徐霞，楊邦偉，蔡燕萍，劉書來，劉建華，丁玉庭*

1(浙江工業(yè)大學(xué) 海洋學(xué)院，浙江 杭州，310014)2(國家遠洋水產(chǎn)品加工技術(shù)研發(fā)分中心(杭州)，浙江 杭州，310014)

貝殼是一種良好的天然鈣源，其CaCO3含量高達95%以上[1]。我國沿海貝殼資源豐富，但大量貝殼廢棄物多被堆積遺棄，易造成環(huán)境污染和資源浪費。國內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)廢棄貝殼可用于各種補鈣制劑的制備與生產(chǎn)[1-2]，但綜合利用率仍相對較低。鈣是人體內(nèi)必需元素之一，也是組成人體骨骼、牙齒、臟器、血液和肌肉組織的重要成分，人體缺鈣時可發(fā)生各種生理功能障礙。市場上補鈣制劑品種繁多，乳酸鈣因其鈣含量高、溶解度較大、吸收率高、安全性高、價格合理等優(yōu)點而備受關(guān)注。但普通鈣劑被人體吸收利用率較低，局限性明顯[3]。CHO等研究發(fā)現(xiàn)，納米級顆粒有較高的吸收率且有效成分分布更廣泛，有望克服普通鈣劑現(xiàn)有的局限。原因是鈣的吸收利用率常常受到吸收部位藥物溶出速度的支配，納米粒徑的鈣可以無需消化吸收而直接穿透組織間隙，提高人體對鈣的吸收速度且增加分布廣度，從而提高生物利用度[4-5]。基于此，探索以貝殼為鈣源的納米乳酸鈣的綠色高效制備方法，對提高鈣的吸收效率及貝殼綜合利用率具有重要意義。

利用貝殼制備乳酸鈣以煅燒法[6-7]和發(fā)酵法[8]居多，煅燒法制備乳酸鈣需要消耗大量能源煅燒貝殼去除有機雜質(zhì)，產(chǎn)生大量廢氣對環(huán)境不友好；發(fā)酵法需要使用乳酸菌發(fā)酵產(chǎn)生乳酸再與貝殼反應(yīng)，生成乳酸鈣，此法產(chǎn)生大量富營養(yǎng)廢水，產(chǎn)生的乳酸酸性較弱反應(yīng)時間長。制備納米乳酸鈣的方法有化學(xué)沉淀法和層狀液晶法[9]等，化學(xué)沉淀法在緩慢冷卻飽和乳酸鈣熱溶液的過程中，對pH值控制的要求嚴苛、重現(xiàn)性差，難以規(guī)?；?。層狀液晶法制備納米乳酸鈣需使用大量有機試劑形成液相界面，在生產(chǎn)過程中存在安全隱患，易殘留有毒有害成分在成品中且工藝過程復(fù)雜、對設(shè)備要求較高且污染環(huán)境[5,9-11]。

表面活性劑可促進晶體成核，減緩晶核的形成速率或抑制晶體快速長大，已被廣泛報道應(yīng)用于有機和無機納米粉體材料的生產(chǎn)[11]，在食品領(lǐng)域以乳化劑、增稠劑等應(yīng)用為主，此方面的研究和報道較少。本文提出一種乳酸鈣晶體納米化的新工藝方法，在中和反應(yīng)后的重結(jié)晶階段添加微量的表面活性劑結(jié)合高速剪切來控制晶體粒徑并保持分散性，無需高溫煅燒，亦無需使用有毒有害試劑，是一種環(huán)境友好的制備新工藝。此外相較于現(xiàn)有制備方法，本工藝對儀器設(shè)備的要求低、制備工序少、成本低且環(huán)保綠色，為貝殼的綜合利用提供了一種新的途徑。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

1.1.1 原料與試劑

貽貝貝殼,取自嵊泗縣貽貝殼集中處理中心。乙醇(95%)、無水乙醇、乳酸、吐溫80(聚山梨酯80)、乙二胺四乙酸二鈉(EDTA)標準溶液、鈣紅指示劑，均購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

1.1.2 儀器

超低溫冰箱U410-86，英國New Brunswick Scientific；冷凍干燥機SCIENTZ-12N，寧波新芝生物科技股份有限公司；高速離心分散機T25D，德國IKA；透射電子顯微鏡Tecnai G2 F30，F(xiàn)EI美國；X射線衍射儀X′Pert Pro，荷蘭帕納科；傅立葉變換顯微紅外光譜儀Nicolet 6700，美國Thermo。

1.2 實驗方法

1.2.1 貽貝殼預(yù)處理

取廢棄貽貝殼置于清水中，粗略去除大量附著的海藻及殘留的貽貝肉。洗凈后用0.1%HCl溶液浸泡1 h，徹底去除表面附著的外套膜及貝肉，洗凈后烘干備用。將貽貝殼砸碎后用萬能粉碎機粉碎。過40目篩，儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 納米乳酸鈣制備的工藝流程

制備納米乳酸鈣的工藝流程主要由中和反應(yīng)、納米化重結(jié)晶和純化干燥3個過程組成。在加熱超聲環(huán)境中貝殼粉與食品級乳酸溶液發(fā)生中和反應(yīng)。反應(yīng)后靜置降溫，調(diào)節(jié)pH值，放入恒溫箱中緩慢勻速降溫至22 ℃。取出乳酸鈣過飽和溶液，在晶體析出重結(jié)晶前快速向溶液加入適量吐溫80，同時以適當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)速高速剪切一段時間，控制析出的乳酸鈣顆粒粒徑及其粒度分布。將乳酸鈣懸濁液低速離心，棄去上層清液，用適量無水乙醇反復(fù)沖洗納米乳酸鈣，去除表面活性劑、提高乳酸鈣純度。最后，凍干乳酸鈣，制得食品級納米乳酸鈣粉體。其中乳酸鈣在水中的溶解度隨著溫度變化而變化，55 ℃為其溶解度曲線的拐點溫度[13]，在降溫結(jié)晶時效率最高，故設(shè)反應(yīng)溫度為55 ℃。

工藝流程如下：

預(yù)處理貝殼粉→加入乳酸→置于加熱超聲環(huán)境→中和反應(yīng)→取出靜置降溫→調(diào)節(jié)pH值→緩慢降溫重結(jié)晶→加入表面活性劑→高速剪切→低速離心→無水乙醇醇洗→冷凍干燥→納米乳酸鈣粉體。

1.2.3 中和反應(yīng)工藝優(yōu)化

通過單因素試驗優(yōu)化并確定經(jīng)過中和反應(yīng)過程中乳酸的用量以及反應(yīng)時間。乳酸用量單因素試驗：取2.0 g貽貝殼粉，加入40 mL蒸餾水中，緩慢攪拌防止貝殼顆粒沉底，將反應(yīng)容器置于55℃的水浴中，緩慢加入6 mol/L乳酸溶液 (0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8和2.0 mL)。120 min反應(yīng)后，經(jīng)過抽濾、降溫、過濾即得乳酸鈣粗產(chǎn)品，干燥后分別稱量比較產(chǎn)率，由于本試驗原料取用量一致，結(jié)果用乳酸鈣的產(chǎn)量作對比；中和反應(yīng)時間單因素試驗：取貽貝殼粉2.0 g，加入40 mL水，加入1.8 mL乳酸溶液(6 mol/L)，55 ℃水浴反應(yīng)不同時間(30、60、90、120和150 min)后，計算并比較乳酸鈣的產(chǎn)率，計算方法如公式(1)：

(1)

式中：實際產(chǎn)量，反應(yīng)后乳酸鈣烘干后稱重的質(zhì)量，g；理論產(chǎn)量，使用貝殼的重量計算其CaCO3含量，進一步計算中和反應(yīng)生成乳酸鈣的理論質(zhì)量，g。

1.2.4 乳酸鈣的粒徑控制及工藝優(yōu)化

稱取10 g制備的乳酸鈣粗產(chǎn)品，溶解于100 mL 55℃的蒸餾水中。飽和后，將其放置在室溫下冷卻到30℃，然后置于22℃恒溫箱中，令其緩慢降溫至22℃，調(diào)節(jié)pH值至7.0左右。隨后通過單因素試驗和響應(yīng)面試驗優(yōu)化納米乳酸鈣的粒徑控制工藝，篩選較優(yōu)的表面活性劑并確定添加量、剪切速度及剪切時間。

(1)單因素試驗方法

表面活性劑篩選及添加量確定：取配置好的1 L乳酸鈣溶液降溫并調(diào)節(jié)pH后分別加入0、5、10、15、20、40、60和80 μL的吐溫80、吐溫40或吐溫20，并用高速剪切機以7 000 r/min的速度攪拌210 s，隨即轉(zhuǎn)移至離心管中固液分離和純化；剪切速度：加入20 μL的吐溫80，并用高速剪切機分別以0、4 000、5 000、6 000、7 000、8 000、9 000 r/min的速度攪拌210 s，隨即轉(zhuǎn)移至離心管中固液分離和純化；剪切時間：加入20 μL的吐溫80，并以7 000 r/min的速度攪拌0、30、60、90、120、150、180、210 s，隨即轉(zhuǎn)移至離心管中固液分離和純化，分別測定并比較其粒徑。

(2)響應(yīng)面試驗設(shè)計

在單因素試驗基礎(chǔ)上，以剪切速度和剪切時長為響應(yīng)因素，乳酸鈣粒徑為響應(yīng)值，利用Design-Expert10.0軟件進行響應(yīng)面試驗設(shè)計和數(shù)據(jù)分析。

1.2.5 純化與干燥參數(shù)優(yōu)化

采用無水乙醇多次清洗去除所制備的乳酸鈣中殘留的表面活性劑。通過單因素試驗優(yōu)化純化及干燥工藝，并確定洗滌次數(shù)、無水乙醇的添加量以及干燥時間參數(shù)。

洗滌次數(shù)單因素試驗：加入乳酸鈣10倍體積的無水乙醇，分別洗滌1、2、3、4、5、6次后，棄去上層清液并將純化的乳酸鈣移至培養(yǎng)皿中，適當(dāng)處理后置于凍干機中，凍干6 h；無水乙醇添加量單因素試驗：分別加入乳酸鈣0、2、4、6、8、10倍體積的無水乙醇，緩慢攪拌后靜置棄去上層清液，重復(fù)2次后將乳酸鈣移至培養(yǎng)皿中，-80℃預(yù)冷8 h，轉(zhuǎn)移至冷凍干燥機中干燥6 h；干燥時間單因素試驗：加入乳酸鈣10倍體積的無水乙醇，緩慢攪拌后靜置棄去上層清液，分別重復(fù)兩次。將純化的乳酸鈣移至培養(yǎng)皿中，適當(dāng)處理后置于凍干機中，分別凍干0、1、2、3、4、5、6 h，并測定乳酸鈣產(chǎn)品的純度。

1.2.6 測定與表征方法

根據(jù)國標GB 1886.21—2016《食品安全國家標準 食品添加劑 乳酸鈣》[14]，利用EDTA絡(luò)合滴定法測定納米乳酸鈣產(chǎn)品中的鈣含量并以此可計算產(chǎn)品的純度及乳酸鈣產(chǎn)量。根據(jù)國標GB 1886.21—2016，利用干燥減重的測定方法確定含水量。電感耦合等離子體質(zhì)譜(ICP-MS)被用于乳酸鈣中氟化物及重金屬元素含量的測定：將樣品消化后，過濾，蠕動泵送入霧化器，利用同心型氣動霧化器產(chǎn)生氣溶膠，在載氣載帶下噴入焰炬，進樣量大約為1 mL/min。

透射電子顯微鏡(TEM)表征：取0.1 g納米乳酸鈣，加入10 mL無水乙醇超聲10 min，滴于銅網(wǎng)上并低溫陰干，放入Tecnai G2 F30中用于TEM觀察、拍照，統(tǒng)計顆粒的粒徑；傅里葉透射紅外光譜(FT- IR)表征：取0.1 g樣品加入到0.15 g KBr粉末中，置于紅外燈照射環(huán)境下用瑪瑙研缽研磨2～3 min，充分混合后壓片，利用傅立葉變換顯微紅外光譜儀Nicolet 6700全波段掃描，繪制紅外光譜圖；X-射線衍射(XRD)表征：取納米乳酸鈣粉末樣品研磨后，置于玻璃樣品盒中，按壓結(jié)實后放入X射線衍射儀X'Pert Pro中測定所制備乳酸鈣的晶體結(jié)構(gòu)。

2 結(jié)果與分析

2.1 中和反應(yīng)工藝條件的優(yōu)化

由圖1-A可知，中和反應(yīng)當(dāng)乳酸用量增加至1.8 mL時乳酸鈣產(chǎn)量達到最高值2.1 g，產(chǎn)率為95.0%，貝殼粉中所有的CaCO3都反應(yīng)成為乳酸鈣，雜質(zhì)為貝殼中的有機物。由于此單因素試驗貝殼粉使用量固定在2.0 g，即乳酸最優(yōu)使用量為每克貝殼粉，使用0.9 mL乳酸。由圖1-B可知，乳酸與貝殼粉經(jīng)120 min反應(yīng)完全，由于乳酸酸性較弱，反應(yīng)推進速度慢，所以反應(yīng)時間較長。

故中和反應(yīng)的最佳制備工藝參數(shù)為：每克貝殼粉使用0.9 mL乳酸；反應(yīng)時間為120 min時，中和反應(yīng)較為充分、高效，在工業(yè)生產(chǎn)時及時用量增大，最制備工藝參數(shù)同樣可行。

A-中和反應(yīng)乳酸用量；B-中和反應(yīng)時間

2.2 表面活性劑種類及濃度對乳酸鈣粒徑的影響

微量的表面活性劑在鹽飽和液中具有降低表面張力、增大表面活性并增大鹽類結(jié)晶過程中的界面能[15]，也就是表面活性劑的存在一方面可以促進成核，另一方面可以減緩晶核形成速率或抑制晶體快速長大，從而可以減小晶體粒徑，并改善晶體的粒度分布[16]。

因此，在本研究中通過添加微量的表面活性劑來控制乳酸鈣顆粒的粒徑，并防止其在干燥過程中再次團聚。其中，表面活性劑的種類和添加量至關(guān)重要。為了較好地控制乳酸鈣顆粒的粒徑，選擇表面活性劑的方法遵循：親油基鏈長，易于形成膠團的高分子材料[17]。此外，由于目標產(chǎn)物為食品級，所選表面活性劑還需要滿足符合國家標準的食品級添加劑，且在完成制備工序后易洗滌去除?；诖?，本實驗選用吐溫80、40和20這3種表面活性劑來研究其對乳酸鈣粒徑的影響。

如圖2所示為不同表面活性劑和添加量對乳酸鈣粒徑的影響。根據(jù)試驗結(jié)果，表面活性劑在最終反應(yīng)液中的濃度為0～20 μL/L，隨著添加量的增加，粒徑呈線性減??；當(dāng)表面活性劑的最終濃度超過20 μL/L時，乳酸鈣的粒徑不再隨著表面活性劑的增加而變化。吐溫80在乳酸鈣粒徑控制方面效果較優(yōu)，最佳添加量為反應(yīng)液中濃度20 μL/L。納米粉體的合成中，表面活性劑的添加量可根據(jù)臨界膠束濃度理論(critical micelle concentration theory)[18-20]計算：表面活性劑在達到一定濃度前，其添加量與分散效果呈線性正比；達到一定濃度后其分散效果將達到一個穩(wěn)定狀態(tài)，其添加量增加也不會讓分散效果進一步提高；其添加量過多容易造成表面活性劑之間的基團相互糾纏導(dǎo)致粒徑的小幅上升[21]。試驗中用到的表面活性劑的臨界膠束濃度值均為20 μL/L左右[22]，與我們的試驗結(jié)果一致；吐溫80的親油基鏈較長，親油性強，在水溶液中易形成膠團，包裹乳酸鈣顆粒，可有效抑制晶體的生長，且毒性最低、安全性最高，故首選食品級吐溫80。

圖2 表面活性劑種類及濃度對乳酸鈣顆粒平均粒徑的影響試驗結(jié)果圖

2.3 乳酸鈣粒徑控制工藝參數(shù)的優(yōu)化

根據(jù)DLVO理論(DLVO theory)，表面活性劑影響納米顆粒的分散機理是降低微粒表面張力與增加水的親和性和顆粒之間的吸引能，并形成排斥能。吸引能和排斥能之和等于總位能，總位能決定微粒間的距離。這2種相反的作用力平衡在70 nm[22]。由此，本文所述利用表面活性劑控制粒徑的理論極限粒徑為70 nm。乳酸鈣顆粒的析出過程為瞬間形成晶核，過飽和溶液中的離子在晶核基礎(chǔ)上快速附著成為乳酸鈣晶體，并不斷生長[15]。而表面活性劑包裹已經(jīng)存在的晶體后，阻隔了晶體與過飽和溶液中離子的界面能，阻斷了晶體的繼續(xù)生長。高速剪切使表面活性劑快速均勻分布在溶液中，盡快地包裹晶體并阻止其進一步生長。因此，在乳酸鈣重結(jié)晶階段，晶體析出前添加表面活性劑并結(jié)合高速剪切，能阻止乳酸鈣晶體長大，控制粒徑在100 nm以下，理論上是可行的。

鑒于剪切速度和剪切時間的工藝參數(shù)，直接決定了生產(chǎn)中所需使用的儀器設(shè)備規(guī)格及功率，而單因素試驗的結(jié)果較為粗略。為了獲得較為準確的工藝參數(shù)，以剪切速度和剪切時間為響應(yīng)因素，設(shè)計試驗且對所得數(shù)據(jù)進行分析，對影響還原力的各因素進行擬合，得到回歸方程：

Y=172.30-120.88×A-27.33×B+8.00×AB+35.65×A2+6.10×B2

根據(jù)圖4響應(yīng)面試驗結(jié)果所示，當(dāng)剪切速度為9 000 r/min，剪切時間240 s，吐溫含量為20 μL/L時，平均粒徑達到了最小值73.1 nm。剪切速度對粒徑的影響較大，且決定了生產(chǎn)時所需儀器的性能與功率，在剪切速度7 500 r/min，剪切時間240 s時，乳酸鈣粒徑已經(jīng)達到了設(shè)計要求?？紤]到生產(chǎn)設(shè)備與成本的制約，盡量選擇剪切速度最小的工藝參數(shù)，建議采用的工藝參數(shù)組合為：剪切速度7 500 r/min，剪切時間240 s，吐溫80添加量為最終反應(yīng)液中濃度為20 μL/L。驗證試驗制得乳酸鈣平均粒徑為95.1 nm。

A-響應(yīng)面試驗俯視等高線圖;B-響應(yīng)面試驗3D結(jié)果圖

此外，乳酸鈣的納米化重結(jié)晶，首次可析出乳酸鈣約為熱溶液中乳酸鈣總質(zhì)量的9.5%；再次加熱溶解乳酸鈣和表面活性劑進行循環(huán)生產(chǎn)，析出量約為再次溶解乳酸鈣量的99%。循環(huán)生產(chǎn)多次后，平均產(chǎn)率可達90%，且隨著循環(huán)次數(shù)的增加而增加。循環(huán)補料生產(chǎn)的方法，還有待進一步改進。

2.4 純化與干燥工藝參數(shù)的優(yōu)化

乳酸鈣不溶于乙醇，吐溫80溶解于乙醇中，為了提高純度，減少乳酸鈣損耗，選擇使用無水乙醇沖洗。為減少干燥過程中溫度對納米顆粒粒徑的影響，選擇冷凍干燥為納米乳酸鈣顆粒的干燥方式。中和反應(yīng)及重結(jié)晶過程均是在室溫下進行，因考慮到納米乳酸鈣的制備方法最終是要應(yīng)用到實際生產(chǎn)，而工廠化生產(chǎn)中進行大規(guī)模的降溫不是綠色、高效、經(jīng)濟的選擇，故在實驗過程中也應(yīng)貼近實際，選擇室溫(25℃左右)為試驗環(huán)境溫度。

由圖4-A，洗滌次數(shù)單因素試驗結(jié)果可知，用無水乙醇洗滌納米乳酸鈣達3次時，純度達到了最高值為99.5%，由于無水乙醇中含有少量水，造成了極少的損耗。由圖4-B無水乙醇添加量單因素試驗結(jié)果可知，隨著洗滌劑使用量的不斷增加，納米乳酸鈣的純度在隨之不斷的升高。當(dāng)無水乙醇的使用量達到納米乳酸鈣體積的5倍時。洗滌效果達到了最佳值，此時納米乳酸鈣純度為99.5%。由圖4-C干燥時長單因素試驗結(jié)果可知，冷凍干燥3 h后，納米乳酸鈣已經(jīng)完全干燥。故洗滌純化經(jīng)過純化與干燥過程的最佳工藝參數(shù)為5倍體積的無水乙醇洗滌3次后凍干3 h，此時制得的納米乳酸鈣粉體經(jīng)純度測定，純度為99.5%。

2.5 納米乳酸鈣產(chǎn)品表征與分析

2.5.1 FT-IR結(jié)果分析

2.5.2 XRD結(jié)果分析

通過XRD檢測方法，根據(jù)圖6對比乳酸鈣的XRD標準數(shù)據(jù)來源于ICDD數(shù)據(jù)庫，4個關(guān)鍵特征峰的2θ值均出在現(xiàn)在樣品的XRD圖譜中[23]，且衍射峰尖銳清晰，說明該樣品為L-乳酸鈣且純度高。觀察其性狀為白色且無味，與L-乳酸鈣應(yīng)有的表觀性狀一致。

A-無水乙醇洗滌次數(shù)；B-無水乙醇添加量；C-冷凍干燥時間

A-乳酸鈣標準紅外圖譜；B-納米乳酸鈣樣品的紅外結(jié)果圖

A-納米乳酸鈣XRD結(jié)果圖;B-乳酸鈣產(chǎn)品圖

2.5.3 TEM分析

為確定所制備的乳酸鈣樣品顆粒的尺寸及形貌，用TEM觀測形貌并測量粒徑。如圖7-ATEM測定結(jié)果所示，制備的納米乳酸鈣大小分布均勻，形態(tài)為圓球形。粒度統(tǒng)計分布如圖7-B，納米乳酸鈣固體平均粒徑為95.1 nm，統(tǒng)計顆粒數(shù)超過500個。

A-納米乳酸鈣TEM照片;B-乳酸鈣粒度分布統(tǒng)計結(jié)果

2.5.4 其他污染物監(jiān)測結(jié)果

ICP-MS檢測結(jié)果如表1所示，所有指標均符合GB1886.21—2016《食品添加劑乳酸鈣的食品安全國家標準》[13]的要求，說明利用吐溫80這種表面活性劑控制乳酸鈣粒徑、制備的納米乳酸鈣可安全食用。

表1 其他污染物含量表

3 結(jié)論

綜合以上分析結(jié)果，以廢棄貝殼為鈣源，通過中和反應(yīng)、納米化重結(jié)晶、純化干燥等過程制備納米乳酸鈣的較優(yōu)工藝條件為：每克貝殼粉添加0.9 mL乳酸溶液、中和反應(yīng)時間120 min；剪切速度7 500 r/min、剪切時間240 s、表面活性劑吐溫80最終反應(yīng)液中的濃度為20 μL/L；5倍體積的無水乙醇洗滌3次、凍干3 h。所制備的納米乳酸鈣平均粒徑為95.1 nm，純度達99.5%，且符合食品級添加劑的國標質(zhì)量要求。

本文研究了一種貝殼的高值化利用新方法及其較優(yōu)工藝條件，使用表面活性劑與高速剪切相結(jié)合的新方法控制乳酸鈣晶體的粒徑并防止其團聚。此方法與工藝適合工廠化生產(chǎn)納米級乳酸鈣，在整個生產(chǎn)過程中沒有苛刻的條件，制備工序少、成本低，且使用的試劑均為食品級，無有毒有害試劑，所制備的納米乳酸鈣符合食品級添加劑的國標。