張金虎，周洋，王誠悅，鄒元章，汪浩洋，盧俅，孫浩

(江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院泌尿外科，江蘇 鎮(zhèn)江 212013)

腎細(xì)胞癌是一種起源于腎上皮的癌癥，占所有腎惡性腫瘤的90%以上[1]。腎癌對放療和化療均不敏感，對于早期腎癌，手術(shù)切除腫瘤是目前治療局限性腎癌最有效的方法，但是有近1/3腎癌患者在確診時已經(jīng)發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，即使接受了手術(shù)治療，仍有30%患者出現(xiàn)腫瘤復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移[2]。腎癌轉(zhuǎn)移的基礎(chǔ)機(jī)制仍然不完全清楚。生物信息學(xué)可幫助研究者快速、大量和高效地獲取基因組信息和基因表達(dá)譜改變等。本研究擬通過生物信息學(xué)技術(shù)，探討腎癌轉(zhuǎn)移瘤及原發(fā)性腎癌基因表達(dá)的差異，找出關(guān)鍵的差異基因及其潛在的分子調(diào)控機(jī)制，并預(yù)測其所涉及的功能。

1 材料與方法

1.1 材料

微陣列數(shù)據(jù)Gene Expression Omnibus(GEO，http//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo)是數(shù)據(jù)存儲的公共存儲庫，選取GSE85258芯片數(shù)據(jù)集，該芯片包含16例腎癌轉(zhuǎn)移瘤患者血樣品和15例原發(fā)性腎癌患者血樣品。腎癌769-P細(xì)胞株(美國ATCC細(xì)胞公司)；RPMI 1640培養(yǎng)基、細(xì)胞培養(yǎng)皿購自生工生物工程(上海)股份有限公司；胎牛血清、Lipofectamine 2000試劑盒(美國Thermo公司)；siRNA-表面活性蛋白A2(SFTPA2)、siRNA-空購于吉瑪基因公司(上海)；侵襲小室(直徑6.5 mm，厚8.0 μm)購于南京福麥斯生物技術(shù)有限公司；細(xì)胞培養(yǎng)箱(HeraceⅡ 150i)、倒置顯微鏡(conic)、熒光正置顯微鏡(BX51)等由江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院中心實(shí)驗室提供。

1.2 在線數(shù)據(jù)庫分析

1.2.1 登錄網(wǎng)站 登錄GCBI(http:∥www.gcbi.com.cn/)網(wǎng)站，注冊賬號，點(diǎn)擊分析實(shí)驗室，創(chuàng)建實(shí)驗室。

1.2.2 選擇需要的模塊 本研究選擇樣本分組1、樣本分組2、差異分析、生物功能(GO)分析、信號通路(Pathway)分析、交集、基因相互作用、共表達(dá)、通路關(guān)系9個模塊。

1.2.3 設(shè)置模塊參數(shù) 差異分析(P<0.05，差異倍數(shù)>1.2倍，數(shù)量3 000)；GO分析、Pathway分析(P<0.05)。

1.2.3 設(shè)計流程圖應(yīng)用箭頭將上述模塊按照(樣本分組1、樣本分組2)—差異分析—(GO分析、Pathway分析)—交集—(基因相互作用、共表達(dá))連接起來，使之成為一套完整的流程。

1.2.4 數(shù)據(jù)庫在線分析 將16例實(shí)驗組數(shù)據(jù)引入樣本分組1，15例對照組數(shù)據(jù)引入樣本分組2。點(diǎn)擊分析，約30 min分析完畢，查看分析結(jié)果。

1.3 細(xì)胞實(shí)驗

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)及分組 將腎癌769-P細(xì)胞用含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基，置5%CO237℃恒溫箱中培養(yǎng)，24 h換液1次，當(dāng)細(xì)胞長到80%～90%進(jìn)行消化傳代。細(xì)胞分2組：轉(zhuǎn)染siRNA-SFTPA2抑制769-P細(xì)胞表達(dá)SFTPA2作為實(shí)驗組，轉(zhuǎn)染siRNA-空不抑制769-P表達(dá)SFTPA2作為對照組。

1.3.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 取對數(shù)生長期769-P細(xì)胞株，以2×105/mL密度接種于6孔板，培養(yǎng)過夜；細(xì)胞饑餓2 h，按照Lipofectamine 2000說明書將siRNA-SFTPA2和siRNA-空分別加入到769-P細(xì)胞培養(yǎng)皿中；次日換為普通培養(yǎng)基。

1.3.3 細(xì)胞侵襲實(shí)驗 消化轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞，2 500 r/min常溫離心4 min，取細(xì)胞沉淀。用無胎牛血清RPMI 1640培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，計數(shù)板顯微鏡下計數(shù)。取10 000個細(xì)胞，上室中加入500 μL無胎牛血清RPMI 1640培養(yǎng)基，下室加入500 μL含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基，放置5%CO237 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h；甲醇固定小室下室面細(xì)胞；結(jié)晶紫染色30 min；用PBS將小室洗凈；晾干小室；用熒光正置顯微鏡(100倍)觀察兩組小室下室面細(xì)胞，各選取5個不同視野計數(shù)細(xì)胞。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 人腎癌轉(zhuǎn)移瘤和人原發(fā)性腎癌差異基因的篩選結(jié)果

將篩選出的3 000個差異基因按差異倍數(shù)和q值進(jìn)行排序并選出差異最大的10個升高基因(表1)和10個降低基因(表2)。SFTPA2升高最顯著，溶質(zhì)載體家族17成員3(SLC17A3)降低最明顯。

2.2 GO分析和Pathway分析結(jié)果

GO分析發(fā)現(xiàn)，3 000個差異基因與350個生物功能有關(guān)，選10個最顯著的生物功能(表3)。Pathway分析結(jié)果顯示，3 000個差異基因與128條信號通路有關(guān)，挑出10條最顯著的信號通路(表4)。

表1 升高顯著的差異基因

表2 降低顯著的差異基因

表3 差異基因GO分析

表4 差異基因Pathway分析

2.3 差異基因間相互作用結(jié)果

篩選3 000個差異基因中與上述350個生物功能有關(guān)且與128條信號通路有關(guān)的基因，得到523個基因。構(gòu)建基因網(wǎng)絡(luò)，發(fā)現(xiàn)523個差異基因中存在441條相互作用關(guān)系，有260個節(jié)點(diǎn)。選取信號傳遞中介能力最大的10個基因作圖。結(jié)果絲裂原活化蛋白激酶1(MAPK1)的信號傳遞中介能力最大，其可能是基因網(wǎng)絡(luò)的中心環(huán)節(jié)，且與蛋白激酶C(PRKCA)、原癌基因(NRAS)、一氧化氮合酶1(NOS1)存在直接聯(lián)系(圖1)。

2.4 差異基因共表達(dá)結(jié)果

研究發(fā)現(xiàn)，523個差異基因中存在571條共表達(dá)關(guān)系，共有169個節(jié)點(diǎn)，其中有正相關(guān)也有負(fù)相關(guān)，選取10個與周圍基因關(guān)系數(shù)量最多的基因構(gòu)圖，發(fā)現(xiàn)10個基因間共表達(dá)互為正相關(guān)(圖2)。

箭頭方向表示上下游，無箭頭表示兩個基因形成復(fù)合物發(fā)揮協(xié)同作用，實(shí)線表示直接作用，虛線表示間接作用

圖1 差異基因間相互作用

實(shí)線表示正相關(guān)

2.5 信號通路網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果

將與3 000個差異基因有關(guān)的128條信號通路作網(wǎng)絡(luò)分析，結(jié)果顯示，其中存在156條關(guān)系，有54個節(jié)點(diǎn)。選取10個上下游通路最多的信號通路，發(fā)現(xiàn)MAPK信號通路為上下游通路最多的信號通路，其可能是這些差異基因的核心信號通路(圖3)。

箭頭方向表示上下游

2.6 侵襲實(shí)驗結(jié)果

細(xì)胞侵襲實(shí)驗結(jié)果顯示，實(shí)驗組腎癌細(xì)胞侵襲細(xì)胞數(shù)明顯小于對照組(t=18.44，P<0.01)，由此可以初步認(rèn)為抑制腎癌769-P細(xì)胞SFTPA2表達(dá)可降低其侵襲能力(圖4)。

圖4 侵襲實(shí)驗結(jié)果

3 討論

在GSE85258數(shù)據(jù)集中對實(shí)驗組與對照組進(jìn)行差異基因篩選，共得到3 000個差異基因。既往研究認(rèn)為SFTPA2和纖維化及第三類致死率較高的遺傳性肺纖維化有相關(guān)性，研究表明SFTPA2與腎纖維化也有關(guān)[3]。此外，有研究發(fā)現(xiàn)SFTPA2 參與編碼人表面活性蛋白[4]，可能與肺癌有關(guān)[5]。本研究發(fā)現(xiàn)的差異基因中，SFTPA2升高最明顯，提示SFTPA2高表達(dá)可能對腎癌的轉(zhuǎn)移和進(jìn)展起關(guān)鍵作用。

本研究發(fā)現(xiàn)差異基因GO分析最顯著的生物功能是依賴DNA轉(zhuǎn)錄，Pathway分析最顯著的是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白質(zhì)加工，因此可初步認(rèn)為差異基因可能通過影響依賴DNA轉(zhuǎn)錄和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白質(zhì)加工，從而影響腎癌的轉(zhuǎn)移。而差異基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)圖中基因之間的表達(dá)有正相關(guān)也有負(fù)相關(guān)，故基因間具體的表達(dá)關(guān)系及對腎癌發(fā)生轉(zhuǎn)移的影響，尚需進(jìn)一步研究。

在構(gòu)建基因網(wǎng)絡(luò)中，發(fā)現(xiàn)MAPK1信號傳遞中介能力最大，且其與PRKCA、NRAS、NOS1存在直接聯(lián)系。研究顯示，MAPK1是調(diào)控胃癌細(xì)胞增殖和遷移的直接功能靶點(diǎn)[6]。另有研究發(fā)現(xiàn)MAPK1與肝內(nèi)膽管癌、肝細(xì)胞癌有關(guān)[7-8]。Guo等[9]發(fā)現(xiàn)，PRKCA與食管炎的惡變呈正相關(guān)；Zhu等[10]發(fā)現(xiàn)，NOS1抑制鼻咽癌細(xì)胞的自噬。因此，MAPK1、PRKCA、NOS1與腫瘤的發(fā)生發(fā)展存在相關(guān)性。且目前尚不能排除NRAS與腫瘤無關(guān)。故推斷，MAPK1、PRKCA、NRAS、NOS1異常表達(dá)可能與腎癌發(fā)生轉(zhuǎn)移存在一定的相關(guān)性。

信號通路網(wǎng)絡(luò)分析發(fā)現(xiàn)，MAPK信號通路是上下游通路最多的信號通路。研究表明有基因通過靶向MAPK信號通路增強(qiáng)腎癌細(xì)胞活力、侵襲性和進(jìn)展[11-13]。在MAPK信號通路上下游中，包含細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡、P53信號通路、癌癥途徑等與腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)的信號通路。因此推斷，上述通路與腎癌轉(zhuǎn)移具有相關(guān)性。

選取表達(dá)差異最顯著的基因行體外細(xì)胞實(shí)驗，結(jié)果顯示抑制SFTPA2表達(dá)可降低腎癌細(xì)胞侵襲能力。由此可初步推測SFTPA2異常表達(dá)與腎癌轉(zhuǎn)移有一定的關(guān)系。但本研究只進(jìn)行了細(xì)胞侵襲實(shí)驗，細(xì)胞增殖實(shí)驗和細(xì)胞凋亡實(shí)驗及其他相關(guān)實(shí)驗待后續(xù)完善，以期進(jìn)一步了解SFTPA2在腎癌細(xì)胞中的功能。

綜上所述，本研究在腎癌轉(zhuǎn)移瘤患者血中發(fā)現(xiàn)3 000個差異基因，表達(dá)異常的基因可能通過復(fù)雜的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，參與MAPK信號通路等，促進(jìn)腎癌發(fā)生轉(zhuǎn)移。