八月瓜果皮中常春藤皂苷元水解工藝優(yōu)化及圖譜分析

石兵艷，李祥，劉毅，王蕓

(陜西科技大學(xué) 化學(xué)與化工學(xué)院, 農(nóng)林技術(shù)推廣工程中心，陜西 西安, 710021)

常春藤皂苷元，又名(3β，4α)-3，23-二羥基齊墩果-12-烯-28-酸，分子式C30H4804，屬于齊墩果烷型五環(huán)三萜類化合物，是許多天然產(chǎn)物的活性成分[1]，廣泛存在于多種藥用植物中[2]。對于常春藤皂苷元的研究，只有從各種植物中對所有有效成分的提取、分離及純化得到常春藤皂苷元[3-4]、采用高效液色譜對其進(jìn)行含量測定[5]，沒有研究者系統(tǒng)地對常春藤皂苷元工藝優(yōu)化及含量測定進(jìn)行研究。

八月瓜為木通科木通屬攀援式常年生藤本植物三葉木通的果實(shí)，是野生水果珍品[6-12]，SYUJIL等[13]在三葉木通的果皮中分離得到11個三萜皂苷，常春藤皂苷元是將皂苷成分水解后得到產(chǎn)物[14]。八月瓜果皮厚實(shí)，是提取皂苷元的優(yōu)良來源。

本實(shí)驗(yàn)以通過超聲輔助提取的皂苷粉末，進(jìn)一步水浴水解為常春藤皂苷元的得率為指標(biāo)，探尋水解常春藤皂苷元的最佳工藝條件，并在最優(yōu)條件下用高效液相色譜法測定八月瓜果皮中常春藤皂苷元的含量。采用傅立葉紅外光譜對常春藤皂苷元主要官能團(tuán)進(jìn)行分析，且與常春藤皂苷元標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行對照分析；采用核磁共振對常春藤皂苷元結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，與文獻(xiàn)報(bào)道中的常春藤皂苷元核磁共振數(shù)據(jù)進(jìn)行比較分析。本文將為陜西戶縣八月瓜基地的八月瓜果皮中常春藤皂苷元的提取、含量測定、以及結(jié)構(gòu)分析提供參考價值。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

八月瓜果皮，由陜西戶縣八月瓜基地提供(2019.11)；HCl、H3PO4、乙醇、丙酮、正丁醇、氯仿、KBr(分析純)，乙腈、甲醇(色譜純)，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；氘代二甲基亞砜dimethylsulfoxide-d6(D,99.96%)(色譜純)，麥克林；常春藤皂苷元標(biāo)品，上海源葉生物科技有限公司。

BSA224S電子天平，賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司；H-H數(shù)顯恒溫水浴鍋，國華電器有限公司；R201L旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海申生科技有限公司；DGH-9145A電熱鼓風(fēng)干燥箱，上海—恒科學(xué)儀器有限公司；KH-200KDB型高功率數(shù)控超聲波清洗器，昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司；EClasscial 3100高效液相色譜儀，大連依利特分析儀器有限公司；傅立葉紅外光譜儀，德國布魯克Bruker公司；BrukeravanceⅢ-400MHz核磁共振波譜儀，德國布魯克Bruker公司。

1.2 方法

1.2.1 皂苷的提取

準(zhǔn)確稱取5.00g八月瓜果皮粉末，按照料液比1∶15(g∶mL)加入75%乙醇溶液密封浸泡15 h，然后溫度68℃，功率160W，超聲萃取30 min，過濾收集上清液，將濾渣繼續(xù)用相同料液比的乙醇溶液萃取，提取2次。合并萃取液減壓蒸餾揮干，加入15 mL丙酮超聲萃取綠原酸20 min，去掉丙酮萃取液。將未溶于丙酮中提取物加入15 mL蒸餾水劇烈搖動至全溶，用水飽和的正丁醇溶液純化萃取3次，第1次和第2次用20 mL，第3次15 mL，合并水飽和的正丁醇萃取液濃縮揮干即為皂苷成品[15]，收集粉末備待用。

1.2.2 常春藤皂苷元的水解

準(zhǔn)確稱取0.200 0 g 1.1.1項(xiàng)下提取的皂苷粉末，加入20 mL甲醇，一定體積分?jǐn)?shù)的HCl 5 mL，在一定溫度下水浴回流水解，待室溫后向其加入10 mL蒸餾水，用氯仿純化萃取2次，第1次用15 mL，第2次10 mL，然后合并氯仿層，減壓蒸干得到常春藤皂苷元成品。

(1)

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素對皂苷元水解的影響

2.1.1 HCl體積對皂苷元水解的影響

按照1.1.2中方法，分別加入HCl體積為5%、10%、15%、20%、25%、30%、36%對皂苷水解，探索HCl體積分?jǐn)?shù)對皂苷元水解的影響。由圖1可知，HCl體積分?jǐn)?shù)5%～25%，皂苷元得率呈現(xiàn)迅速遞增趨勢，而25%～36%呈現(xiàn)緩慢變化，因此皂苷元水解時HCl體積分?jǐn)?shù)為25%為宜。當(dāng)HCl體積分?jǐn)?shù)過小時，水解不完全；當(dāng)過大時，由于劇烈條件下苷元結(jié)構(gòu)發(fā)生脫水、環(huán)合、雙鍵位移等變化，從而使得皂苷元得率降低[16]。

圖1 HCl體積分?jǐn)?shù)對常春藤皂苷元水解的影響

2.1.2 溫度對皂苷元水解的影響

按照1.1.2中方法，加入25%HCl 5mL，分別在60、70、80、90、95 ℃條件下，探索溫度對皂苷元水解的影響。由圖2可知，溫度60～80 ℃時，呈現(xiàn)遞增趨勢，而80 ℃之后呈現(xiàn)遞減趨勢，因此溫度80 ℃為宜。皂苷元得率隨著水解溫度的升高而逐漸增大，可能是由于溶劑分子與皂苷分子運(yùn)動劇烈，擴(kuò)散增強(qiáng)所致；溫度過高，得率降低的原因：(1)溫度過高使得乙醇揮發(fā)，減少了萃取溶劑，(2)會導(dǎo)致部分苷元結(jié)構(gòu)發(fā)生發(fā)轉(zhuǎn)變，生成其他物質(zhì)[17]。

圖2 溫度對常春藤皂苷元水解的影響

2.1.3 水解時間對皂苷元水解的影響

按照1.1.2中方法，加入25%HCl 5 mL，溫度為80℃，分別水解0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4 h，探索時間對皂苷元水解的影響。由圖3可知，水解時間0.5～3.0 h時，皂苷元水解得率呈現(xiàn)逐漸遞增趨勢，而3.0～3.5 h時緩慢變化，呈現(xiàn)出持平，3.5 h以后遞減，考慮到時間、能量選擇3 h為宜。隨著水解時間加長，由于產(chǎn)生的熱效應(yīng)，使得率增加，但是水解時間過長，會使得皂苷元結(jié)構(gòu)破壞，導(dǎo)致皂苷元得率降低，或者可能存在副反應(yīng)的進(jìn)行，導(dǎo)致皂苷元的生成逐漸減少[18]。

圖3 時間對常春藤皂苷元水解的影響

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計(jì)

在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以HCl體積分?jǐn)?shù)，水解溫度，水解時間3個因素為考察對象，每個因素選擇3個水平，以常春藤皂苷元的得率作為響應(yīng)值，利用Design-Expert 10.0進(jìn)行響應(yīng)面分析，實(shí)驗(yàn)因素與水平見表1。

表1 Box-Behnken實(shí)驗(yàn)因素與水平

2.3 響應(yīng)面設(shè)計(jì)及結(jié)果分析

2.3.1 回歸模型的建立及數(shù)據(jù)分析

根據(jù)實(shí)驗(yàn)過程進(jìn)行優(yōu)化實(shí)驗(yàn)。根據(jù)表1設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見表2。

表2 Box-Behnken實(shí)驗(yàn)結(jié)果

各因素回歸擬合后，得到常春藤皂苷元水解的回歸方程為：Y=62.04+0.73A+3.17B-3.94C+5.63AB-1.98AC+2.14BC-5.98A2-5.88B2-7.92C2，二次回歸擬合后的回歸方程分析見表3。由表3實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析，可知水解時間、水解溫度和HCl體積分?jǐn)?shù)3個因素對常春藤皂苷元的水解均為顯著影響因子，其中水解溫度和鹽酸體積分?jǐn)?shù)為極顯著。該模型F=312.07，P=0.000 1(P<0.05)，表明模型極顯著，而失擬項(xiàng)的F=0.465 2，P>0.05失擬不顯著，校正決定系數(shù)R2=0.994 3，說明模型擬合程度良好，且誤差小。

表3 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果

注：P<0.01差異極顯著；P<0.05差異顯著。

2.3.2 響應(yīng)面分析

圖4為根據(jù)回歸結(jié)果繪制的各因素關(guān)于常春藤皂苷元水解響應(yīng)曲面圖和等高線圖，考察擬合響應(yīng)面的形狀，分析各因素對皂苷水解得率的影響。圖a中三維響應(yīng)面的形狀都與拋物線圖形相似，說明皂苷元水解得率的最大值出現(xiàn)在中間點(diǎn)處，此模型存在最大值的穩(wěn)定點(diǎn)。圖b等高線中圓心都存在且位于其橢圓內(nèi)部，交互作用顯著，且A和B等高線圖形狀更趨近與橢圓，交互作用極顯著。

2.3.3 響應(yīng)面條件優(yōu)化及驗(yàn)證試驗(yàn)

通過軟件分析，常春藤皂苷元水解的最佳工藝條件為水解時間3.133 h、溫度81.772℃、HCl體積分?jǐn)?shù)23.828%。在此條件下，八月果果皮中提取到的皂苷元水解得率預(yù)測值可達(dá)63.156%。為了試驗(yàn)方便操作，將工藝條件進(jìn)行修正為水解時間3.2 h、溫度82℃、HCl體積分?jǐn)?shù)24%。在此條件下驗(yàn)證皂苷元水解試驗(yàn)，得率均值為61.423%，與預(yù)測值 63.156%相近，說明響應(yīng)面優(yōu)化皂苷元水解的工藝條件可行。

2.4 常春藤皂苷元含量測定

2.4.1 色譜條件

色譜柱: Hypersil ODS C18色譜；檢測器：DAD3100二極管陣列檢測器；柱溫：27℃；流動相：乙腈-0.1%磷酸水溶液(體積比20∶80)；流速：1 mL/min，進(jìn)樣量：20 μL。在此條件下對常春藤皂苷元對照品溶液和樣品溶液進(jìn)行測定。在此色譜條件下分析常春藤皂苷元對照品和樣品，由圖5常春藤皂苷元標(biāo)品的保留時間為22.71 min，圖6八月瓜果皮中常春藤皂苷元樣品保留時間為22.55 min，因此標(biāo)品與樣品得到保留時間基本一致。

a、b-水解時間和溫度交互作用;c、d-水解時間和鹽酸體積交互作用;e、f-溫度和HCl體積分?jǐn)?shù)交互作用

圖5 常春藤皂苷元標(biāo)品的HPLC譜圖

圖6 八月瓜果皮中常春藤皂苷元HPLC譜圖

2.4.2 對照品溶液的配制

精確稱取常春藤皂苷元標(biāo)準(zhǔn)品10.00 mg，用V(甲醇)∶V(二氧甲烷)=5∶1溶解，然后定容于10 mL容量瓶，配成質(zhì)量濃度為1 mg/mL常春藤皂苷元對照品溶液。

2.4.3 供試品溶液的配制

將2.3.3項(xiàng)下最優(yōu)條件下水解得到常春藤皂苷元，用色譜甲醇溶解并定容于10 mL容量瓶。

2.4.4 線性關(guān)系的考察

精密移取常春藤皂苷元標(biāo)準(zhǔn)品溶液1.6，1.2，0.4，0.2和2 mL的容量瓶中，用色譜甲醇稀釋至刻度，得到成質(zhì)量濃度分別為800、600、200、100 μg/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，在上述色譜條件下測定，以對照品濃度(X)為橫坐標(biāo)，峰面積(Y)為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，計(jì)算得回歸方程為：Y=2 866.81X-60.451 6，R2=0.999 7，常春藤皂苷元濃度在0.1～1 mg/mL線性關(guān)系良好。

圖7 常春藤皂苷元的標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.4.5 精密度試驗(yàn)

精密吸取質(zhì)量濃度為1 mg/mL的對照品溶液20 μL，按上述色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄其峰面積，常春藤皂苷元峰面積的RSD=0.73%(n=6)，表明儀器精密度良好。

表4 精密度試驗(yàn)

2.4.6 重復(fù)性試驗(yàn)

取已提取的皂苷粉末6份進(jìn)行水解，采用2.4.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別置在上述色譜條件測定，記錄峰面積，計(jì)算含量。結(jié)果如表5所示，由表5可以看出，RSD=1.6%，表明此方法重現(xiàn)性良好。

表5 重復(fù)性試驗(yàn)

2.4.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一樣品溶液，每隔2 h 進(jìn)樣20 μL，在上述色譜條件下測定6次，記錄其峰面積，計(jì)算得RSD=2.4%，所測得的RSD小于3%，說明供試品溶液在11 h內(nèi)是穩(wěn)定的，具體數(shù)據(jù)見表6。

表6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

2.4.8 加樣回收率試驗(yàn)

精密稱取已知含量的八月瓜皂苷粉末0.2 g，共6份，分別精密加入常春藤皂苷元對照品0.6 mL(濃度為1.00 mg/mL)，按照實(shí)驗(yàn)方法制備，按上述色譜條件進(jìn)行測定，并計(jì)算常春藤皂苷元的回收率，結(jié)果見表7，從表7中可以看出，加標(biāo)回收率為97.06%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.73%，表明所建立的方法能夠滿足實(shí)際樣品的分析要求。

表7 回收率實(shí)驗(yàn)

2.4.9 樣品含量測定

取從八月瓜果皮中提取的皂苷粉末0.191 1g，按1.2.1的方法進(jìn)行水解，按2.4.3方法配制供試品溶液進(jìn)行測定，平行試驗(yàn)3次，結(jié)果表明，八月瓜果皮中常春藤皂苷元的含量為11.559 0、11.516 5、11.594 8 mg/g，所以八月瓜果皮中常春藤皂苷元含量為(11.556 75±0.039 221) mg/g。

2.5 核磁共振分析

由圖8可知，在低場處δ12.07(1H，s，COOH)為羧基上的的氫信號，δ5.18(1H，brs，H-12)為12位上烯基上的氫信號，δ4.32(1H，s，-OH)為羥基上的氫信號，δ3.24(1H，m，H-3)是連接羥基碳上的氫信號，δ1.24(3H，s，H-27)為27位甲基上的氫信號，δ1.10(3H，s，H-30)為30位上甲基上的氫信號，δ0.88(3H，s，H-26)是26位甲基上的氫信號，δ0.71(3H，s，H-26)為26位甲基上的氫信號，δ0.54(3H，s，H-23)為23位甲基上的氫信號。

圖8 常春藤皂苷元的核磁共振HNMR譜

由圖9可知，在碳譜的低場處δ179.07(C-28)是羧基上的碳信號，δ121.95(C-12)和δ144.38(C-13)分別是12位、13位雙鍵上的碳信號，δ75.92(C-3)是連接—OH上的—CH的碳信號，δ64.30(C-23)是連接—OH上的—CH2的碳信號。在碳譜的高場區(qū)δ14.19(C-24)、δ15.02(C-25)、δ17.22(C-26)、δ26.50(C-27)、δ33.30(C-29)、δ23.03(C-30)是6個-CH3的碳信號。以及其他的飽和碳信號δ38.95(C-1)、δ27.07(C-2)、δ42.96(C-4)、δ46.42(C-5)、δ17.36(C-6)、δ31.78(C-7)、δ40.82(C-8)δ47.51(C-9)、δ37.83(C-10)、δ22.58(C-11)、δ41.83(C-14)、δ27.62(C-15)、δ26.9(C-16)、δ46.11(C-17)、δ41.24(C-18)、δ45.89(C-19)、δ30.09(C-20)、δ33.71(C-21)、δ32.13(C-22)。

圖9 常春藤皂苷元的核磁共振13CNMR譜

綜上所述，所提取的化合物與文獻(xiàn)[4，19-20]所報(bào)道的常春藤皂苷元核磁數(shù)據(jù)基本一致，其核磁1HNMR13CNMR數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道比較見表8。

2.6 傅立葉紅外光譜分析

表8 常春藤皂苷元的核磁共振數(shù)據(jù)

圖10 常春藤皂苷元的紅外光譜

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)以通過超聲輔助提取的皂苷粉末，進(jìn)一步水浴水解為常春藤皂苷元的得率為指標(biāo)，探索了HCl體積、水解時間、溫度各影響因素，并根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果設(shè)計(jì)了響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)，確定了水解常春藤皂苷元的最佳工藝條件，并在最優(yōu)條件下建立八月瓜果皮中常春藤皂苷元的含量測定方法，高于文獻(xiàn)匯報(bào)的陜西常春藤皂苷元含量5.26 mg/g。采用傅立葉紅外光譜對常春藤皂苷元主要官能團(tuán)進(jìn)行分析；采用核磁共振對常春藤皂苷元結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，與文獻(xiàn)報(bào)道中的常春藤皂苷元核磁共振數(shù)據(jù)基本一致[4，19-20]。其主要結(jié)論如下：

(1)通過單因素與響應(yīng)面分析來優(yōu)化水解條件。探討了HCl體積分?jǐn)?shù)、溫度和水解時間對常春藤皂苷元得率的影響。得到最佳的水解條件：水解時間3.2 h、溫度82℃、HCl體積分?jǐn)?shù)24%，在該條件下常春藤皂苷元得率為61.423%，常春藤皂苷元水解得率高，接近預(yù)期結(jié)果。

(2)以乙腈-0.1%磷酸(體積比20∶80)溶液為流動相，檢測波長為210 nm，建立了高效液相色譜法測定八月瓜果皮中常春藤皂苷元的方法。結(jié)果表明，常春藤皂苷元在0.1～1 mg/mL具有線性關(guān)系，回歸方程:Y=2 866.81X-60.451 6，R2=0.999 7。精密度試驗(yàn)RSD 為0.73%，穩(wěn)定性試驗(yàn)RSD為2.4%，重復(fù)性試驗(yàn)RSD 為1.6%，加標(biāo)回收率為97.0%，其RSD為1.73%。樣品中常春藤皂苷元含量為(11.556 75±0.039 221)mg/g，此方法操作準(zhǔn)確、可靠，可以作為常春藤皂苷元含量測定的方法。

(3)采用傅立葉紅外光譜對常春藤皂苷元主要官能團(tuán)分析，皂苷元特有的5個主要特征吸收峰3 442、2 943、1 693、1 461、1 043 cm-1都存在，且與常春藤皂苷元標(biāo)準(zhǔn)品的官能團(tuán)基本吻合。

(4)采用核磁共振對常春藤皂苷元結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，常春藤皂苷元的核磁共振數(shù)據(jù)與報(bào)道中的基本一致。