糖值,計算各時間血糖面積,血糖曲線下面積按式(4)計算。
1.3.3.3 血清生化指標(biāo)
取血清,嚴(yán)格按照試劑盒說明書測定GSP、GLUT4、INS、AGEs、TNF-α、IL-6、SOD、MDA、GSH水平。
1.3.3.4 肝組織中生化指標(biāo)的測定
取肝勻漿,嚴(yán)格按照試劑盒說明書測定HK、PK的活力。
1.3.3.5 腎功能指標(biāo)的測定
嚴(yán)格按照試劑盒說明書測尿蛋白、CRE和血清BUN水平。
1.3.3.6 腎組織中生化指標(biāo)的測定
取腎勻漿,嚴(yán)格按照試劑盒說明書測TNF-α、TGF-β1、SOD、MDA、GSH水平。
1.3.3.7 胰腺、腎臟病理組織學(xué)檢查
將固定好的胰腺、腎臟,經(jīng)脫水、浸蠟、石蠟包埋、石蠟切片、蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin,HE)染色后,制備組織切片,光學(xué)顯微鏡觀察。
實驗數(shù)據(jù)采用統(tǒng)計軟件SPSS 17.0進(jìn)行分析。數(shù)據(jù)結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。組間比較采用單因素方差分析法:P<0.05,表示顯著差異;P<0.01,表示極顯著差異。
圖 1 亞麻籽油對STZ誘導(dǎo)的DN大鼠體質(zhì)量的影響Fig. 1 Effect of flaxseed oil on body mass in STZ-induced DN rats
由圖1可知,陰性對照組大鼠,體質(zhì)量穩(wěn)定增加。另外幾組DN大鼠在灌胃前體質(zhì)量明顯下降,且與陰性對照組比較有極顯著性差異(P<0.01);灌胃前各造模組體質(zhì)量均無顯著差別(P>0.05)。連續(xù)灌胃4 周后,模型組、亞麻籽油低劑量組的體質(zhì)量會隨著灌胃時間的延長而減少,中劑量組、高劑量組和魚油組的體質(zhì)量與時間呈正相關(guān),從灌胃第一周起就極顯著高于模型組同期的體質(zhì)量(P<0.01)。
表 1 亞麻籽油對STZ誘導(dǎo)DN大鼠臟器指數(shù)的影響
由表1可知,與陰性對照組比,模型組肝臟指數(shù)極顯著增加(P<0.01),其余指數(shù)無顯著性差異(P>0.05)。與模型組比,各干預(yù)組腎臟指數(shù)有所恢復(fù)(P<0.05),高劑量緩解效果更佳;各干預(yù)組肝臟指數(shù)亦均有不同程度的恢復(fù),其中高劑量組恢復(fù)極顯著(P<0.01),中劑量組與魚油組差異顯著(P<0.05)。胰臟和性腺指數(shù)均無顯著性差異(P>0.05)。
圖 2 亞麻籽油對STZ誘導(dǎo)的DN大鼠空腹血糖的影響Fig. 2 Effect of flaxseed oil on fasting blood glucose in STZ-induced DN rats
圖2結(jié)果表明,模型組每周空腹血糖值均明顯高于陰性對照(P<0.01),說明造模成功。各干預(yù)組大鼠每周的空腹血糖均極顯著低于模型組(P<0.01)。
圖 3 亞麻籽油對STZ誘導(dǎo)的DN大鼠糖耐量的影響Fig. 3 Effect of flaxseed oil on glucose tolerance in STZ-induced DN rats
圖 4 亞麻籽油對STZ誘導(dǎo)的DN大鼠血糖曲線下面積的影響Fig. 4 Effect of flaxseed oil on area under the glycemic curve in STZ-induced DN rats
由圖3、4可知,灌給葡萄糖后各劑量組大鼠血糖值和血糖曲線下面積均極顯著低于模型組(P<0.01),說明各劑量組與魚油組具有緩解血糖升高的作用。
表 2 亞麻籽油對STZ誘導(dǎo)的DN大鼠血清中GSP、GLUT4、AGEs和INS水平的影響Table 2 Effect of flaxseed oil on GSP, GLUT4, AGEs and INS levels in serum of STZ-induced DN rats
由表2可知,與陰性對照組比較,模型組大鼠的GSP和AGEs水平極顯著增加(P<0.01)。與模型組相比,亞麻籽油除高劑量組外,各劑量組大鼠GSP濃度顯著減少(P<0.05,P<0.01),高劑量組雖有下降但無顯著差異(P>0.05);各干預(yù)組AGEs質(zhì)量濃度都極顯著降低(P<0.01),高劑量組降低效果最好。各劑量組GLUT4和INS水平均明顯回升(P<0.05,P<0.01),其中,中劑量組比其余組效果更好。
圖 5 亞麻籽油對STZ誘導(dǎo)的DN大鼠血清中TNF-α(A)、IL-6(B)質(zhì)量濃度的影響Fig. 5 Effect of flaxseed oil on serum TNF-α (A) and IL-6 (B) levels in STZ-induced DN rats
由圖5可知,與陰性對照組比,模型組的大鼠血清中TNF-α和IL-6質(zhì)量濃度明顯增加(P<0.05,P<0.01)。與模型組比,各干預(yù)組大鼠血清TNF-α質(zhì)量濃度極顯著減少(P<0.01);各劑量組IL-6質(zhì)量濃度顯著恢復(fù)(P<0.05,P<0.01),中劑量組恢復(fù)效果優(yōu)于低、高劑量組,但不及魚油組。亞麻籽油中劑量組比魚油組恢復(fù)效果好。
表 3 亞麻籽油對STZ誘導(dǎo)的DN大鼠血清中SOD、MDA、GSH水平的影響Table 3 Effect of flaxseed oil on serum SOD, MDA and GSH levels in STZ-induced DN rats
由表3可知,與陰性對照組比,模型組大鼠SOD活力和GSH濃度顯著性降低(P<0.01,P<0.05),MDA濃度顯著性增加(P<0.05)。與模型組比,各干預(yù)組均能極顯著性升高SOD活力(P<0.01),GSH濃度亞麻籽油高劑量顯著性增加(P<0.05),其余各干預(yù)組無差異(P>0.05)。而MDA濃度除亞麻籽油低劑量組無差異(P>0.05),其余各組均顯著性降低(P<0.05)。對于抗氧化物的影響,亞麻籽油優(yōu)于魚油組。
表 4 亞麻籽油對STZ誘導(dǎo)的DN大鼠肝組織中PK、HK活力的影響Table 4 Effect of flaxseed oil on PK and HK activity in liver tissue of STZ-induced DN rats
由表4可見,與陰性對照組比,模型組大鼠的PK、HK活性皆有極顯著差異(P<0.01)。與模型組比,亞麻籽油各劑量組和魚油組的PK、HK的活性均明顯升高(P<0.01,P<0.05),其中低劑量組調(diào)節(jié)PK活性的效果低于中、高劑量組和魚油組。亞麻籽油調(diào)節(jié)效果優(yōu)于魚油。
由表5可知,與陰性對照組比,模型組大鼠的尿蛋白和24 h尿量均極顯著增加(P<0.01),說明糖尿病腎病模型建模成功。與模型組比,各劑量組大鼠的尿蛋白含量和24 h尿量均極顯著降低(P<0.01),并且尿蛋白含量具有劑量依賴性關(guān)系。亞麻籽油的護(hù)腎功效優(yōu)于魚油。
表 5 亞麻籽油對STZ誘導(dǎo)的DN大鼠尿蛋白濃度及尿量的影響Table 5 Effect of flaxseed oil on urine protein and urine volume in STZ-induced DN rats
表 6 亞麻籽油對STZ誘導(dǎo)的DN大鼠腎功能的影響Table 6 Effect of flaxseed oil on renal function of STZ-induced DN rats
由表6可知,與陰性對照組比,其余各組大鼠的BUN和CRE濃度明顯升高(P<0.01)。與模型組比,各劑量組大鼠BUN濃度明顯降低(P<0.01),CRE濃度也明顯降低(P<0.05,P<0.01),但魚油組效果更優(yōu)。與魚油組比,亞麻籽油中劑量組大鼠的BUN濃度更低,而CRE濃度較高。
表 7 亞麻籽油對STZ誘導(dǎo)的DN大鼠腎組織中TNF-α、TGF-β1質(zhì)量濃度的影響Table 7 Effect of flaxseed oil on TNF-αand TGF-β1 in kidney tissue of STZ-induced DN rats
由表7可知,與模型組比,亞麻籽油中劑量組的TNF-α質(zhì)量濃度顯著減少(P<0.05),其余劑量組無顯著性差異(P>0.05);而各劑量組TGF-β1的質(zhì)量濃度極顯著降低(P<0.01)。與魚油組比,亞麻籽油中劑量組的TNF-α和TGF-β1的質(zhì)量濃度低,效果好。
由表8可知,與模型組比,各劑量組SOD的活力明顯升高(P<0.01)而高劑量組比其余組表現(xiàn)較優(yōu),除魚油組GSH的含量無顯著性變化(P>0.05),各劑量組則極顯著增加(P<0.01),中劑量組GSH含量提升最高。MDA含量顯著下降(P<0.05,P<0.01),與劑量呈負(fù)相關(guān),魚油組含量低于劑量組,表現(xiàn)較優(yōu)。
表 8 亞麻籽油對STZ誘導(dǎo)的DN大鼠腎組織中SOD、MDA、GSH水平的影響Table 8 Effect of flaxseed oil on SOD, MDA and GSH in kidney tissue of STZ-induced DN rats
圖 6 胰腺病理切片(400 ×)Fig. 6 Pathologic observation of pancreatic tissue (400 ×)
由圖6可知,陰性對照組大鼠的胰島形態(tài)正常、細(xì)胞飽滿。模型組大鼠胰島發(fā)生嚴(yán)重萎縮變形,細(xì)胞形狀不規(guī)則,細(xì)胞大量減少并且腫大,胞漿出息空泡樣變化。與模型組相比,亞麻籽油各劑量組及魚油組大鼠胰島的萎縮程度不嚴(yán)重,細(xì)胞數(shù)量多,形態(tài)較飽滿。其中亞麻籽油高劑量組與魚油組細(xì)胞數(shù)目及形態(tài)與陰性對照組基本無差別,效果相同。
圖 7 腎臟病理切片(400 ×)Fig. 7 Pathologic observation of kidney tissue (400 ×)
由圖7可知,陰性對照組大鼠腎小球的大小、形態(tài)正常。模型組大鼠腎小球體積明顯增大,腎小管的上皮細(xì)胞發(fā)生嚴(yán)重的空泡樣變化,結(jié)構(gòu)不規(guī)則,系膜細(xì)胞變多,基底膜變厚,而且間質(zhì)出現(xiàn)有炎癥細(xì)胞浸潤。亞麻籽油低劑量組大鼠上皮細(xì)胞出現(xiàn)明顯的空泡,腎小球上系膜細(xì)胞同樣變多,但嚴(yán)重程度不如模型組;亞麻籽油中、高劑量組以及魚油組腎小球體積比模型組要小,上皮細(xì)胞空泡變性沒有模型組嚴(yán)重,系膜細(xì)胞比模型組薄。與魚油組比,亞麻籽油中劑量組的腎小球大小、形態(tài)更接近于正常。
DN是糖尿病慢性微血管并發(fā)癥,是導(dǎo)致終末期腎衰竭常見病因[21]。其腎臟的病理表現(xiàn)為三高狀態(tài),即:對腎小球的壓力增大、灌注增高,使其處于高負(fù)荷工作的狀態(tài),造成機(jī)體異常。且據(jù)文獻(xiàn)報道,2型糖尿病患者隨病程的發(fā)展,胰島B細(xì)胞顯著減少,胰島及外分泌腺萎縮,B細(xì)胞功能衰竭[22-23]。本研究發(fā)現(xiàn)亞麻籽油對腎臟、胰臟病變均有一定程度減輕,證明亞麻籽油能夠在一定程度上緩解DN大鼠腎損傷情況。
DN發(fā)病歷程中尿量、空腹血糖和糖耐量是其首要的檢測指標(biāo)。在其發(fā)病期間若尿液中的蛋白含量只高不降,就會導(dǎo)致病情惡化,最終發(fā)展成腎衰竭,給人造成不可逆的傷害[24]。并且DN在臨床上主要特征為腎功能改變,血清肌酐與尿素氮是腎功能臨床檢測指標(biāo)。通過實驗結(jié)果,可發(fā)現(xiàn)亞麻籽油能一定程度上控制DN大鼠血糖水平,能顯著降低其尿蛋白、CRE、BUN濃度和尿量。并且發(fā)現(xiàn)亞麻籽油比魚油在降低尿量、尿蛋白和BUN濃度方面的能力更強(qiáng)。但在降糖效果和降CRE含量方面不及魚油組。說明亞麻籽油對糖尿病引起的腎臟病變有一定的修復(fù)作用。
糖代謝紊亂是DN的最重要的病理生理學(xué)特征,會引起的腎臟血流動力學(xué)的改變,通過多種信號通路、氧化應(yīng)激等途徑損傷腎臟,以及生長因子和細(xì)胞因子的多重作用,使TGF-β1的含量升高,導(dǎo)致腎臟纖維化的發(fā)生[25]。國內(nèi)外研究[26-29]證實通過抑制糖基化反應(yīng),減少AGEs生成,增強(qiáng)PK、HK的活性,調(diào)節(jié)糖酵解進(jìn)程,能顯著延緩DN的進(jìn)程。本結(jié)果表明,亞麻籽油能夠有效地提高GLUT4、INS、PK、HK水平,降低GSP、AGEs、和TGF-β1、TNF-α、IL-6水平。說明亞麻籽油改善DN大鼠的糖代謝異常狀態(tài),降低血糖水平,推斷出其可能通過增強(qiáng)胰島素的敏感性,改善機(jī)體胰島素的分泌,或通過糖代謝途徑協(xié)同細(xì)胞因子的調(diào)節(jié)作用,減輕STZ誘導(dǎo)損傷。綜合比較,魚油具有較好的調(diào)節(jié)糖代謝的作用。
正常狀況下,機(jī)體內(nèi)的自由基處于平衡狀態(tài),這種平衡依賴于自身完整的抗氧化酶系統(tǒng)[30]。而在糖尿病狀況下,腎臟中的葡萄糖能夠自行氧化分解,產(chǎn)生過多氧自由基[31]。這些增多的氧自由基,會通過作用于蛋白質(zhì)、脂類和核酸等生物分子來進(jìn)行消耗,造成腎臟損傷[32]。本實驗從血清和腎臟兩個角度對SOD、MDA和GSH水平進(jìn)行檢測分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn),亞麻籽油能夠提高DN大鼠的SOD、GSH水平,同時減少MDA的含量,其抗氧化效果略好于魚油。表明亞麻籽油及魚油能夠增強(qiáng)糖尿病腎病大鼠的胰島素敏感并緩解糖尿病腎病的損傷,具有較為明顯的抗氧化作用。
綜上所述,亞麻籽油能夠控制STZ誘導(dǎo)的DN大鼠空腹血糖值,抑制腎臟肥大,降低尿蛋白的含量,具有顯著降糖和護(hù)腎的功能。本實驗初步確定其作用機(jī)制是通過改善DN大鼠的糖代謝紊亂,調(diào)節(jié)糖酵解反應(yīng),增強(qiáng)糖代謝的水平,并降低引起腎臟病變的炎癥因子的表達(dá),增加機(jī)體的抗氧化能力,來起到護(hù)腎作用,具體機(jī)制還需進(jìn)一步探討。