現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)在環(huán)境微生物領(lǐng)域的應(yīng)用

曹 雨

（沈陽建筑大學(xué) 市政與環(huán)境工程學(xué)院，遼寧 沈陽 110168）

隨著水體污染的加重，水體中有機(jī)污染物的降解成為人們關(guān)注的熱點(diǎn)問題。作為降解有機(jī)污染物質(zhì)的主力軍——微生物，其物種多樣性及群落結(jié)構(gòu)對生態(tài)環(huán)境均會造成一定的影響。為了更好地了解微生物的狀態(tài)、確保生態(tài)環(huán)境安全、改善生態(tài)環(huán)境質(zhì)量，將現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)引入到環(huán)境工程微生物領(lǐng)域中。

現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)，即通過對分子水平的線性結(jié)構(gòu)進(jìn)行檢測，進(jìn)而比較各個物種、細(xì)胞的生理狀態(tài)。May等［1］構(gòu)建了含有引物結(jié)合位點(diǎn)的合成DNA片段，用于定量分析10種不同的微生物；Zabkiewicz等［2］使用基于16S rRNA基因的序列分析的方法，確定從外生菌根和樺樹根部分離的細(xì)菌種類。武志華等［3］采用PCR-DGGE技術(shù)分析內(nèi)蒙古西部地區(qū)土壤細(xì)菌的多樣性，為未來該地區(qū)的細(xì)菌資源開發(fā)利用及生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定性提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

現(xiàn)如今廣泛應(yīng)用的現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)有Southern印跡雜交、Northern印跡雜交、

熒光原位雜交技術(shù)、基因芯片、qPCR技術(shù)及高通量測序技術(shù)等［4］，這些技術(shù)在分析微生物多樣性、判別微生物種類、降解有機(jī)污染物等方面發(fā)揮著重要作用。

1現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)

1.1核酸雜交技術(shù)

核酸雜交技術(shù)是通過核酸分子雜交檢測靶序列，進(jìn)而可以定量或定性檢測DNA序列片段。隨著核酸雜交技術(shù)不斷的完善，在此基礎(chǔ)上，又形成了一系列衍生技術(shù)。

印跡雜交技術(shù)根據(jù)所分析的物質(zhì)是DNA還是RNA，分為Southern印跡雜交和Northern印跡雜交，這種雜交技術(shù)多用于染色體檢查等生物領(lǐng)域。原位雜交可以準(zhǔn)確地對核酸序列進(jìn)行定位，有利于分析微生物種類多樣性。在原位雜交的基礎(chǔ)上，用熒光進(jìn)行標(biāo)記，便形成了新的雜交方法——熒光原位雜交。由于熒光原位雜交具有定位準(zhǔn)確、特異性好等優(yōu)點(diǎn)，因此在環(huán)境微生物領(lǐng)域中應(yīng)用的最為廣泛［5］。

1.2基因芯片技術(shù)

基因芯片又稱生物芯片，是20世紀(jì)80年代中期發(fā)展起來的，通過檢測雜交信號強(qiáng)度，從而得出分子信息的一種技術(shù)?；蛐酒姆诸惙绞胶头N類多種多樣，可分為原位合成、DNA微陣列［6］、無機(jī)片基等。在微生物群落和多樣性的研究中，多采用系統(tǒng)寡核苷酸芯片、群落基因組芯片及宏基因組芯片［7］。除此之外，基因芯片還大范圍地應(yīng)用于食品、藥物、機(jī)械、航天、農(nóng)作物優(yōu)選等領(lǐng)域。盡管基因芯片技術(shù)已經(jīng)得到了良好的發(fā)展，但仍有一些目前無法解決的難題，如它的成本高、靈敏度較低、重復(fù)性差、操作復(fù)雜等，使得它很難對大量信息進(jìn)行解讀。這些問題通過樣品的制備、探針固定、數(shù)據(jù)讀取及分析等幾個方面反映出來。

1.3 PCR技術(shù)

PCR技術(shù)，又稱為多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，是現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)中的一種。這種體外DNA擴(kuò)增技術(shù)不僅靈敏度高，而且反應(yīng)快速。隨著PCR技術(shù)的不斷完善，形成了定量實(shí)時PCR（qPCR）、PCR基因測序、PCR-SSCP、PCRDGGE、PCR-RFLP等一系列衍生技術(shù)，并在環(huán)境微生物領(lǐng)域發(fā)揮著重要的作用。qPCR作為檢測和量化目標(biāo)微生物的工具，已被廣泛應(yīng)用于環(huán)境微生物生態(tài)學(xué)研究中，以便于更好地理解廢水中微生物群落的復(fù)雜性［8］。定量實(shí)時PCR可提供比其他分子技術(shù)更加具體、準(zhǔn)確的定量，但在實(shí)際中應(yīng)用時仍需要考慮一些必要的限制；PCR-SSCP分析技術(shù)可使構(gòu)象上有差異的分子進(jìn)行分離，而且這種技術(shù)的操作過程簡單、反應(yīng)快速、靈敏，毋需其他特殊的儀器；PCR-DGGE則是將序列不一樣的DNA分開；PCR-RFLP技術(shù)，即通過特異性內(nèi)切酶消化切割成不同長度的DNA片段條帶。這種技術(shù)操作方法簡單、DNA的含量也得到了很大的提高。Shannon等 采用實(shí)時定量PCR（qPCR）檢測城市污水處理的五個階段。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，這種qPCR方法可有效地檢測廢水中的病原體。

1.4高通量測序技術(shù)

高通量測序技術(shù)的出現(xiàn)和日趨成熟，為微生物領(lǐng)域研究的深入開展提供了契機(jī)［10］。1975年桑格和考爾森開創(chuàng)了鏈終止法，兩年后，桑格測定了第一個基因組序列，這便是第一代DNA測序技術(shù)。第一代測序技術(shù)的準(zhǔn)確性可達(dá)到99%以上，但它的測序成本高、通量低，這些缺點(diǎn)使它難以進(jìn)行大規(guī)模的應(yīng)用。因此，它并不是十分理想的測序技術(shù)。經(jīng)過技術(shù)的研發(fā)和改進(jìn)，第二代測序技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生了。與第一代測序技術(shù)相比，第二代測序技術(shù)在保持高準(zhǔn)確性的前提下，降低了測序成本，并且提高了測序速度。近幾年，測序技術(shù)不斷地完善，逐步形成第三代測序技術(shù)。與前兩代測序技術(shù)相比，它的最大特點(diǎn)是無需進(jìn)行PCR擴(kuò)增。不進(jìn)行PCR擴(kuò)增，是為了在保持第二代測序技術(shù)優(yōu)點(diǎn)的基礎(chǔ)上，避免因PCR所導(dǎo)致的系統(tǒng)錯誤。因?yàn)楦咄繙y序的快速發(fā)展，使得對數(shù)百萬個PCR擴(kuò)增子進(jìn)行測序得以實(shí)現(xiàn)?；贒NA多樣性的高通量測序技術(shù)可對難以觀測的水環(huán)境微生物及其群落進(jìn)行觀測，在生物研究中發(fā)揮著重要作用［11］。

2在環(huán)境工程微生物領(lǐng)域中的應(yīng)用

2.1對微生物多樣性的分析

現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)可以對微生物的結(jié)構(gòu)、種類、群落進(jìn)行分析。Moreno等［12］使用擴(kuò)增子長度異質(zhì)性PCR（LH-PCR）評估土壤中的微生物群落變化；王靖淇等［11］采用高通量測序技術(shù)對遼河真核浮游藻類的群落結(jié)構(gòu)特征進(jìn)行研究，研究結(jié)果表明，應(yīng)用高通量測序技術(shù)觀察到的優(yōu)勢群落與應(yīng)用光學(xué)顯微鏡觀察到的一樣，均為硅藻門和綠藻門，并且高通量測序技術(shù)在觀測過程中不會丟失種類信息，使測序結(jié)果更加準(zhǔn)確；為了對處于不同培養(yǎng)階段的微生物的種群結(jié)構(gòu)進(jìn)行測定，姚倩等［13］采用熒光原位雜交技術(shù)進(jìn)行研究。在剛接種的活性污泥中，研究發(fā)現(xiàn)，硝化菌所占的比例僅為總微生物量的二十分之一，其中氨氧化細(xì)菌約占硝化菌的二分之一；隨著硝化菌富集培養(yǎng)的進(jìn)行，氨氧化細(xì)菌的數(shù)量逐漸減少，目標(biāo)微生物硝化菌的份額逐步提高，成為優(yōu)勢種群。除此之外，還可以通過對微生物結(jié)構(gòu)進(jìn)行改變，使其更有利于研究、應(yīng)用。根據(jù)細(xì)菌rRNA的基因序列Zhang等［14］設(shè)計(jì)特異性引物，從而獲得可變和相鄰的基因序列，提高物種水平的細(xì)菌鑒定分辨率。

2.2對污染物的降解

利用現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)，研究微生物分解有機(jī)污染物的過程，通過適當(dāng)?shù)募夹g(shù)手段，使其在最佳的試驗(yàn)條件下達(dá)到更高的去除率。Ge等［15］利用實(shí)驗(yàn)室規(guī)模的序批式反應(yīng)器，應(yīng)用熒光原位雜交技術(shù)評估污泥中微生物的比例，對提高廢水中生物除磷效率進(jìn)行研究，從而得到最佳的試驗(yàn)條件。以西安市第三污水處理廠為研究地點(diǎn)，以氧化溝工藝為研究對象，采用熒光原位雜交技術(shù)，彭黨聰?shù)龋?6］研究溫度對強(qiáng)化除磷性能的影響。

2.3分析結(jié)果的技術(shù)手段

作為分析手段，現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)廣泛的應(yīng)用于各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)中。為了檢測阿留申貂病毒對農(nóng)場造成的污染，Prieto等［17］采用qPCR技術(shù)對幾個環(huán)境樣品進(jìn)行檢測；Aydin等［18］采用定量實(shí)時PCR技術(shù)用于確定不同抗生素組合對總細(xì)菌、活性細(xì)菌及古細(xì)菌等的影響；GAN等［19］為了對天然群落中的有毒和無毒微囊藻進(jìn)行分析，采用熒光原位雜交（FISH）和流式細(xì)胞儀（FCM）相結(jié)合的分析方法，并量化大量存在的有毒微囊藻的百分比。研究結(jié)果表明，F(xiàn)ISH和流式細(xì)胞術(shù)的結(jié)合是研究微囊藻毒素生產(chǎn)生態(tài)學(xué)和對有毒微囊藻提供早期預(yù)警的有用方法；姚倩等［20］對污水處理廠活性污泥系統(tǒng)中的硝化螺菌富集培養(yǎng)進(jìn)行研究，雜交結(jié)果表明，硝化螺菌占活性污泥總微生物量的四分之三左右，而硝化桿菌所占的比例很小，僅為0.1%；Zhou等［21］為了檢測一般和特定的厭氧氨氧化菌細(xì)菌群，提供了針對不同環(huán)境樣品的PCR引物以及針對不同目的選擇合適的引物對的實(shí)際應(yīng)用指導(dǎo)。

3結(jié)語與展望

（1）現(xiàn)代分子生物技術(shù)為環(huán)境工程微生物領(lǐng)域提供了分析技術(shù)支撐，使深入探究微生物的多樣性以及微生物與污染物之間的關(guān)系成為可能。

（2）現(xiàn)代分子生物技術(shù)在檢測過程中可得到準(zhǔn)確的檢測結(jié)果，若將現(xiàn)代分子生物技術(shù)與其他的環(huán)境檢測技術(shù)相結(jié)合，可使得到的結(jié)果更加準(zhǔn)確、更加可靠。

（3）在小范圍內(nèi)，通過現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)可以改變微生物的結(jié)構(gòu)，使其變得更易于處理污染物。但如何大規(guī)模的利用現(xiàn)代分子生物技術(shù)對微生物進(jìn)行操作、如何高效快速地降解有機(jī)污染物，這應(yīng)是未來的研究方向。