李軍,羅娟,涂宗財(cái),3*,張露
1(江西師范大學(xué), 國(guó)家淡水魚(yú)加工技術(shù)研發(fā)專(zhuān)業(yè)中心,江西 南昌,330022)2(江西師范大學(xué) 江西省淡水魚(yú)高值化利用工程技術(shù)研究中心,江西 南昌,330022)3(南昌大學(xué), 食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江西 南昌,330047)
鰱魚(yú)(Hypophthalmichthysmolitrix)俗稱(chēng)為白鰱、水鰱等[1],具有生長(zhǎng)迅速、產(chǎn)量高、營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高等特點(diǎn),在2017年我國(guó)淡水養(yǎng)殖魚(yú)類(lèi)產(chǎn)量中位居第二,達(dá)到385.28萬(wàn)t[2-3]。在鰱魚(yú)的加工過(guò)程中,產(chǎn)生大量的魚(yú)骨、魚(yú)皮、魚(yú)鱗等副產(chǎn)物。其中,魚(yú)骨中含有豐富的蛋白、不飽和脂肪酸、鈣、磷等營(yíng)養(yǎng)成分,是一種優(yōu)良的營(yíng)養(yǎng)食物資源[4]。
近年來(lái),利用魚(yú)骨制備膠原多肽尤其是抗氧化肽成為了研究熱點(diǎn)[5-10]。相比陸生動(dòng)物來(lái)源的膠原多肽而言,水產(chǎn)動(dòng)物來(lái)源的膠原多肽沒(méi)有瘋牛病、豬瘟、禽流感等動(dòng)物疾病的威脅[11];同時(shí)與市場(chǎng)上常見(jiàn)二丁基羥基甲苯、丁基羥基茴香醚等存在致癌風(fēng)險(xiǎn)的抗氧化劑相比[12],水產(chǎn)動(dòng)物來(lái)源的天然抗氧化肽對(duì)人體更加安全、有效,其在食品、化妝品和醫(yī)療等領(lǐng)域中具有廣闊的應(yīng)用前景。
目前,以鰱魚(yú)骨為原料制備高抗氧化活性的膠原多肽的研究鮮有報(bào)道。本文以鰱魚(yú)骨為原材料,采用單因素實(shí)驗(yàn)、響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)確定鰱魚(yú)骨膠原多肽的最佳制備工藝,然后采用Sephadex G-25凝膠色譜對(duì)制備得到的膠原多肽進(jìn)行分離純化,得到高抗氧化活性的多肽組分。
新鮮鰱魚(yú)骨,由丹江口市優(yōu)優(yōu)水產(chǎn)開(kāi)發(fā)有限公司提供。
中性蛋白酶、堿性蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶、胰蛋白酶,北京索萊寶科技有限公司;復(fù)合蛋白酶,江蘇銳陽(yáng)生物科技有限公司;細(xì)胞色素C、抑肽酶、羥脯氨酸(色譜純),北京索萊寶科技有限公司;L-氧化型谷胱甘肽、三氟乙酸(色譜純),上海阿拉丁生化科技有限公司; 2,2′-聯(lián)氨-雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二胺鹽(2,2′-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid),ABTS)(分析純),北京索萊寶科技有限公司;三氯乙酸(trichloroacetic acid,TCA)、K3[Fe(CN)6]、FeCl3(分析純),上海阿拉丁生化科技股份有限公司;其他試劑均為分析純。
電子分析天平(FA1104N型),上海丙林電子科技有限公司;SevenCompact臺(tái)式pH計(jì)(S220),梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;數(shù)顯恒溫水浴鍋(HH-6型),國(guó)華電器有限公司;自動(dòng)凱氏定氮儀(SKD-800型),上海沛歐分析儀器有限公司;立式壓力蒸汽滅菌鍋(YXQ-LS-100SII),上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠;實(shí)驗(yàn)噴霧干燥塔(MDR-5型),無(wú)錫市現(xiàn)代噴霧干燥設(shè)備有限公司;冷凍干燥機(jī)(SR-AON-50),上海舍巖儀器有限公司;紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(U-2910型),Hitachi High-Tech Science Corporation;HSM高效液相色譜(D-2000),日本Hitachi公司;氨基酸分析儀(L-8900),日本Hitachi公司;紫外檢測(cè)儀(HD-21-88),上海琪特分析儀器有限公司;全自動(dòng)部分收集器(BSZ-160),上海青浦滬西儀器廠;精密蠕動(dòng)泵(BT100-2J),保定蘭格恒流泵有限公司;酶標(biāo)儀(Synergy H1),美國(guó)Bio Tek公司。
1.3.1 鰱魚(yú)骨預(yù)處理
鰱魚(yú)骨粉制備工藝:
鰱魚(yú)骨→解凍→沸水煮5 min→剔除魚(yú)肉和膜性組織→沖洗→高壓蒸煮(124 ℃、1.5 h)[4]→去上層脂肪→膠體磨→噴霧干燥→鰱魚(yú)骨粉
1.3.2 酶解提取工藝
膠原多肽提取工藝:
鰱魚(yú)骨粉→按一定料液比加水→調(diào)節(jié)pH→加酶→水浴酶解→滅酶(100 ℃,10 min)→離心→膠原多肽溶液→凍干→膠原多肽粉末
1.3.3 蛋白酶的篩選
分別選用中性蛋白酶、堿性蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶、胰蛋白酶和復(fù)合蛋白酶對(duì)魚(yú)骨粉進(jìn)行水解,其酶解條件如表1所示[13-14]。以膠原多肽得率結(jié)合水解度為指標(biāo),篩選出合適的蛋白酶。
表1 5種蛋白酶的酶解條件
注:5種蛋白酶酶活力參照SB/T 10317—1999《蛋白酶活力測(cè)定法》中福林酚法測(cè)定[15]。
1.3.4 魚(yú)骨膠原多肽提取工藝優(yōu)化
1.3.4.1 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)
采用復(fù)合蛋白酶水解魚(yú)骨粉制備膠原多肽,以膠原多肽得率結(jié)合水解度為指標(biāo)進(jìn)行單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)。分別固定其他因素,依次評(píng)價(jià)料液比(1∶20、1∶15、1∶10、1∶8、1∶6、1∶4,g∶mL)、酶添加量(2 000、4 000、6 000、8 000、10 000、12 000 U/g)、pH值(5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0)、酶解溫度(30、40、50、60、70、80 ℃)、酶解時(shí)間(1、2、3、4、5、6 h)對(duì)魚(yú)骨粉酶解效果的影響。
1.3.4.2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)
在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上,以膠原多肽得率為響應(yīng)值(Y),選取酶添加量(A)、酶解溫度(B)、酶解時(shí)間(C)對(duì)魚(yú)骨粉酶解影響較強(qiáng)的3個(gè)因素為自變量,利用Box-Behnken中心組合原理設(shè)計(jì)3因素3水平的響應(yīng)面試驗(yàn),探索從魚(yú)骨中制備膠原多肽的最佳條件。
1.3.5 評(píng)價(jià)指標(biāo)的測(cè)定
1.3.5.1 膠原多肽得率的測(cè)定
參照賈瑞波等[16]的方法略作修改,采用Folin-酚法測(cè)定酶解液中膠原多肽的含量。以質(zhì)量濃度為 0~200 μg/mL的牛血清白蛋白為橫坐標(biāo)(X),650 nm處的吸光值為縱坐標(biāo)(Y),繪制牛血清白蛋白的標(biāo)準(zhǔn)曲線:Y=0.001 6X-0.005 8(R2=0.998 5)。取1 mL稀釋到適宜濃度的酶解液進(jìn)行測(cè)定,其結(jié)果代入標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算酶解液中膠原多肽的含量。參照GB 5009.5—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中蛋白質(zhì)的測(cè)定》中凱氏定氮法進(jìn)行測(cè)定原料中總蛋白含量[17]。按公式(1)計(jì)算酶解液中膠原多肽得率:
(1)
1.3.5.2 水解度的測(cè)定
采用甲醛滴定法[18]測(cè)定酶解液中游離氨基氮含量,參照GB 5009.5—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中蛋白質(zhì)的測(cè)定》中凱氏定氮法進(jìn)行測(cè)定原料中總氮含量[17]。按公式(2)計(jì)算酶解液的水解度:
(2)
1.3.6 酶解液中膠原多肽分子質(zhì)量分布的測(cè)定
按照GB 31645—2018《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 膠原蛋白肽》中高效體積排阻色譜法(high performance size exclusion chromatography,HPSEC)進(jìn)行測(cè)定酶解液中膠原多肽分子質(zhì)量的分布情況[19]。按照上述最優(yōu)條件制備魚(yú)骨膠原多肽溶液,離心取上清液凍干,配制成2 mg/mL的溶液,過(guò)0.22 μm水系濾膜后,使用高效液相色譜儀(high performance liquid chromatograph,HPLC)上樣分析。以質(zhì)量濃度為2 mg/mL的細(xì)胞色素C(12 384 Da)、抑肽酶(6 511.51 Da)、L-氧化型谷胱甘肽(612.63 Da)和羥脯氨酸(131.13 Da)為標(biāo)準(zhǔn)品繪制相對(duì)分子質(zhì)量校正曲線。色譜柱:XBridge BEH 125? SEC(3.5 μm,(7.8×300) mm);流動(dòng)相:V(乙腈)∶V(水0.1%TFA)=40∶60;流速:0.5 mL/min;柱溫:30 ℃;進(jìn)樣量:10 μL。
1.3.7 Sephadex G-25分子篩層析
填料預(yù)處理:稱(chēng)量30 g Sephadex G-25干凝膠于300 mL燒杯中,加入適量的超純水并攪拌,于室溫下浸泡24 h后使其充分溶脹。
裝柱:選取規(guī)格16 mm×80 cm的層析柱,超純水洗凈后固定在鐵架臺(tái)上。出口接上乳膠管,先往層析柱內(nèi)加入少量的超純水,將預(yù)先準(zhǔn)備好的Sephadex G-25填料混勻,緩慢倒入層析柱至液面高度為2~3 cm。連接進(jìn)水口并打開(kāi)恒流泵,用超純水進(jìn)行平衡至液面高度不再發(fā)生改變。
上樣:將凍干的膠原多肽粉末用超純水配制成濃度為100 mg/mL,過(guò)0.22 μm水系濾膜后取2 mL上樣。
洗脫收集:洗脫液:超純水;流速:0.4 mL/min;紫外檢測(cè)波長(zhǎng):220 nm;每管收集量:4 mL。將同一組分合并收集,凍干并稱(chēng)其質(zhì)量。
1.3.8 不同分子質(zhì)量多肽氨基酸組成分析
參照GB 5009.124—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中氨基酸的測(cè)定》[20],采用氨基酸分析儀對(duì)樣品中氨基酸的含量進(jìn)行測(cè)定。
1.3.9 體外抗氧化活性的測(cè)定
1.3.9.1 ABTS+·清除能力的測(cè)定
采用KETNAWA等[21]方法以ABTS+·清除能力實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)不同分子質(zhì)量多肽的抗氧化能力:稱(chēng)取38.4 mg ABTS和6.623 mg過(guò)硫酸鉀混合,蒸餾水溶解后并定容至10 mL配成ABTS+·母液。室溫避光反應(yīng)12~16 h后用0.2 mol/L,pH 7.4的磷酸緩沖液(phosphate buffer saline,PBS)稀釋ABTS+·母液至在734 nm處的吸光值為0.7±0.2左右。分別移取50 μL稀釋到適宜濃度的樣品溶液與150 μL ABTS+·溶液于96孔酶標(biāo)板上混勻,室溫下避光反應(yīng)6 min后于734 nm處測(cè)定吸光值(Ai)。以50 μL蒸餾水代替樣品的反應(yīng)體系為控制組(Ac),以150 μL PBS代替ABTS+·溶液的反應(yīng)體系為樣品空白組(Aj),以50 μL蒸餾水和150 μL PBS分別代替樣品和ABTS+·溶液的反應(yīng)體系為空白組(Ab)。以谷胱甘肽(glutathione,GSH)為陽(yáng)性對(duì)照,結(jié)果用百分抑制率表示,采用Origin 8.6軟件中的多項(xiàng)擬合計(jì)算樣品清除50%的自由基所需樣品的濃度。按公式(3)計(jì)算ABTS+·清除能力:
(3)
1.3.9.2 還原能力的測(cè)定
采用賈韶千等[22]方法測(cè)定不同分子質(zhì)量多肽之間的還原能力。分別移取0.2 mL不同濃度的樣品溶液與0.5 mL 1 % K3[Fe(CN)6]混合,50 ℃水浴20 min后,加入0.5 mL 10% TCA終止反應(yīng)。將反應(yīng)液以5 000 r/min離心5 min,取上清液0.5 mL于離心管中,分別加入0.5 mL蒸餾水和0.2 mL 0.1 % FeCl3,搖勻后置于50 ℃水浴10 min。取200 μL溶液于700 nm處測(cè)定吸光值。0.2 mL蒸餾水代替FeCl3作為空白對(duì)照。以GSH為陽(yáng)性對(duì)照,OD1.0值表示使反應(yīng)體系的吸光值為1.0時(shí)所需要的樣品濃度。
在蛋白酶的作用下,魚(yú)骨中的膠原蛋白會(huì)進(jìn)行水解形成膠原多肽,過(guò)度水解則會(huì)進(jìn)一步將膠原多肽水解成小分子質(zhì)量的短肽和游離氨基酸,導(dǎo)致膠原多肽含量的降低[23]。5 種不同蛋白酶對(duì)鰱魚(yú)骨的酶解效果如圖1所示。其中,風(fēng)味蛋白酶的水解度最高,然后依次是復(fù)合蛋白酶、中性蛋白酶、堿性蛋白酶和胰蛋白酶。經(jīng)復(fù)合蛋白酶酶解之后,酶解液中膠原多肽得率最高,達(dá)到43.72 %(P<0.05),風(fēng)味蛋白酶與復(fù)合蛋白酶相比,其膠原多肽含量低,是由于水解度高,比其他酶水解更加徹底,由于部分膠原多肽水解形成氨基酸所致。而堿性蛋白酶、中性蛋白酶和胰蛋白酶水解鰱魚(yú)骨中膠原蛋白的能力弱于復(fù)合蛋白酶,水解度較低,故膠原多肽含量低于復(fù)合蛋白酶。由此可見(jiàn),在酶活力和酶解時(shí)間相同的情況下,復(fù)合蛋白酶酶解鰱魚(yú)骨制備膠原多肽的效率最高。本次實(shí)驗(yàn)使用的復(fù)合蛋白酶是由多種酶混合復(fù)配而成,主要以堿性蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶為主,其主要作用位點(diǎn)是疏水氨基酸[24],與其他蛋白酶相比,可以獲得更多的抗氧化肽。經(jīng)酶活力測(cè)定,復(fù)合蛋白酶的酶活力高于堿性蛋白酶(單酶),且風(fēng)味蛋白酶的存在又可以降低苦味肽的形成[25],適用于骨、肉副產(chǎn)物的水解和骨膠原多肽的生產(chǎn)。為了更好地制備高抗氧化活性膠原多肽,節(jié)約成本,綜合考慮選擇復(fù)合蛋白酶用于后續(xù)魚(yú)骨膠原多肽制備工藝的優(yōu)化。
圖1 5種蛋白酶的酶解效果
復(fù)合蛋白酶酶解鰱魚(yú)骨制備膠原多肽的單因素試驗(yàn)結(jié)果如圖2-a~圖2-e所示。由圖2-a可知,膠原多肽得率隨料液比的增大呈下降的趨勢(shì),水解度先上升后趨于平穩(wěn),在料液比為1∶10(g∶mL)時(shí),其膠原多肽含量和水解度都較高,當(dāng)料液比繼續(xù)增大,膠原多肽得率反而下降。由圖2-b可知,膠原多肽得率和水解度隨著酶添加量的增加而呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì),當(dāng)酶添加量為8 000 U/g時(shí),膠原多肽得率最高,達(dá)49.00 %(P<0.05),繼續(xù)增大酶添加量,膠原多肽得率反而下降。由圖2-c可知,膠原多肽得率和水解度隨著pH的增加而呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì),當(dāng)pH為8.0時(shí),膠原多肽得率最高,達(dá)44.38 %(P<0.05)。圖2-a~圖2-c的結(jié)果與劉靜[26]的報(bào)道相一致,原因在于底物濃度隨著料液比的增大而增大,但一定量的酶無(wú)法酶解過(guò)多的底物,導(dǎo)致膠原多肽增加的比例小于底物增加的比例,這也是底物濃度越大其膠原多肽得率越小的主要原因;在適宜溫度的條件下,復(fù)合蛋白酶含量增加,使底物和蛋白酶更加充分反應(yīng),水解度和膠原多肽得率增大,當(dāng)酶量增加到一定量的時(shí)候,酶和底物結(jié)合位點(diǎn)達(dá)到飽和,此時(shí)再增加酶量也不會(huì)促進(jìn)底物的水解,反而造成酶的浪費(fèi);pH過(guò)低或過(guò)高都會(huì)影響復(fù)合蛋白酶的活性,進(jìn)而影響酶解效果。
由圖2-d可知,隨著酶解溫度的升高,膠原多肽得率呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì),當(dāng)酶解溫度為50 ℃時(shí),膠原多肽得率達(dá)到最大值40.72 %(P<0.05),其原因是溫度過(guò)高會(huì)導(dǎo)致復(fù)合蛋白酶的酶活力下降甚至失活,產(chǎn)物形成的方向發(fā)生改變[22],這與圖2-c中過(guò)低或過(guò)高的pH會(huì)導(dǎo)致膠原多肽得率和水解度降低的解釋相一致。由圖2-e可知,隨著酶解時(shí)間的增加,膠原多肽得率呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì),而水解度呈現(xiàn)先上升后趨于平穩(wěn)的趨勢(shì),在當(dāng)酶解時(shí)間為4 h時(shí),膠原多肽得率達(dá)到最大值(49.59%)(P<0.05)。當(dāng)酶解反應(yīng)開(kāi)始后,酶與底物激烈反應(yīng),使原料的水解度和膠原多肽得率增大,但隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng),膠原多肽會(huì)被過(guò)度水解成氨基酸,使得膠原多肽得率下降[27]。
a-液料比;b-酶添加量;c-pH;d-酶解溫度;e-酶解時(shí)間
2.3.1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果分析
根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果,選取酶添加量(A)、酶解溫度(B)、酶解時(shí)間(C)3因素,利用Box-Behnken中心組合原理設(shè)計(jì)3因素3水平的響應(yīng)面試驗(yàn),試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。
表2 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)和膠原多肽得率結(jié)果
對(duì)表2中的試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行回歸分析,得到二次多項(xiàng)式方程:Y=48.57+0.80A+0.98B+1.81C+0.76AB+0.75AC+2.500E-003BC-3.99A2-5.05B2-2.38C2,回歸模型方差分析和系數(shù)顯著性結(jié)果如表3所示。
表3 回歸模型方差分析和系數(shù)顯著性檢驗(yàn)
2.3.2 各因素相互作用分析
酶添加量(A)、酶解溫度(B)、酶解時(shí)間(C)之間交互作用的響應(yīng)面圖和等高線圖如圖3所示,可直觀分析2個(gè)因素之間交互作用對(duì)膠原多肽得率的影響程度。等高線的形狀可反映出各因素相互作用的強(qiáng)弱,橢圓形則代表2個(gè)因素交互作用具有顯著影響,而接近圓形則代表不顯著。由表3和圖3分析可知,因素A、B、C、A2、B2、C2項(xiàng)對(duì)膠原多肽得率的影響呈現(xiàn)極顯著水平(P<0.01),因素A和B交互作用的等高線圖呈橢圓形,對(duì)膠原多肽得率的影響具有顯著差異(P<0.05),而因素A和C、因素B和C之間的交互作用呈圓形,對(duì)膠原多肽得率沒(méi)有顯著影響。由圖3結(jié)合表3中的F值分析可知,各因素對(duì)膠原多肽得率的影響次序:酶解時(shí)間>酶解溫度>酶添加量,剔除不顯著項(xiàng)AC、BC,模型方程進(jìn)行優(yōu)化得到:Y=48.57+0.80A+0.98B+1.81C+0.76AB-3.99A2-5.05B2-2.38C2。
圖3 酶添加量、酶解溫度和酶解時(shí)間交互作用對(duì)膠原多肽得率的影響
2.3.3 最優(yōu)條件的驗(yàn)證
采用軟件對(duì)優(yōu)化后的回歸方程分析可知,當(dāng)酶添加量為8 220.30 U/g、酶解溫度為51.06 ℃、酶解時(shí)間為4.38 h時(shí),此時(shí)的膠原多肽得率最高,其理論值為49.00 %。按照該條件進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn),為了方便操作,選取酶添加量為8 220 U/g、酶解溫度為51℃、酶解時(shí)間為4.5 h時(shí),驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次,測(cè)定膠原多肽得率為(49.00±0.80) %,非常接近理論值,無(wú)顯著性差異(P>0.05),此條件是膠原多肽制備的最優(yōu)條件,證明該模型方程可行。
標(biāo)準(zhǔn)品及其混標(biāo)的HPLC色譜圖如圖4-a所示,依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品與保留時(shí)間的關(guān)系,以相對(duì)分子質(zhì)量的對(duì)數(shù)(lg MW)對(duì)保留時(shí)間(T)作線性回歸得到相對(duì)分子質(zhì)量校正曲線,如圖4-b所示,其相對(duì)分子質(zhì)量校正曲線方程:lg MW=6.821 42-0.246 15T(R2=0.997 05)。表明相對(duì)分子質(zhì)量的對(duì)數(shù)(lg MW)與保留時(shí)間T(min)具有良好的線性關(guān)系,根據(jù)膠原多肽的出峰時(shí)間和相對(duì)分子質(zhì)量校正曲線方程,可計(jì)算膠原多肽粉末各組分的分子質(zhì)量。
a-液相色譜;b-校正曲線
魚(yú)骨膠原多肽粉末的HPLC色譜圖和分子質(zhì)量分布如圖5和表4所示,圖中主要出現(xiàn)5個(gè)峰,表明魚(yú)骨膠原多肽是由5種不同分子質(zhì)量膠原多肽組分所組成,且膠原多肽分子質(zhì)量分布廣,大小不一。由圖5和表4可知,利用復(fù)合蛋白酶對(duì)魚(yú)骨粉酶解,其膠原多肽主要集中在組分Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ,分子質(zhì)量為400~3 000 Da,且組分Ⅲ含量最高,約為56.58 %。根據(jù)膠原多肽分子質(zhì)量分布的HPLC色譜圖,采用Sephadex G-25分子層析將其分離純化。
圖5 魚(yú)骨膠原多肽的高效液相色譜圖
凝膠過(guò)濾是一種基于分子質(zhì)量大小分離肽的有效方法,已經(jīng)被廣泛用于混合組分多肽的分離[28]。魚(yú)骨膠原多肽經(jīng)Sephadex G-25柱洗脫分離之后的圖譜及各組分含量如圖6和表5所示。魚(yú)骨膠原多肽被分離成5個(gè)組分,凍干后組分Ⅰ~Ⅴ的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為5.50%、28.49%、36.25%、7.55%和1.26%,組分Ⅲ的響應(yīng)值和含量最高(P<0.05)。除去在分離過(guò)程中的損失量,其各組分的相對(duì)含量與HPLC的結(jié)果基本一致。其中,組分Ⅴ的含量低,分離1次僅有(2.53±0.04)mg的收集量,因考慮時(shí)間、經(jīng)濟(jì)成本等具體影響,故收集前4個(gè)組分作為后續(xù)的研究對(duì)象。
表4 魚(yú)骨膠原多肽不同組分的分子量及相對(duì)含量
注:相對(duì)含量的數(shù)據(jù)來(lái)源于HPLC。
圖6 魚(yú)骨膠原多肽的Sephadex G-25注洗脫圖譜
表5 不同膠原多肽組分的含量
注:酶解液濃度為100 mg/mL,一次上樣體積2 mL。
對(duì)樣品進(jìn)行氨基酸組成分析,其含量如表6所示。
表6 膠原多肽及其組分的氨基酸含量比較
注:*表示該氨基酸為疏水氨基酸,#表示該氨基酸為必需氨基酸,ND表示末檢測(cè)出該氨基酸。
膠原多肽粉末中甘氨酸(Gly)含量最高,谷氨酸(Glu)、脯氨酸(Pro)、丙氨酸(Ala)和天冬氨酸(Asp)的含量也相對(duì)較高,符合膠原蛋白氨基酸組成特征[29]。且樣品分子質(zhì)量較小,主要集中在400~3 000因此可以認(rèn)為該粉末中主要成分是膠原多肽。當(dāng)多肽的N-端或C-端存在疏水氨基酸時(shí),有利于多肽在脂質(zhì)中的溶解,從而提高其抗氧化活性[30-31],如SONG等[30]使用內(nèi)源性蛋白酶對(duì)魷魚(yú)內(nèi)臟進(jìn)行酶解,其水解物中疏水氨基酸的相對(duì)含量達(dá)到38.52%,有助于形成疏水結(jié)構(gòu),使得其具有顯著的抗氧化性。如表6所示,膠原多肽粉末的疏水氨基酸含量?jī)H有33.42 %,經(jīng)Sephadex G-25柱洗脫之后,組分Ⅲ和組分Ⅳ的疏水氨基酸含量增加,分別為40.45 %和44.37%。除此之外,膠原多肽和各組分含有一定量的必需氨基酸。綜上所述,鰱魚(yú)骨膠原多肽中某些組分可以作為一種高營(yíng)養(yǎng)的抗氧化劑膳食補(bǔ)充劑。
2.7.1 ABTS+·清除能力
膠原多肽及其各組分的ABTS+·清除能力如圖7所示,其IC50值如表7所示。在樣品的測(cè)試濃度(0.015~1.0 mg/mL),所有樣品均具有較好的ABTS+·清除能力,且ABTS+·清除能力隨著樣品濃度的遞增而增加。組分Ⅳ具有最強(qiáng)的ABTS+·清除能力(P< 0.05),其IC50值為0.02 mg/mL,明顯低于膠原多肽粉末(IC50=0.15 mg/mL)、組分Ⅲ(IC50=0.47 mg/mL)、組分Ⅱ(IC50=0.69 mg/mL)和組分Ⅰ(IC50=0.74 mg/mL),略高于GSH(IC50=0.01 mg/mL)。由表6可知,組分Ⅳ的疏水氨基酸含量最高,使其抗氧化性增加;而膠原多肽粉末的ABTS+·清除能力卻強(qiáng)于組分Ⅲ,這是因?yàn)橐恍┓鞘杷被?,如Gly、Asp和Lys,其含量的高低也與抗氧化活性有關(guān)[32-33],而膠原多肽中的Gly、Asp和Lys含量遠(yuǎn)高于組分Ⅲ,故導(dǎo)致膠原多肽粉末的ABTS+·清除能力強(qiáng)于組分Ⅲ。CHI等[34]從大黃魚(yú)肉中分離出3種抗氧化肽,其中ABTS+·清除能力最高的5肽, IC50為0.31 mg/mL,其抗氧化活性低于組分Ⅳ。
圖7 膠原多肽及其不同組分的ABTS+·清除能力
表7 膠原多肽及其不同組分的ABTS+·清除能力 的IC50值和還原能力的OD1.0值
注:ND表示末檢測(cè)。
2.7.2 還原能力
樣品中的還原劑能將鐵氰化鉀(Fe+3)還原成亞鐵氰化鉀(Fe2+),進(jìn)一步和FeCl3反應(yīng)生成在700 nm處具有最大吸光度的普魯士藍(lán),其吸光值越大,則表示還原能力及抗氧化性越強(qiáng)[35-36]。鰱魚(yú)骨膠原多肽及其組分的還原能力如圖8所示,其OD1.0值如表7所示。在樣品的測(cè)試濃度(0~50 mg/mL),所有樣品均有還原能力,且還原能力隨著樣品濃度的遞增而增加。組分Ⅳ具有最強(qiáng)的還原能力(P< 0.05),其OD1.0值為19.16 mg/mL,明顯低于膠原多肽粉末(OD1.0=21.85 mg/mL)、組分Ⅲ(OD1.0=47.49 mg/mL)、組分Ⅰ和組分Ⅱ,高于GSH(OD1.0=0.86 mg/mL),各樣品的還原能力結(jié)果與ABTS+·清除能力基本一致。楊露等[5]制備的馬面魚(yú)骨多肽在50 mg/mL的A700 nm的值僅約為0.4,其還原能力遠(yuǎn)低于本論文的膠原多肽粉末和各組分。
圖8 膠原多肽及其不同組分的還原能力
本論文以鰱魚(yú)骨為原材料,以膠原多肽得率結(jié)合水解度為指標(biāo),篩選出復(fù)合蛋白酶為制備魚(yú)骨中膠原多肽的最優(yōu)酶。通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)、響應(yīng)面優(yōu)化確定鰱魚(yú)骨制備膠原多肽的最佳工藝條件為:酶添加量為8 220 U/g、酶解溫度為51℃、酶解時(shí)間為4.5 h,此時(shí),膠原多肽得率為49.00 %。通過(guò)高效體積排阻色譜法分析得出其膠原多肽由5個(gè)組分組成,分子質(zhì)量主要集中在400~3 000 Da。經(jīng)Sephadex G-25過(guò)濾色譜法分離,各組分都具有一定的抗氧化能力,其中組分Ⅳ的ABTS+·清除能力和還原能力最高,其IC50和OD1.0值分別為0.02 mg/mL和19.16 mg/mL。本實(shí)驗(yàn)的研究可為制備高抗氧化魚(yú)骨多肽提供數(shù)據(jù)支撐,也可為提高魚(yú)骨資源利用率提供理論依據(jù)。