蛋白質(zhì)組學(xué)在食品非熱殺菌中的應(yīng)用研究進(jìn)展

錢(qián)靜亞，張 咪，孫文敬，代春華，霍書(shū)豪，馬海樂(lè)*

（江蘇大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，江蘇 鎮(zhèn)江 212013）

食品工業(yè)旨在為消費(fèi)者提供高質(zhì)量、安全、營(yíng)養(yǎng)的食品，因此需要對(duì)原材料到食品加工的各個(gè)環(huán)節(jié)進(jìn)行控制，尤其是為了延長(zhǎng)食品的貨架期，采用了諸如低溫保藏、氣調(diào)保藏等措施來(lái)保證食品質(zhì)量。但是，殺菌依然是保證食品安全最有效的方法之一[1]。熱殺菌雖然能很好地控制食品中的微生物，但會(huì)影響到食品的營(yíng)養(yǎng)、風(fēng)味等。而非熱殺菌，如超高壓（ultra-high pressure，UHP）殺菌、高壓CO2（high-pressure carbon dioxide，HPCD）殺菌、脈沖電場(chǎng)（pulsed electric fields，PEF）殺菌等能為消費(fèi)者提供更高質(zhì)量的食品，因此成為食品殺菌的研究熱點(diǎn)。目前，對(duì)非熱殺菌機(jī)理的研究還處于探索階段，但蛋白質(zhì)組學(xué)的興起為從微生物蛋白質(zhì)動(dòng)態(tài)變化的角度揭示非熱殺菌的機(jī)理提供了可能。

蛋白質(zhì)組學(xué)是研究一種細(xì)胞或一種生物表達(dá)的全部蛋白質(zhì)，主要研究蛋白的3 個(gè)生物學(xué)部分：蛋白的表達(dá)、結(jié)構(gòu)及其功能[2]。目前，二維電泳、質(zhì)譜、生物信息學(xué)等技術(shù)的結(jié)合是研究蛋白質(zhì)組學(xué)常用的方法。而同位素標(biāo)記相對(duì)和絕對(duì)定量（isobaric tags for relative and absolute quantitation，iTRAQ）和串聯(lián)質(zhì)譜標(biāo)簽（tandem mass tags，TMT）多肽體外標(biāo)記定量技術(shù)的應(yīng)用更加完善了蛋白質(zhì)組學(xué)的研究手段。

蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)的迅猛發(fā)展，使蛋白質(zhì)組學(xué)的研究成果日益豐富，也使蛋白質(zhì)組學(xué)的應(yīng)用領(lǐng)域得到了極大拓展。在微生物領(lǐng)域，蛋白質(zhì)組學(xué)已用于研究不同環(huán)境壓力，如低溫、高鹽、營(yíng)養(yǎng)脅迫等對(duì)微生物細(xì)胞產(chǎn)生的影響以及微生物在這些脅迫條件下的應(yīng)激機(jī)制[3]。本文主要對(duì)蛋白質(zhì)組學(xué)在食品非熱殺菌致微生物失活中的應(yīng)用進(jìn)行綜述。

1 蛋白質(zhì)組學(xué)在UHP殺菌中的應(yīng)用

UHP殺菌技術(shù)又被稱(chēng)為高靜水壓處理技術(shù)，是一種很有前途的、可取代熱加工技術(shù)對(duì)食品中微生物進(jìn)行處理的非熱加工技術(shù)[4-5]，它對(duì)食品的品質(zhì)，包括維生素含量、自然風(fēng)味和質(zhì)地等影響較小[6]。這一技術(shù)已用于商業(yè)化規(guī)模生產(chǎn)的一系列產(chǎn)品中，包括果汁、豆沙、蘸醬、果醬、色拉醬、牡蠣、即食肉制品等。

應(yīng)用于食品中的UHP壓力范圍一般在200～600 MPa之間[7]。由于在生物系統(tǒng)中發(fā)生的反應(yīng)太過(guò)復(fù)雜，因此在UHP滅活微生物時(shí)，無(wú)法很好地預(yù)測(cè)壓力對(duì)于特定微生物的影響，但是，一般認(rèn)為高壓主要導(dǎo)致了蛋白質(zhì)變性，尤其是影響了具有催化功能的酶的活力，并造成了微生物細(xì)胞的破壞[8]。

采用蛋白組學(xué)方法研究UHP對(duì)菌體蛋白的影響，發(fā)現(xiàn)UHP能夠影響細(xì)菌的結(jié)構(gòu)、應(yīng)激反應(yīng)以及代謝過(guò)程。UHP處理后，空腸彎曲桿菌（Campylobacter jejuni）、副溶血弧菌（Vibrio parahemolyticus）、蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus）的蛋白表達(dá)量均出現(xiàn)一定的變化，結(jié)果如表1所示。

表 1 UHP對(duì)細(xì)菌蛋白表達(dá)量的影響Table 1 Effect of ultra-high pressure on protein expression in bacteria

1.1 UHP殺菌對(duì)細(xì)胞結(jié)構(gòu)相關(guān)蛋白表達(dá)量的影響

300 MPa UHP處理空腸彎曲桿菌81-176后，與蛋白折疊相關(guān)的蛋白中有3 種蛋白（分子伴侶DnaK、觸發(fā)因子Tig、ATP依賴(lài)性蛋白酶HslU）的表達(dá)量上調(diào)，2 種蛋白（分子伴侶蛋白GrpE和熱休克蛋白HtpG）的表達(dá)量下調(diào)，在復(fù)蘇過(guò)程中DnaK和GrpE均未被恢復(fù)，DnaK參與蛋白的折疊、聚集、易位和絡(luò)合形成，以及在翻譯過(guò)程中與新生肽鏈的相互作用[9]?？漳c彎曲桿菌81-176中參與細(xì)胞膜合成的β-酮脂酰-酰基載體蛋白合成酶III（β-ketoacyl-acyl carrier protein synthase III，F(xiàn)abH）表達(dá)量上調(diào)，F(xiàn)abH酶催化乙酰輔酶A合成乙酰?；d體蛋白（acyl carrier protein，ACP），這是脂肪酸生物合成的第一步，而FabF酶表達(dá)量下調(diào)后又恢復(fù)，F(xiàn)abF酶參與不飽和乙酰ACP短鏈的延伸[9]。

對(duì)副溶血弧菌采用50、100、150、200、250 MPa進(jìn)行UHP處理，發(fā)現(xiàn)所有與膜結(jié)構(gòu)和功能相關(guān)的蛋白隨著壓力升高被抑制，熱休克蛋白表達(dá)量在0～100 MPa壓力下上調(diào)，但在150～250 MPa處理壓力下下調(diào)[10]。

1.2 UHP對(duì)細(xì)胞應(yīng)激過(guò)程相關(guān)蛋白表達(dá)量的影響

空腸彎曲桿菌81-176在UHP滅菌后，涉及活性氧代謝的蛋白中有5 種蛋白的表達(dá)量上調(diào)，2 種蛋白的表達(dá)量下調(diào)，但在處理后1～2 h的復(fù)蘇過(guò)程中均被恢復(fù)[9]，氧化應(yīng)激誘導(dǎo)導(dǎo)致合成和分解代謝不平衡，產(chǎn)生活性氧，因此，壓力引起的細(xì)胞損傷在很大程度上與氧化損傷有關(guān)。

采用700 MPa的UHP對(duì)蠟樣芽孢桿菌處理30 min，超氧化物歧化酶表達(dá)量下降，超氧化物歧化酶是抗氧化脅迫作用中的關(guān)鍵酶，其中，UHP過(guò)程中錳過(guò)氧化歧化酶表達(dá)量的下降主要由活性菌代謝的下降和菌體死亡所引起[12]。因此，UHP可能減輕了微生物對(duì)氧化脅迫作用的應(yīng)激保護(hù)能力。此外，蠟樣芽孢桿菌的鞭毛蛋白在UHP處理前后的表達(dá)量變化最大。鞭毛蛋白與氧脅迫作用下的應(yīng)激保護(hù)機(jī)制相關(guān)[13]，鞭毛蛋白表達(dá)量的減少意味著蠟樣芽孢桿菌活力的下降導(dǎo)致了蠟樣芽孢桿菌毒力和應(yīng)對(duì)UHP脅迫作用的能力下降。

1.3 UHP對(duì)細(xì)胞代謝相關(guān)蛋白表達(dá)量的影響

UHP能夠影響細(xì)胞代謝過(guò)程，包括碳水化合物、氨基酸、核苷酸、能量代謝等。300 MPa UHP處理空腸彎曲桿菌81-176，與細(xì)胞代謝相關(guān)蛋白的表達(dá)量在處理后1～2 h的復(fù)蘇過(guò)程中發(fā)生了變化。其中，涉及能量和脂質(zhì)代謝的蛋白的表達(dá)量下調(diào)后在復(fù)蘇過(guò)程中恢復(fù)到原來(lái)的豐度，涉及糖類(lèi)、氨基酸代謝的蛋白在復(fù)蘇過(guò)程中變化不一[9]。

1.4 細(xì)菌應(yīng)對(duì)UHP滅菌的可能機(jī)制

副溶血弧菌經(jīng)UHP滅菌后除了膜結(jié)構(gòu)與功能被抑制外，參與轉(zhuǎn)錄、翻譯的蛋白活力隨著壓力升高也被抑制，除基因ribH編碼的蛋白外，大多數(shù)與生物合成細(xì)胞過(guò)程相關(guān)蛋白的表達(dá)量也被下調(diào)。因此，副溶血弧菌可能通過(guò)抑制細(xì)胞膜的穩(wěn)定性和相應(yīng)功能（ω-3多不飽脂肪酸合成酶PfaC、丙氨酸消旋酶Alr2、糖基轉(zhuǎn)移酶MltA、磷脂酶PLA2和氨基酸ATP結(jié)合盒（ATP-binding cassette，ABC）轉(zhuǎn)運(yùn)結(jié)合蛋白PatH）、減緩生物合成和細(xì)胞過(guò)程（L-天冬氨酸氧化酶NadB、天冬氨酸氨甲酰轉(zhuǎn)移酶PyrB和乙酰谷氨酸激酶ArgB）、降低轉(zhuǎn)錄和翻譯水平（聚合酶σ因子RpoD）以及有效激活應(yīng)激要素（共同伴侶蛋白GroES、分子伴侶蛋白DnaK和GroEL）等來(lái)應(yīng)對(duì)UHP處理[10]。

2 蛋白質(zhì)組學(xué)在HPCD殺菌中的應(yīng)用

近年來(lái)，HPCD殺菌由于其環(huán)保性（CO2無(wú)毒）和低壓（一般低于20 MPa）等特點(diǎn)被認(rèn)為是一種很好的非熱殺菌技術(shù)[14]。HPCD殺菌的機(jī)制可能與以下幾點(diǎn)相關(guān)：1）細(xì)胞內(nèi)外pH值的下降；2）細(xì)胞結(jié)構(gòu)的破壞，包括細(xì)胞膜完整性的破壞、胞內(nèi)或細(xì)胞膜關(guān)鍵成分的喪失等；3）分子CO2和HCO3-對(duì)細(xì)胞代謝的直接抑制作用，包括對(duì)關(guān)鍵酶的滅活作用；4）擾亂細(xì)胞內(nèi)的電解質(zhì)平衡。此外，Yan Wenjie等[15]認(rèn)為HPCD降低了微生物細(xì)胞質(zhì)pH值，這種酸化誘導(dǎo)蛋白質(zhì)凝固變性，從而引起微生物失活。因此，HPCD致微生物失活的機(jī)理與蛋白的變化也存在一定的聯(lián)系。

2.1 HPCD殺菌對(duì)大腸桿菌細(xì)胞組成蛋白表達(dá)量的影響

參與細(xì)胞組成的蛋白主要包括脂蛋白突變體、外膜蛋白（outer membrane protein，Omp）W和OmpA。10 MPa、37 ℃ HPCD處理大腸桿菌5～75 min后，發(fā)現(xiàn)大腸桿菌脂蛋白突變體和OmpW表達(dá)量上調(diào)，OmpA表達(dá)量下調(diào)，這些變化說(shuō)明HPCD破壞了大腸桿菌的細(xì)胞外膜[16]。

2.2 HPCD殺菌對(duì)大腸桿菌應(yīng)激調(diào)控蛋白表達(dá)量的影響

參與應(yīng)激調(diào)控的蛋白包括甘氨酰自由基輔因子、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶、硫氧環(huán)蛋白依賴(lài)巰基型過(guò)氧化物酶。HPCD處理后，大腸桿菌的甘氨酰自由基輔因子表達(dá)量下調(diào)、谷胱甘肽過(guò)氧化酶和硫氧環(huán)蛋白依賴(lài)巰基型過(guò)氧化物酶表達(dá)量上調(diào)[16]。

2.3 HPCD殺菌對(duì)大腸桿菌代謝相關(guān)蛋白表達(dá)量的影響

參與能量代謝的蛋白包括組氨酸ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、β-半乳糖苷酶、6-磷酸葡萄糖脫氨酶、谷胱甘肽ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。這4 種蛋白在HPCD處理后表達(dá)量上調(diào)，說(shuō)明大腸桿菌通過(guò)加速能量代謝來(lái)適應(yīng)HPCD的脅迫[16]。

參與一般代謝的蛋白包括50S核糖體蛋白L10、谷氨酸和天門(mén)冬氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)亞基。HPCD處理后，50S核糖體蛋白L10表達(dá)量的下調(diào)可能與rRNA的合成同步發(fā)生，并間接控制了蛋白質(zhì)的合成，而谷氨酸和天門(mén)冬氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)亞基在HPCD處理后表達(dá)量出現(xiàn)上調(diào)[16]。

參與核苷酸代謝的蛋白涉及無(wú)機(jī)焦硫酸酶、饑餓過(guò)程中進(jìn)行DNA保護(hù)的晶體結(jié)構(gòu)蛋白（DNA protection during starvation，Dps）以及饑餓誘導(dǎo)DNA結(jié)合蛋白。HPCD處理后，無(wú)機(jī)焦硫酸酶表達(dá)量上調(diào)，造成焦磷酸鹽積累，引起核酸合成的抑制；Dps表達(dá)量下調(diào)，饑餓誘導(dǎo)DNA結(jié)合蛋白表達(dá)量上調(diào)，這可能引起了DNA的變性[16]。上述3 種蛋白的差異表達(dá)非常復(fù)雜，可能會(huì)抑制核酸的合成和造成DNA損傷。

3 蛋白質(zhì)組學(xué)在超臨界CO2殺菌中的應(yīng)用

超臨界CO2技術(shù)能夠在相對(duì)適中的壓力（7.3～50 MPa）下使微生物失活[17]，存在于CO2臨界點(diǎn)（7.38 MPa和31.1 ℃）之外的超臨界CO2具有許多有利的特征，例如在微生物滅活時(shí)具有高溶解力、高擴(kuò)散性和低黏度等[18]，且超臨界CO2無(wú)毒、不易燃、環(huán)保，對(duì)人和環(huán)境不產(chǎn)生負(fù)面效應(yīng)[19-20]。因此，超臨界CO2是一種非常具有吸引力的非熱加工技術(shù)。超臨界CO2的滅菌作用來(lái)自于多因素的組合，包括細(xì)胞質(zhì)的酸化、CO2陰離子濃度的提高、滲透脅迫、CO2萃取作用導(dǎo)致細(xì)胞膜通透性的增加和泄漏以及細(xì)胞的破裂等[21-23]。同時(shí)，Hossain等[24]發(fā)現(xiàn)超臨界CO2處理造成糞腸球菌（Enterococcus faecalis）、大腸桿菌、球形芽孢桿菌（Bacillus sphaericus）等微生物細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)降解、酶活性喪失等，這可能也是造成細(xì)胞死亡的原因之一。

White等[25]采用雙向電泳分析超臨界CO2處理沙門(mén)氏菌中的蛋白，認(rèn)為超臨界CO2殺菌處理不會(huì)影響到其蛋白的表達(dá)量，但Kim等[26]采用雙向電泳對(duì)超臨界CO2處理后的鼠傷寒沙門(mén)氏菌（Salmonella typhimurium）中的蛋白質(zhì)組進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)超臨界CO2處理改變了鼠傷寒沙門(mén)氏菌與其細(xì)胞代謝相關(guān)的蛋白。在10 MPa、40 ℃條件下處理鼠傷寒沙門(mén)氏菌，發(fā)現(xiàn)超臨界CO2處理后，33 個(gè)蛋白點(diǎn)表達(dá)差異較大，其中，11 個(gè)蛋白點(diǎn)的下調(diào)幅度超過(guò)50%。對(duì)這11 個(gè)蛋白點(diǎn)進(jìn)行鑒定后發(fā)現(xiàn)這些蛋白都是參與細(xì)胞代謝途徑的酶類(lèi)，分別為酮基-羥基戊二酸鹽醛縮酶、腺嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶、6-磷酸-N-乙酰-D-甘露糖胺異構(gòu)酶、脫氧核糖核酸醛縮酶、吡哆醇激酶、膽色素原脫氨酶、3-磷酸甘油醛脫氫酶、亞鐵螯合酶、胞苷二磷酸-葡萄糖-4,6-脫水酶、分支酸變位酶/預(yù)苯酸脫氫酶、硒代半胱氨酸裂解酶等，這些酶都與能量和蛋白的合成代謝相關(guān)[26]。例如，酮基-羥基戊二酸鹽醛縮酶催化磷酸戊糖途徑，腺嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶催化AMP的補(bǔ)救合成途徑，3-磷酸甘油醛脫氫酶則參與糖酵解途徑。超臨界CO2處理后，微生物懸浮液的pH值下降，這可能是引起蛋白表達(dá)量變化的一個(gè)原因[27]。總之，超臨界CO2處理所引起蛋白質(zhì)水平的降低，會(huì)對(duì)微生物細(xì)胞的生存產(chǎn)生負(fù)面影響。

4 蛋白質(zhì)組學(xué)在PEF殺菌中的應(yīng)用

PEF殺菌技術(shù)是以較高的電場(chǎng)強(qiáng)度（10～50 kV/cm）、較短的脈沖寬度（0～100 μs）和較高的脈沖頻率（0～2 000 Hz）對(duì)液體、半固體食品進(jìn)行處理，并且可以組成連續(xù)殺菌和無(wú)菌灌裝的生產(chǎn)線(xiàn)。

目前PEF對(duì)微生物的作用機(jī)理尚不完全清楚，通常認(rèn)為PEF導(dǎo)致微生物細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)發(fā)生局部變化和破壞細(xì)胞膜滲透屏障[28-29]，這種效應(yīng)也被稱(chēng)為電穿孔[30]，細(xì)胞膜的介電常數(shù)和電導(dǎo)率也會(huì)發(fā)生變化，與細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞外介質(zhì)的介電常數(shù)和電導(dǎo)率不同，造成空間電荷極化現(xiàn)象[31]。當(dāng)微生物暴露于外加電場(chǎng)中時(shí)，電場(chǎng)會(huì)集中于細(xì)胞膜上，當(dāng)跨膜電位到達(dá)臨界電壓0.2～1.0 V時(shí)，細(xì)胞膜就會(huì)出現(xiàn)瞬間的膜穿孔[32]，當(dāng)穿孔出現(xiàn)不可逆時(shí)，細(xì)胞就會(huì)死亡。此外，PEF可能可以直接作用于蛋白和DNA分子，導(dǎo)致分子的破壞或變性[33]。Rivas等[34]在5 種入口溫度（7、16、24、30 ℃和38 ℃）下采用PEF處理大腸桿菌，在15 kV/cm、700 μs處理?xiàng)l件下，蛋白質(zhì)圖譜中7 個(gè)蛋白點(diǎn)發(fā)生明顯變化。

4.1 PEF殺菌對(duì)大腸桿菌結(jié)構(gòu)蛋白表達(dá)量的影響

在PEF入口溫度為7、16 ℃時(shí)，大腸桿菌OmpA的表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05），在30、38 ℃時(shí)甚至從圖譜上消失；而其他6 種蛋白的表達(dá)量則顯著升高，包括高溫磷酸戊糖異構(gòu)酶GmhA、S14家族內(nèi)肽酶ClpA、核糖體蛋白S6、5’-三磷酸脫氧尿苷核苷酸水解酶Dut、鐵蛋白FtnA。這些蛋白都與PEF處理后微生物功能和結(jié)構(gòu)的恢復(fù)相關(guān)。對(duì)在24 ℃下PEF處理的大腸桿菌進(jìn)行恢復(fù)，37 ℃恢復(fù)處理1 h后，有10 個(gè)蛋白點(diǎn)發(fā)生了變化，其中包括OmpA，其表達(dá)量較未恢復(fù)前提高了5.54 倍，這表明在細(xì)胞恢復(fù)過(guò)程中OmpA開(kāi)始合成，這可能是為了恢復(fù)細(xì)胞外膜的完整性。Omp在細(xì)菌生理功能以及致病機(jī)制中發(fā)揮著多種作用[34]。采用相同條件（37 ℃、1 h）對(duì)38 ℃下PEF處理的大腸桿菌進(jìn)行恢復(fù)處理后，屬于熱不穩(wěn)定延伸因子（elongation factor thermo unstable，Ef-Tu）的翻譯延伸因子Tu 2（Tufb）、位于細(xì)胞外膜上的金屬蛋白酶FtsH和Omp以及參與正確蛋白伸展的分子伴侶SurA的表達(dá)量增加[34]。

Omp主要位于細(xì)胞膜的外部并形成小孔，允許小分子出入細(xì)胞。蛋白質(zhì)組學(xué)的研究表明PEF部分或全部地破壞了Omp，因此，PEF以2 種方式影響著細(xì)胞和外部的交換：一是在細(xì)胞質(zhì)膜上產(chǎn)生孔洞，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)代謝物損失；二是通過(guò)影響通道蛋白。

4.2 PEF殺菌對(duì)大腸桿菌代謝相關(guān)蛋白表達(dá)量的影響

對(duì)38 ℃下PEF處理的大腸桿菌進(jìn)行恢復(fù)處理，DNA依賴(lài)型醛脫氫酶PutA、ATP酶、琥珀酸脫氫酶（succinate dehydrogenase，Sdh）A的表達(dá)量增加。DNA依賴(lài)型醛脫氫酶在以還原型輔酶Ⅰ（nicotinamide adenine dinucleotide，NADH）形式消耗能量的過(guò)程中產(chǎn)生，對(duì)于有氧呼吸來(lái)說(shuō)是不可少的；ATP酶也與呼吸作用相關(guān)，參與ATP的合成；SdhA參與三羧酸循環(huán)。而表達(dá)量下降的蛋白包括一些參與細(xì)胞代謝的蛋白，如參與半胱氨酸、天冬氨酸、色氨酸等氨基酸生物合成途徑的蛋白、參與糖代謝和糖異生途徑的磷酸甘油酸變位酶GmpI、涉及磷酸化作用和轉(zhuǎn)運(yùn)葡萄糖到細(xì)胞內(nèi)以及到ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白上的雙功能糖基轉(zhuǎn)移酶PtgA[34]。

5 蛋白質(zhì)組學(xué)在脈沖磁場(chǎng)殺菌中的應(yīng)用

脈沖磁場(chǎng)（pulsed magnetic field，PMF）殺菌是將食品放置到產(chǎn)生PMF的線(xiàn)圈中進(jìn)行處理，從而達(dá)到殺滅微生物的一種方法。PMF殺菌在常溫常壓下進(jìn)行，可以克服熱殺菌對(duì)食品中熱敏性成分的破壞以及引起食品顏色變化等缺點(diǎn)，較好地保持食品中原有的營(yíng)養(yǎng)成分和風(fēng)味物質(zhì)。PMF主要通過(guò)改變微生物細(xì)胞的形態(tài)，破壞細(xì)胞壁和細(xì)胞膜，提高細(xì)胞膜滲透性并引起胞內(nèi)物質(zhì)外泄以達(dá)到細(xì)胞死亡的目的，同時(shí)，PMF也破壞了微生物的DNA[35]。

采用磁場(chǎng)強(qiáng)度3.3 T、脈沖數(shù)30的PMF對(duì)枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）進(jìn)行殺菌處理，比較殺菌前后枯草芽孢桿菌蛋白組發(fā)現(xiàn)存在19 種差異蛋白，有2 種蛋白在PMF處理后消失，1 種蛋白為新出現(xiàn)的，另外，有7 種蛋白的表達(dá)量上調(diào)，9 種蛋白的表達(dá)量下調(diào)[36]。

5.1 PMF殺菌對(duì)枯草芽孢桿菌細(xì)胞膜蛋白表達(dá)量的影響

經(jīng)PMF處理后消失的蛋白經(jīng)質(zhì)譜鑒定后，其中一種是胞外溶質(zhì)結(jié)合蛋白，胞外溶質(zhì)結(jié)合蛋白通常是革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌內(nèi)的一種脂蛋白，它通過(guò)半胱氨酸N端連接到細(xì)胞膜上成為細(xì)胞膜的一部分，也可成為運(yùn)輸系統(tǒng)的一個(gè)組成部分[37]。大多數(shù)原核生物的ABC轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)通過(guò)它來(lái)親和性地結(jié)合底物，并運(yùn)送底物通過(guò)跨膜通道。在PMF處理后表達(dá)量下調(diào)的蛋白中有一種是OmpA，Omp表達(dá)量的下降說(shuō)明PMF破壞了枯草芽孢桿菌的細(xì)胞膜[36]。

5.2 PMF殺菌對(duì)枯草芽孢桿菌代謝相關(guān)蛋白的影響

經(jīng)PMF處理后另一種消失的蛋白經(jīng)質(zhì)譜鑒定后為磷酸丙糖異構(gòu)酶，磷酸丙糖異構(gòu)酶是糖酵解過(guò)程中重要的酶之一，它將磷酸二羥丙酮催化成3-磷酸甘油醛后進(jìn)入糖酵解途徑。PMF處理后，新出現(xiàn)的蛋白是一種功能未知的假設(shè)蛋白。在PMF處理后細(xì)胞分裂啟動(dòng)因子、ATP酶β亞基、果糖二磷酸醛縮酶、底物結(jié)合蛋白、2,5-二酮基-D-葡萄糖酸還原酶A和黃素蛋白酶WrbA的表達(dá)量上調(diào)；其中，果糖二磷酸醛縮酶在糖酵解途徑中催化1,6-二磷酸果糖形成3-磷酸甘油醛及磷酸二羥丙酮。除OmpA之外，在PMF處理后表達(dá)量下調(diào)的蛋白還有延伸因子G、磷酸甘油激酶、順烏頭酸酶、糖磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)載體蛋白、Dps、半乳糖結(jié)合胞質(zhì)蛋白和3-磷酸甘油醛脫氫酶[36]。磷酸甘油激酶是糖酵解的關(guān)鍵酶，能催化產(chǎn)生ATP；順烏頭酸酶能夠催化三羧酸循環(huán)中從檸檬酸經(jīng)順烏頭酸生成異檸檬酸的可逆性異構(gòu)化反應(yīng)[38]；3-磷酸甘油醛脫氫酶在糖酵解和糖異生過(guò)程中均起著重要作用，能夠催化3-磷酸甘油醛形成1,3-二磷酸甘油酸的可逆性反應(yīng)，糖磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)載體蛋白構(gòu)成糖磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)，而糖磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)不僅能夠調(diào)節(jié)細(xì)菌對(duì)碳源優(yōu)先使用、參與細(xì)菌運(yùn)輸和吸收通過(guò)細(xì)胞壁的一些碳水化合物、控制細(xì)胞運(yùn)動(dòng)的趨碳性，而且能夠調(diào)節(jié)其他代謝途徑[39]。

對(duì)差異蛋白進(jìn)行GO功能分析，發(fā)現(xiàn)PMF對(duì)枯草芽孢桿菌的細(xì)胞膜造成了破壞，同時(shí)對(duì)胞內(nèi)物質(zhì)合成、能量代謝等造成影響。而差異蛋白經(jīng)過(guò)KEGG代謝通路分析后，發(fā)現(xiàn)PMF對(duì)枯草芽孢桿菌有機(jī)物和能量的代謝均產(chǎn)生了重要影響。

6 蛋白質(zhì)組學(xué)在脈沖強(qiáng)光殺菌中的應(yīng)用

脈沖強(qiáng)光（pulsed light，PL）殺菌屬于非熱紫外殺菌技術(shù)，它利用波長(zhǎng)在200～1 000 nm的光輻射在10-3～200 ms內(nèi)產(chǎn)生的能量進(jìn)行殺菌，其光譜范圍包括200～400 nm的紫外光（ultraviolet，UV）、400～700 nm的可見(jiàn)光以及700～1 100 nm的紅外光，但殺菌作用主要是由200～290 nm范圍內(nèi)短波紫外線(xiàn)造成的DNA光損傷所引起[40]。此外，Cheigh等[41]發(fā)現(xiàn)PL處理后的單核細(xì)胞李斯特菌（Listeria monocytogenes）和大腸桿菌O157:H7的細(xì)胞膜被明顯破壞，內(nèi)部成分出現(xiàn)丟失和泄漏到膜外。此外，PL殺菌也通過(guò)影響參與細(xì)菌應(yīng)激轉(zhuǎn)錄、翻譯等蛋白來(lái)影響細(xì)菌存活率。PL殺菌對(duì)綠膿假單胞菌（Pesudomonas pyocyaneum）、糞腸球菌蛋白表達(dá)量的影響如表2所示。

表 2 PL殺菌對(duì)細(xì)菌蛋白表達(dá)量的影響Table 2 Effect of pulsed light on protein expression in bacteria

6.1 PL殺菌對(duì)細(xì)胞應(yīng)激蛋白表達(dá)量的影響

對(duì)采用0.2 J/cm2PL處理后的綠膿假單胞菌進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)分析，在二維電泳圖譜上發(fā)現(xiàn)15 種表達(dá)出現(xiàn)差異的蛋白，進(jìn)一步質(zhì)譜鑒定后發(fā)現(xiàn)調(diào)控的應(yīng)激蛋白包括熱休克蛋白YggG、保守假定蛋白IbpA、Dps[42]，其中YggG和IbpA的表達(dá)量上調(diào)，YggG與IbpA在氧化應(yīng)激及UV照射等條件下[44]均可被誘導(dǎo)；而Dps表達(dá)量下調(diào)，Dps參與氧化還原動(dòng)態(tài)平衡，防止DNA的氧化損傷[45]。噬菌體相關(guān)蛋白包括噬菌體蛋白FIIR2和假定蛋白等，這些相關(guān)蛋白的表達(dá)量都發(fā)生上調(diào)，已有報(bào)道認(rèn)為這些蛋白在不利條件如絲裂霉素或UV處理引起DNA損傷時(shí)開(kāi)始表達(dá)[46]。

采用0.2 J/cm2PL處理綠膿假單胞菌后，與細(xì)胞運(yùn)動(dòng)相關(guān)的4型菌毛蛋白前體蛋白PilA和抽動(dòng)運(yùn)動(dòng)蛋白PilH的表達(dá)量均下調(diào)[42]。PilA主要編碼4型菌毛蛋白亞基，參與抽動(dòng)運(yùn)動(dòng)，并黏附在菌體表面上參與細(xì)胞膜的合成；PilH蛋白作為復(fù)雜調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的一部分，對(duì)于4型菌毛的生物合成必不可少[47]。

同樣，采用0.5 J/cm2PL處理糞腸球菌，發(fā)現(xiàn)4 種應(yīng)激蛋白受到調(diào)控，包括2 種冷休克家族蛋白、1 種應(yīng)激反應(yīng)蛋白Gls24和1 種Dps家族蛋白[43]。冷休克家族蛋白對(duì)DNA和RNA起到保護(hù)伴侶作用，參與各種細(xì)胞過(guò)程并在多種微生物的應(yīng)激適應(yīng)過(guò)程中起到重要作用[48]；Dps家族蛋白參與氧化還原平衡[45]，Dps蛋白與DNA以及結(jié)合DNA的蛋白相互作用，與內(nèi)核組織和微生物生存相關(guān)；除Dps蛋白表達(dá)量下調(diào)外，其他3 種蛋白表達(dá)量都上調(diào)。細(xì)胞分裂蛋白DivIVA是細(xì)胞分裂、染色體分離、細(xì)胞生長(zhǎng)必需的蛋白[49]，DivIVA蛋白表達(dá)量上調(diào)，說(shuō)明PL改變了糞腸球菌的細(xì)胞分裂。

6.2 PL殺菌對(duì)細(xì)胞代謝相關(guān)蛋白表達(dá)量的影響

采用0.2 J/cm2PL處理綠膿假單胞菌后，6-磷酸葡萄糖酸內(nèi)酯酶、電子轉(zhuǎn)移黃素蛋白α亞基的表達(dá)量下調(diào)，這2 種蛋白與能量和碳代謝相關(guān)[42]。采用0.5 J/cm2PL處理糞腸球菌，發(fā)現(xiàn)涉及能量代謝的5 種蛋白的表達(dá)量都下調(diào)，分別為烯醇化酶、磷酸丙糖異構(gòu)酶、3-磷酸甘油醛脫氫酶、6-磷酸果糖激酶、鳥(niǎo)氨酸氨甲酰轉(zhuǎn)移酶[43]。

6.3 PL殺菌對(duì)細(xì)胞轉(zhuǎn)錄、翻譯蛋白的影響

采用0.2 J/cm2PL處理后，綠膿假單胞菌中與轉(zhuǎn)錄、翻譯調(diào)節(jié)相關(guān)的蛋白包括延伸因子Ef-Tu、翻譯起始抑制劑TdcF以及抑制蛋白DksA的表達(dá)量均發(fā)生變化，Ef-Tu表達(dá)量上調(diào)2 倍，而TdcF和DksA表達(dá)量則下調(diào)[43]。DksA是rRNA轉(zhuǎn)錄的負(fù)調(diào)節(jié)因子[50]，DksA缺失，DNA的復(fù)制就會(huì)停止，但這種停止與外源性DNA損傷無(wú)關(guān)，當(dāng)然，DksA也能誘導(dǎo)DNA損傷應(yīng)激反應(yīng)和補(bǔ)充主要的重組蛋白R(shí)ecA[51]；由于特定底物為mRNA的核糖核酸內(nèi)切酶TdcF的表達(dá)量也發(fā)生下調(diào)，DksA表達(dá)量的下調(diào)則成為利于轉(zhuǎn)錄和翻譯過(guò)程分子機(jī)制的一部分。

采用0.5 J/cm2PL處理糞腸球菌，涉及轉(zhuǎn)錄和翻譯過(guò)程的蛋白有5 種，包括延伸因子Ef-Tu、Ef-Ts、GreA和30S核糖體蛋白S2、核糖體循環(huán)因子，這些蛋白的表達(dá)量都上調(diào)；Ef-Tu有利于氨酰-tRNA進(jìn)入核糖體，而Ef-Ts是與Ef-Tu進(jìn)行交換的鳥(niǎo)嘌呤核苷酸交換因子[52]；這些蛋白表達(dá)量的上調(diào)表明糞腸球菌通過(guò)提高轉(zhuǎn)錄和翻譯水平來(lái)應(yīng)對(duì)PL脅迫。

7 結(jié) 語(yǔ)

當(dāng)微生物在外界環(huán)境因素改變后，其細(xì)胞膜、細(xì)胞壁等遭受不同程度的損傷，細(xì)胞能量、蛋白質(zhì)合成、碳水化合物、脂質(zhì)代謝等受到一定影響，同時(shí)，細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄和翻譯等細(xì)胞活動(dòng)也受到影響。微生物在外界因素改變的情況下，傾向于啟動(dòng)自身特殊的應(yīng)激系統(tǒng)，增加蛋白質(zhì)的合成用于保護(hù)細(xì)胞完整性，增加各種具有特殊功能蛋白質(zhì)的合成用于積極進(jìn)行多種合成和分解代謝等生理活動(dòng)，以積極應(yīng)對(duì)外界條件的改變，從而能夠在改變后的環(huán)境中生存和繁殖。因此，蛋白質(zhì)組學(xué)對(duì)微生物致死機(jī)制和應(yīng)激機(jī)制的研究具有重要意義。

采用蛋白組學(xué)方法研究非熱殺菌方式對(duì)微生物的影響，發(fā)現(xiàn)微生物的失活與微生物蛋白表達(dá)量的變化存在一定關(guān)系，這些表達(dá)量發(fā)生變化的蛋白與細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)和功能、生物合成過(guò)程、能量代謝等有關(guān)。蛋白質(zhì)組學(xué)的結(jié)果證明HPCD、PEF、PMF等非熱殺菌方式破壞了微生物細(xì)胞的OmpA，進(jìn)一步證明這些非熱殺菌方式破壞了微生物細(xì)胞膜；而UHP、HPCD非熱殺菌方式造成生物合成過(guò)程中相關(guān)酶的表達(dá)量下調(diào)，說(shuō)明這些非熱殺菌方式抑制了微生物細(xì)胞的生物合成過(guò)程；超臨界CO2、PL等殺菌方式則減少了微生物細(xì)胞內(nèi)與能量代謝相關(guān)酶的表達(dá)，表明細(xì)胞通過(guò)限制能量消耗來(lái)應(yīng)對(duì)這些殺菌方式造成的脅迫；此外，一些應(yīng)激蛋白，如UHP中出現(xiàn)的熱休克蛋白、HPCD殺菌中出現(xiàn)的谷胱甘肽過(guò)氧化物酶、PEF殺菌中出現(xiàn)的鐵蛋白FtnA以及PL殺菌中出現(xiàn)的冷休克家族蛋白，它們?cè)跉⒕蟮谋磉_(dá)量均上調(diào)，說(shuō)明微生物通過(guò)提高內(nèi)在應(yīng)激水平來(lái)減少外界壓力帶來(lái)的不利效應(yīng)。蛋白質(zhì)組學(xué)的應(yīng)用不僅為從分子生物學(xué)角度揭示非熱殺菌的機(jī)制奠定了基礎(chǔ)，也為非熱殺菌在工業(yè)化上的應(yīng)用提供了更廣闊的前景。