基于質(zhì)譜的呼氣分析在新型冠狀病毒肺炎診斷中的潛力和前景

劉宜平 郭雷 李恩有

哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第一臨床醫(yī)學(xué)院麻醉科150001

新型冠狀病毒肺炎 (COVID-19),是嚴(yán)重急性呼吸綜合征冠狀病毒2 (severe acute respiratory syndrome coronavirus 2,SARS-Co V-2)感染導(dǎo)致的肺炎,全球感染病例已超過640萬,死亡病例超過了38萬,在世界范圍內(nèi)帶來了巨大的社會和經(jīng)濟(jì)影響[1]。對于引起COVID-19的SARS-Co V-2檢測是COVID-19 診斷的重要標(biāo)準(zhǔn)。然而目前應(yīng)用的分子檢測方法對采樣技術(shù)要求很高,而且具有較高的假陰性率和假陽性率,這對COVID-19的診斷產(chǎn)生很大影響[2-3]。

日前英國諾桑布利亞大學(xué)官網(wǎng)公布,該學(xué)校的科研團(tuán)隊(duì)研發(fā)了一種呼吸檢測儀器,可以通過收集人們呼吸的氣體來診斷是否感染SARS-Co V-2。這種儀器不僅能用于COVID-19診斷,還可以用于診斷其他肺部疾病。與傳統(tǒng)的胸部CT 相比,呼吸診斷痛苦小,耗時(shí)短,易操作,這種儀器一旦成功投入使用,將大大革新全球COVID-19的診斷流程。雖然目前呼氣分析用于診斷COVID-19的技術(shù)尚未實(shí)現(xiàn),但是隨著高分辨率質(zhì)譜技術(shù)的不斷進(jìn)步,以及代謝組學(xué)方法用于診斷呼吸道疾病的大量研究[4-5],本文擬對基于質(zhì)譜的呼氣檢測技術(shù)用于呼吸道病毒的診斷作一綜述,以期為COVID-19的早期快速診斷提供一種新的研究思路。

1 呼氣分析的樣本類型

長期以來,人的呼吸及尿液和血液一直是評估人體健康和環(huán)境暴露的3種主要生物介質(zhì)。正如希波克拉底在公元前400年所描述的那樣,檢測人類呼吸中的異味是第一個(gè)分析健康的評估工具。盡管與現(xiàn)代生物流體分析相比,呼氣檢測不那么普遍,但由于其采樣是非侵入性的,采樣時(shí)間和樣本量不受限制,并且不需要臨床專業(yè)技術(shù)人員,呼氣檢測已成為一種有吸引力的診斷方法[6]。呼氣樣本的類型包括氣相呼氣、呼氣冷凝物 (exhaled breath condensate,EBC)和呼氣氣溶膠 (exhaled breath aerosol,EBA)。

1.1 氣相呼氣 傳統(tǒng)的呼氣檢測樣本大多數(shù)為氣相呼氣。人體吸入和暴露后,揮發(fā)性有機(jī)物 (volatile organic compounds,VOCs)會保留在人體的不同部位,具體取決于它們的氣體-血液-脂肪分配系數(shù)[7]。VOCs可以由吸入、口服或皮膚吸收 (例如汽油、食物、乳液)引起的外源性環(huán)境暴露或來自體內(nèi)的內(nèi)源性代謝產(chǎn)物 (例如微生物代謝、癌性腫瘤)產(chǎn)生[8]。肺泡氣僅由呼吸末的350 ml氣體組成,目前已經(jīng)有許多呼氣采樣技術(shù)可以僅收集肺泡氣[9]。

1.2 EBC 呼吸道的所有部位直至肺泡表面都被黏液層覆蓋,該黏液層可以被霧化并攜帶各種非揮發(fā)性成分[10],EBC是將多次呼吸通過冷管后回收冷凝物,它提供了以前未知的全新化合物[11]。通過EBC 的酸堿度 (p H 值)檢測已開發(fā)了 “在家”收集和監(jiān)測的兒童支氣管哮喘狀態(tài)的方法[12]。EBC分析的另一個(gè)應(yīng)用是對機(jī)械通氣患者收集冷凝物,這對于不能多次采集血液或尿液的早產(chǎn)兒[13]以及評估ARDS的機(jī)械通氣患者[14]都非常重要。

1.3 EBA EBA 代表總EBC 的一部分,并針對較大的分子,例如脂肪酸和細(xì)胞因子,以及蛋白質(zhì),病毒和細(xì)菌[15-17]。該技術(shù)具有采樣方法簡單的優(yōu)勢,受試者只需在給定的時(shí)間 (如10 min)內(nèi)佩戴標(biāo)準(zhǔn)的醫(yī)用口罩,即可將其運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室并進(jìn)行各種目標(biāo)化合物分析。除生物介質(zhì)外,還可以使用EBA 檢測顆粒物和納米顆粒,例如人們發(fā)現(xiàn)職業(yè)接觸二氧化鈦和氧化鐵納米顆粒的員工在EBC 樣品中顯示出明顯增加的鈦和氧化應(yīng)激標(biāo)志物[18]。EBA 還可用于識別疾病的特征性指紋譜,細(xì)菌、病毒和健康個(gè)體的指紋譜都可以通過分析EBA 來區(qū)分[19-20]。

2 常用的呼氣檢測質(zhì)譜技術(shù)

質(zhì)譜 (mass spectrometry,MS)是一種測量離子質(zhì)荷比的分析技術(shù),適用于純樣品以及復(fù)雜的混合物分析。在經(jīng)典的MS過程中,通過用電子轟擊將固態(tài)、液態(tài)或氣態(tài)樣品電離,導(dǎo)致樣品中的某些分子破裂成帶電的片段,或者只是變得帶電而沒有碎裂。然后根據(jù)這些離子的質(zhì)荷比將它們分離。常用的呼吸檢測的質(zhì)譜技術(shù)包括氣相色譜-質(zhì)譜 (gas chromatography-mass spectrometry,GC-MS)、液相色譜-質(zhì)譜 (liquid chromatography-mass spectrometry,LC-MS)、直接質(zhì)譜及其他軟電離質(zhì)譜技術(shù)。

2.1 GC-MS技術(shù) GC-MS是目前大部分呼氣檢測應(yīng)用的技術(shù),這種方法的優(yōu)勢在于可以同時(shí)分析多種呼出氣VOCs的準(zhǔn)確水平及在不同人群中的差異,快速確定疾病特異性的VOCs種類。氣相色譜飛行時(shí)間質(zhì)譜儀 (time of flight,TOF)較傳統(tǒng)的GC-MS更快,以其高分辨率和準(zhǔn)確度獲得數(shù)據(jù)[21]。Peralbo-Molina等[22]最近開發(fā)了一種利用液-液萃取和氣相色譜飛行時(shí)間質(zhì)譜儀 (gas chromatography-time of flight-mass spectrometry,GCTOF-MS)進(jìn)行代謝組學(xué)分析EBC 樣品的方法,并證實(shí)了EBC樣本作為區(qū)分肺癌和危險(xiǎn)因素組生物介質(zhì)的潛力。Schnabel等[23]比較了疑似呼吸機(jī)相關(guān)性肺炎患者的呼吸樣品,鑒定出區(qū)分患病組和非患病組的12 種VOCs。GCTOF-MS也已用于分析嗜酸性粒細(xì)胞和嗜中性粒細(xì)胞的細(xì)胞頂空,以鑒定與炎癥和氧化應(yīng)激相關(guān)的VOCs[24]。二維氣相色譜結(jié)合飛行時(shí)間質(zhì)譜是一種更有效的高分辨率多維技術(shù),它的應(yīng)用增加了呼吸樣品中可檢測到的VOCs數(shù)量。多維氣相色譜與一維氣相色譜相比具有更大優(yōu)勢,因?yàn)樗褂?個(gè)毛細(xì)管氣相色譜色譜柱分離共洗脫的VOCs,并將代謝組學(xué)中VOCs的覆蓋范圍增加了一個(gè)數(shù)量級[25]。在Philips等[26]的一項(xiàng)研究中,從健康志愿者的肺泡呼吸樣品中鑒定出2 000種VOCs,其中一些以前從未在呼吸中檢測到。

2.2 LC-MS技術(shù) 除了GC-MS外,LC-MS經(jīng)常被用于分析呼吸和EBC樣品,盡管可以使用GC-MS儀器相對容易地分析呼吸樣本,但EBC 和EBA 樣品基質(zhì)中組分的濃度較低,需要大量的制備程序,這使這些樣品比呼氣更難操作[27]。EBC和EBA 樣品均可以液體形式獲得,因此適用于LC-MS分析。樣品可以直接注入儀器中,也可以提取以進(jìn)一步分析。由于保留時(shí)間漂移較大,LC/MS數(shù)據(jù)的可變性較大[28],具有高分辨率的MS,例如四極桿飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜或Orbitrap質(zhì)譜,增加了呼氣樣品非靶向分析的可靠性。已有多項(xiàng)研究使用高分辨率LC-MS分析EBC 樣品的蛋白質(zhì)譜[29-30]。Muccilli等[29]從9名健康受試者中采集EBC樣品,使用Orbitrap-Elite質(zhì)譜儀對消化的蛋白質(zhì)進(jìn)行LC-MS/MS分析并鑒定出163種基因產(chǎn)物。Fumagalli等[30]使用線性離子阱靜電軌道阱組合式高分辨質(zhì)譜對來自非吸煙者、健康吸煙者以及患有COPD 的EBC樣本進(jìn)行了區(qū)分。

2.3 直接質(zhì)譜技術(shù) 質(zhì)子轉(zhuǎn)移反應(yīng)質(zhì)譜法直接質(zhì)譜技術(shù)是一種快速直接的質(zhì)譜方法,能夠以呼吸到呼吸的分辨率進(jìn)行實(shí)時(shí)分析。在直接質(zhì)譜技術(shù)中,萬億分之一水平的檢測限已經(jīng)實(shí)現(xiàn)。某些直接質(zhì)譜技術(shù)儀器包含四極質(zhì)量分析儀,其已用于評估呼氣VOCs,以及來自糖代謝的碳酸醇和短鏈脂肪酸的VOCs[31]。選擇離子流動管質(zhì)譜使用正離子(H3O+、NO+和 O2+)或 負(fù) 離 子 (O-、OH-、O2-、NO2-和NO3-)試劑的化學(xué)電離提供呼吸中VOC的實(shí)時(shí)測量,檢測限達(dá)到萬億分之一,使其成為快速分析的靈敏技術(shù)[32]。離子遷移譜儀器結(jié)構(gòu)緊湊,對于檢測十億分之一濃度以下的醛和酮有較大優(yōu)勢[33]。由于其體積小和便攜性的優(yōu)勢,使其更適合于現(xiàn)場檢測[34]。離子遷移譜還可以用于監(jiān)測麻醉過程中使用丙泊酚鎮(zhèn)靜患者的呼出氣痕量丙泊酚濃度[35]。

2.4 其他軟電離質(zhì)譜技術(shù) 自20世紀(jì)80年代,隨著電噴霧和基質(zhì)輔助激光解析等 “軟電離”技術(shù)的出現(xiàn),質(zhì)譜開始用于分析高極性、難揮發(fā)和熱不穩(wěn)定樣品,尤其適用于蛋白質(zhì)序列分析和翻譯后修飾分析。電噴霧電離技術(shù)由Masamichi Yamashita和John Fenn 于1984 年首次報(bào)道,這種用于生物大分子分析的技術(shù)獲得了2002年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)[36]。它解決了大分子在電離時(shí)易碎的問題,因此適合于大分子離子檢測,并且溶液液相信息可以保留在氣相中。由于其MS中僅能獲得非常少的結(jié)構(gòu)信息,因此常將電噴霧與串聯(lián)質(zhì)譜耦合以克服此缺點(diǎn)?；|(zhì)輔助激光解吸/電離(matrix-assisted laser desorption/ionization,MALDI)與電噴霧電離的特征相似,它的原理是使用激光能量吸收基質(zhì),從具有最小碎片的大分子中產(chǎn)生離子。MALDI最廣泛使用的質(zhì)譜儀類型是TOF,這是因?yàn)樗鼨z測的質(zhì)量范圍很大,同時(shí)TOF檢測程序也非常適合MALDI電離過程。

3 質(zhì)譜技術(shù)用于呼吸道病毒的診斷

由于病毒能夠影響宿主的代謝途徑,例如糖酵解、磷酸戊糖途徑、谷氨酰胺分解及脂肪酸合成,因此病毒感染后的VOCs可能發(fā)生變化[37]。2010年P(guān)hillips等[38]首次報(bào)道了減毒活流感疫苗接種對呼吸中氧化應(yīng)激產(chǎn)物的影響,發(fā)現(xiàn)健康人的減毒活流感疫苗接種引起了氧化應(yīng)激的呼吸生物標(biāo)記物的持續(xù)增加。2014 年Aksenov等[39]應(yīng)用GCMS研究了人鼻病毒感染的體外氣道細(xì)胞的VOCs,隨后Abd等[40]研究了從5種病毒 [甲型流感病毒 (Influenza A virus,IAV)甲型流感、乙型流感病毒、腺病毒、呼吸道合胞病毒和副流感病毒]以及3種細(xì)菌 (卡他莫拉菌、流感嗜血桿菌和肺炎軍團(tuán)菌)的培養(yǎng)物和菌落VOCs中,鑒定出與感染細(xì)菌有關(guān)的2種重要的VOCs,即庚烷和甲基環(huán)己烷。2018年P(guān)urcaro等[41]應(yīng)用頂空固相微萃取——全二維氣相色譜飛行時(shí)間質(zhì)譜法得到了病毒感染細(xì)胞的指紋圖譜,并評估了2種重要的呼吸道病毒,即呼吸道合胞病毒和IAV,結(jié)果在呼吸道合胞病毒和感染的細(xì)胞培養(yǎng)物中均觀察到碳?xì)浠衔镞^量。這一發(fā)現(xiàn)與增加的氧化應(yīng)激結(jié)果相一致,因此斷定氧化應(yīng)激與呼吸道病毒感染有關(guān)。Traxler等[42]應(yīng)用GC-MS分析了感染IAV 的豬的呼出氣VOCs,發(fā)現(xiàn)6種VOCs可能與疾病進(jìn)展有關(guān),包括乙醛、丙醛、乙酸正丙酯、甲基丙烯酸甲酯、苯乙烯和1，1-二丙氧基丙烷。隨后其研究團(tuán)隊(duì)在2019 年分析了IAV 和化膿性鏈球菌共感染的細(xì)胞的VOCs[43],認(rèn)為乙醛和丙醛的排放增加反映出細(xì)菌感染,乙酸正丙酯與病毒感染有關(guān)。Schultz等[44]應(yīng)用LC-MS/MS檢測IAV 感染豬模型的免疫相關(guān)脂質(zhì)組 (類花生酸)學(xué)影響,結(jié)果發(fā)現(xiàn)IAV 感染會導(dǎo)致所分析的羥基二十碳三烯酸、羥基二十二碳六烯酸和環(huán)氧二十碳三烯酸的水平發(fā)生集體變化。

近日來幾項(xiàng)研究先后報(bào)道了LC-MS用于檢測SARSCo V-2 病毒相關(guān)蛋白。Gouveia 等[45]應(yīng)用串聯(lián)質(zhì)譜法在SARS-Co V-2病毒的體外研究中發(fā)現(xiàn),受感染Vero細(xì)胞存在6個(gè)病毒蛋白的101 個(gè)肽段,并提出14 種肽的候選清單,可用于靶向質(zhì)譜檢測的開發(fā)以及SARS-Co V-2的診斷。Gordon等[46]在人體細(xì)胞中克隆、標(biāo)記、表達(dá)了26 種SARS-Co V-2蛋白,并應(yīng)用組合型四極桿Orbitrap質(zhì)譜鑒定了與每種蛋白物理相關(guān)的人類蛋白,結(jié)果他們確定了66種可藥物化的人類蛋白,并篩選了兩套具有抗病毒活性的藥物,這可能會研發(fā)出治療COVID-19 的有效方案。Shajahan等[47]應(yīng)用高分辨率質(zhì)譜對人細(xì)胞表達(dá)刺突蛋白亞基S1和S2的糖基化定位,表征了棘突蛋白上的定量N-糖基化譜并觀察到S1受體結(jié)合域上意想不到的O-糖基化修飾,這可能推動疫苗的研發(fā)。

電噴霧質(zhì)譜技術(shù)也可以有效地用于檢測病毒病原體[48-50]。Sampath等[48]應(yīng)用PCR 結(jié)合電噴霧質(zhì)譜技術(shù)對9種不同冠狀病毒,包括SARS-Co V 進(jìn)行檢測。他們提出該方法可以在所有3 種人類病毒的混合物中識別和區(qū)分SARS和其他已知冠狀病毒,包括人類Co V 229E和OC43。Cordey等[49]開發(fā)了RT-PCR/電噴霧電離質(zhì)譜技術(shù)并對流感病毒進(jìn)行檢測和分型,該方法針對201個(gè)IAV 或乙型流感病毒感染的鼻咽拭子的分型進(jìn)行了評估,結(jié)果顯示RTPCR/電噴霧電離質(zhì)譜技術(shù)對所有樣本檢測率分別為91.3%和95.3%,在所有不可分型的標(biāo)本中均顯示出低病毒載量。隨后Mengelle等[50]應(yīng)用此PLEX-IDTM系統(tǒng)對流感病毒及其亞型進(jìn)行了檢測,并與RespiFinder?試劑盒鑒定的流感病毒進(jìn)行比較,結(jié)果顯示PLEX-IDTM系統(tǒng)的敏感度、特異度、陽性和陰性預(yù)測值分別為87.4%、96.5%、92.2%和94.1%。使用AnyplexTMⅡRV16檢測試劑盒進(jìn)一步對13個(gè)結(jié)果不一致的樣品檢測發(fā)現(xiàn),7個(gè)與RespiFinder?一致,而6個(gè)與PLEX-IDTM一致。

基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜儀 (matrixassisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry,MALDI-TOF-MS)已經(jīng)成為微生物鑒定和診斷的潛在工具。許多研究人員已經(jīng)證明了MALDI-TOFMS用于診斷流感病毒、腸病毒、人乳頭瘤病毒、皰疹病毒、肝炎病毒等臨床傳染性病毒樣本的實(shí)用性[51-53]。在大多數(shù)研究中,采用了通過PCR 擴(kuò)增病毒遺傳物質(zhì),并通過MALDI分析/鑒定擴(kuò)增子的方法。Sj?holm 等[51]報(bào)道了一種基于MALDI-TOF-MS的高效篩選方法,用于多重檢測存在于不同檔案生物學(xué)樣品中的所有人類皰疹病毒,他們證實(shí)MALDI-TOF-MS方法對病毒的敏感性和檢出限很高,可與寡核苷酸微陣列和多重PCR 等參考方法相媲美。Yi等[52]報(bào)道了使用基于PCR 的MS方法檢測高危型人乳頭瘤病毒,他們表明該方法的高檢出率和低成本效益使其適合于常規(guī)臨床環(huán)境中的診斷和流行病學(xué)研究。Piao等[53]將多重PCR 與MALDI-TOF-MS聯(lián)合使用,可同時(shí)檢測出8種與人類腸道感染相關(guān)的病毒。Calderaro等[54]證實(shí)MALDITOF-MS是一種有效,快速且廉價(jià)的工具,可從不同的臨床樣品中鑒定出多種脊髓灰質(zhì)炎病毒血清型。他們進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),通過MALDI-TOF-MS可以檢測到特定的病毒生物標(biāo)志物,這些標(biāo)志物有助于將病毒感染的細(xì)胞與健康細(xì)胞區(qū)分開[55]。多篇文獻(xiàn)報(bào)道了MALDI-TOF-MS可用于甲型流感、狂犬病毒以及克里米亞-剛果出血熱病毒的診斷[56-58]。北京協(xié)和醫(yī)院金奇課題組應(yīng)用多重PCR 結(jié)合MALDI-TOF-MS技術(shù)在241 個(gè)樣本中快速檢測與手足口病相關(guān)的病毒[59],隨后又將其用于21 種呼吸道病毒的診斷[60]。該課題組在2017年應(yīng)用其建立了通用冠狀病毒篩選方法[61]。由于分子檢測方法往往針對一個(gè)基因,而冠狀病毒的基因型會發(fā)生變異,導(dǎo)致檢測的假陰性率,該課題組建立的冠狀病毒篩選方法能夠靶向2個(gè)或4個(gè)基因,從而提高冠狀病毒的診斷率。不足是該方法基于已知的冠狀病毒序列,僅使用該方法很難檢測到未知的人冠狀病毒。

4 前景展望

呼氣分析是一種無創(chuàng)的、簡便的反映機(jī)體健康或疾病的分析方法,呼氣中的蛋白質(zhì)和VOCs等生物標(biāo)志物具有診斷病毒感染的潛力。近日來國際上已開展多項(xiàng)呼氣分析用于COVID-19診斷的注冊研究,例如美國梅奧醫(yī)學(xué)中心(NCT04341012)及英國劍橋大學(xué) (IRAS ID：237557)等,雖然尚未開發(fā)出快速診斷COVID-19的儀器,然而MS技術(shù)在診斷其他類型流感病毒以及2003 年的SARS-COV方面都證明了其較高的敏感度,這為COVID-19病毒檢測方法的研發(fā)提供了重要的研究基礎(chǔ)和理論依據(jù)。隨著高分辨質(zhì)譜技術(shù)的不斷發(fā)展以及科研人員的研究,呼出氣VOCs檢測有望成為診斷COVID-19的快速方法,然而在此之前還需要大量的基礎(chǔ)研究。未來人們可以通過將體外研究病毒本身特征性VOCs與體內(nèi)研究病毒感染后機(jī)體氧化應(yīng)激等產(chǎn)生的VOCs相結(jié)合的方法,以鑒定SARS-Co V-2感染相關(guān)的呼出氣VOCs并定性定量,進(jìn)而實(shí)現(xiàn)非侵入性快速檢測SARS-Co V-2,尤其適用于機(jī)場等現(xiàn)場檢測,這對于COVID-19的早期快速診斷具有十分重大的意義。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突