劉晨睿，吳勇軍，李智，張鈺華，王丹慧，吳娟

1.吉首大學(xué)醫(yī)學(xué)院，湖南吉首416000；2.南華大學(xué)附屬湘潭醫(yī)院(湘潭市第一人民醫(yī)院)病理科，湖南湘潭411100；3.中南大學(xué)湘雅醫(yī)院臨床藥理研究所，湖南長(zhǎng)沙410000；4.南華大學(xué)附屬湘潭醫(yī)院(湘潭市第一人民醫(yī)院)腫瘤內(nèi)科，湖南湘潭411100

腫瘤是摧毀人類健康的“殺手”，我國(guó)每年因?yàn)閻盒阅[瘤而死亡、殘疾的人數(shù)約為130萬(wàn)人，治療惡性腫瘤的費(fèi)用也是家庭難以承受之重。目前針對(duì)惡性腫瘤的特效藥尚未問(wèn)世，及早發(fā)現(xiàn)并預(yù)防惡性腫瘤對(duì)于提升我國(guó)公民健康水平和降低醫(yī)療負(fù)擔(dān)具有重要意義。腫瘤的發(fā)生是一個(gè)漸進(jìn)式的過(guò)程，多種基因和信號(hào)通路參與其中。線粒體通過(guò)持續(xù)不斷地“融合分裂再融合再分裂”循環(huán)，確保細(xì)胞完成正常的分裂過(guò)程。腫瘤細(xì)胞的產(chǎn)生源于細(xì)胞分裂活動(dòng)強(qiáng)于細(xì)胞融合活動(dòng)，使得細(xì)胞內(nèi)線粒體處于片段化狀態(tài)。

深入研究線粒體參與腫瘤發(fā)生發(fā)展的全過(guò)程，有助于為針對(duì)線粒體的靶向治療提供理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)支撐。線粒體分裂異常導(dǎo)致腫瘤發(fā)生與MAPK信號(hào)通路激活有關(guān)。該文通過(guò)RNA對(duì)DAPK2基因進(jìn)行靶向沉默，探討DAPK2基因表達(dá)與腫瘤發(fā)生的相關(guān)性以及DAPK2基因表達(dá)與膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖、侵襲的相關(guān)性。

1 DAPK2結(jié)構(gòu)與功能

DAPK2(死亡相關(guān)蛋白激酶2)基因位于人體染色體12p11.21區(qū)，是典型的蘇氨酸蛋白激酶，由鈣調(diào)蛋白(CAM)進(jìn)行調(diào)節(jié)。DAPK2基因編碼蛋白分子質(zhì)量為15 Kda，能夠轉(zhuǎn)錄成熟的mRNA全長(zhǎng)為2.4 Kmb。DAPK2隸屬于死亡相關(guān)蛋白激酶家族[1](DAPK、DRP-1/DAPK2、Dlk/ZIPK、DRAK1和DRAK2)，是典型的可溶性胞漿蛋白、核蛋白。DAPK2基因是Dynein超家族一員，在線粒體分裂體系中起到重要作用。DAPK2基因具有GTPase結(jié)構(gòu)域[2](Dy namin_domain)、中間區(qū)(middle_domain)和效應(yīng)結(jié)構(gòu)域(Effector_domain)。DAKP2基因在維持介導(dǎo)線粒體融合/分裂動(dòng)態(tài)平衡方面起到關(guān)鍵作用，是核心因素之一。

國(guó)外學(xué)者[3-5]經(jīng)過(guò)研究發(fā)現(xiàn)，DAPK2基因能夠介導(dǎo)胚胎發(fā)育所不可或缺的線粒體分裂活動(dòng)。Fis1(線粒體分裂蛋白)是DAPK2的線粒體受體，其胞漿內(nèi)含有“N端結(jié)構(gòu)域”，其線粒體外膜上含有“C-端跨膜結(jié)構(gòu)域”并形成穩(wěn)定的超螺旋結(jié)構(gòu)，F(xiàn)is1通過(guò)超螺旋結(jié)構(gòu)與其他蛋白質(zhì)互動(dòng)。DAPK2基因在自然狀態(tài)下主要駐留在胞漿之內(nèi)，當(dāng)駐留在線粒體外膜的Fis1蛋白感應(yīng)到線粒體發(fā)生分裂后：①Fis1自動(dòng)將胞漿內(nèi)含有的DAPK2基因進(jìn)行收集并放置到線粒體外膜，經(jīng)過(guò)生化反應(yīng)后形成寡聚體；②這些寡聚體大部分聚集在線粒體潛在分裂位點(diǎn)，并形成指環(huán)狀結(jié)構(gòu)。由于水解GTP擠壓線粒體膜，這些指環(huán)狀結(jié)構(gòu)的寡聚體集合最終發(fā)生斷裂并產(chǎn)生2個(gè)相互獨(dú)立的線粒體；③DAPK2基因最終重新駐留在胞漿之內(nèi)。步驟①、②、③循環(huán)反復(fù)，形成一個(gè)持續(xù)的過(guò)程。

DAPK2基因的活性組件位于中間區(qū)(middle_domain)，其它與線粒體分裂相關(guān)的蛋白體對(duì)于活性組件的定位具有重要作用。研究人員可以通過(guò)抑制內(nèi)源性DAPK2基因表達(dá)可以抑制線粒體分裂并提升線粒體集合網(wǎng)絡(luò)化程度；通過(guò)S-亞硝基化、泛素化和磷酸化等方式調(diào)整DAPK2基因的活性水平。研究人員通過(guò)大量實(shí)驗(yàn)確認(rèn)DAPK2基因與腫瘤發(fā)生存在強(qiáng)關(guān)聯(lián)，DAPK2在常見(jiàn)的腫瘤組織或者腫瘤細(xì)胞(如結(jié)腸癌、甲狀腺嗜酸性細(xì)胞癌、胰腺癌和膠質(zhì)瘤等)中普遍存在過(guò)表達(dá)現(xiàn)象，研究人員可以使用基因沉默技術(shù)降低DAPK2基因表達(dá)水平，削弱惡性細(xì)胞的侵襲能力和增值能力，誘導(dǎo)惡性細(xì)胞逐步調(diào)亡[6-10]。

2 DAPK2抑癌基因與機(jī)體免疫和腫瘤發(fā)生的相關(guān)性

2.1 腫瘤成因概述

腫瘤是目前危害人類健康最嚴(yán)重的三大疾病之一。每年全球約800萬(wàn)人死于惡性腫瘤，《中國(guó)腫瘤登記年報(bào)》顯示我國(guó)每年因各類腫瘤死亡病例約達(dá)270萬(wàn)，且其發(fā)病率有逐年增高的趨勢(shì)。腫瘤發(fā)生是一個(gè)非常復(fù)雜的生物過(guò)程，涉及到多個(gè)生物信號(hào)通路、多個(gè)步驟和多種類基因的共同參與。腫瘤活性氧自由基(ROS)生成、腫瘤能量代謝故障、抵抗細(xì)胞凋零和組織浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移等都需要線粒體的參與，腫瘤治療可以使用以線粒體為靶向治療目標(biāo)的全新策略[11]。線粒體是典型的細(xì)胞器，處于復(fù)雜的動(dòng)態(tài)變化之中。線粒體不斷地啟動(dòng)融合/分裂的循環(huán)，以最大限度地適應(yīng)并滿足細(xì)胞內(nèi)環(huán)境變更和細(xì)胞持續(xù)的能量需求，研究這種動(dòng)態(tài)循環(huán)過(guò)程的學(xué)科叫做線粒體動(dòng)力學(xué)(mitochondrial_dynamics)。在穩(wěn)定環(huán)境下線粒體的融合/分裂循環(huán)處于動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)，當(dāng)融合/分裂循環(huán)因?yàn)橥饬υ虮淮蚱浦螅€粒體形狀會(huì)因?yàn)檠h(huán)失衡發(fā)生形狀上的變化，形態(tài)不同的線粒體在功能上也會(huì)呈現(xiàn)區(qū)別。國(guó)內(nèi)外大量研究證實(shí)[12]，線粒體分裂/融合循環(huán)被打破可以導(dǎo)致腫瘤、肥胖、Parkinson病癥和阿爾茨海默病癥(Alzheimer_disease)等多種疾病的發(fā)生。

圖1 DAPK2基因甲基化率和常見(jiàn)腫瘤Figure 1 DAPK2 gene methylation rate and common tumors

2.2 DAPK2基因表達(dá)與腫瘤發(fā)生的相關(guān)性

腫瘤細(xì)胞的線粒體分裂/融合循環(huán)處于失衡狀態(tài)，一般體現(xiàn)為“強(qiáng)分裂、弱融合”的特征（分裂活動(dòng)大于融合活動(dòng)），失衡循環(huán)導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)線粒體呈現(xiàn)片段化狀態(tài)。抑制腫瘤細(xì)胞侵襲和增值的關(guān)鍵在于糾正線粒體分離/融合失衡狀態(tài)，讓線粒體分裂受到抑制。國(guó)內(nèi)外研究人員[13-15]通過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，MAPK信號(hào)通路的激活可能會(huì)導(dǎo)致線粒體分裂異常使得正常細(xì)胞異化為腫瘤細(xì)胞。

線粒體融合/分裂循環(huán)動(dòng)態(tài)平衡的關(guān)鍵因子是DAPK2基因，DAPK2基因的異常表達(dá)和腫瘤發(fā)生具有強(qiáng)關(guān)聯(lián)。我們可以采用慢病毒介導(dǎo)的shRNA干擾技術(shù)使得DAPK2基因表達(dá)處于沉默狀態(tài)，通過(guò)對(duì)比實(shí)驗(yàn)去研究[shRNA-DAPK2]對(duì)腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)行為有怎樣的影響。整個(gè)實(shí)驗(yàn)步驟可以分為如下幾步：①RNA干擾實(shí)驗(yàn)材料準(zhǔn)備。使用qPCR監(jiān)測(cè)MKN-45/BCG-823/AGS/MKN-28/SGC-7901/CES-1細(xì)胞株中[DAPK2-mRNA]的表達(dá)水平，選擇[DAPK2-mRNA]表達(dá)水平較高的細(xì)胞株MKN-45/BGC-823用于RNA干擾實(shí)驗(yàn)。②干擾序列篩選。將構(gòu)建好的[shRNA-DRP1]慢病毒載體注入到MKN-45細(xì)胞株和BGC-823細(xì)胞株，在qPCR內(nèi)源選取有效靶點(diǎn)，從干擾序列中篩選效率最高的KD3序列。③比對(duì)實(shí)驗(yàn)。采用多種實(shí)驗(yàn)手段(劃痕愈合實(shí)驗(yàn)、克隆形成實(shí)驗(yàn)、MTT實(shí)驗(yàn)、流式細(xì)胞術(shù)和Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)等)，研究在腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲、遷移、凋亡等生物學(xué)行為中DAPK2基因的作用。

通過(guò)比對(duì)實(shí)驗(yàn)可以證明，DAPK2基因在組織或細(xì)胞中的陽(yáng)性表達(dá)和腫瘤發(fā)生存在有效關(guān)聯(lián)，抑制腫瘤細(xì)胞侵襲和增值可以從抑制DAPK2基因表達(dá)方面入手，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞逐步凋亡。BCG-823/MKN-45細(xì)胞株在感染[shRNA-DAPK2]慢病毒載體之后，DAPK2基因表達(dá)被沉默，細(xì)胞侵襲、細(xì)胞遷移和細(xì)胞增殖等生物學(xué)行為均受到抑制，G2/M期細(xì)胞凋亡率和細(xì)胞數(shù)增高。在移植瘤模型實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)DAPK2基因被沉默之后移植瘤重量減輕、體積縮小。

細(xì)胞在相關(guān)指令基因的精準(zhǔn)控制下，可以發(fā)生程序性、自主行的死亡行為，這種受控的生物學(xué)行為稱作細(xì)胞凋亡(apoptosis)。腫瘤細(xì)胞形成的主要原因就是正常的細(xì)胞凋亡行為受到阻礙。治療腫瘤的常見(jiàn)策略就是通過(guò)各種技術(shù)手段誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞主動(dòng)凋亡。Cleaved_caspase_3是凋亡信號(hào)通路的重要執(zhí)行者、核心凋亡效應(yīng)分子和細(xì)胞凋亡早期標(biāo)志，Cleaved_caspase_3是以酶原形式存在的Caspases-3的激活形式。通過(guò)Western_blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，Cleaved_caspace_3表達(dá)明顯升高的細(xì)胞其凋亡率隨之明顯升高，從側(cè)面正面DAPK2基因被沉默之后，細(xì)胞凋亡率和Caspases_3存在強(qiáng)關(guān)聯(lián)。

國(guó)內(nèi)外研究者通過(guò)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)和體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞的遷移、侵襲、自噬和凋亡等生物學(xué)行為和DAPK2基因存在強(qiáng)關(guān)聯(lián)。通過(guò)回歸臨床樣本檢測(cè)挖掘臨床病例指標(biāo)、預(yù)后與DAPK2基因表達(dá)的關(guān)系，得到如下結(jié)果:①DAPK2基因在腫瘤組織中過(guò)表達(dá)，隨著TNM分期基站和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，DAPK2基因表達(dá)陽(yáng)性比率也隨之升高；②患者生存幾率和DAPK2基因陽(yáng)性表達(dá)存在強(qiáng)的負(fù)相關(guān)聯(lián)系；③通過(guò)qPCR監(jiān)測(cè)發(fā)現(xiàn)非腫瘤區(qū)域組織的[DAPK2-mRNA]表達(dá)水平遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于腫瘤組織[DAPK2-mRNA]表達(dá)水平。

在真核細(xì)胞中存在自噬(autophagy)現(xiàn)象，該現(xiàn)象屬于一種保守的細(xì)胞生物學(xué)行為。自噬相關(guān)基因(Atg)通過(guò)生物指令控制溶酶體降解活動(dòng)清除受損細(xì)胞器和大部分細(xì)胞內(nèi)聚物，降低細(xì)胞應(yīng)急壓力的同時(shí)，維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境平衡。腫瘤細(xì)胞通過(guò)激活自噬行為實(shí)現(xiàn)“廢物再循環(huán)利用”，為自身生存提供一部分必須的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。DAPK2基因參與線粒體分裂行為的調(diào)節(jié)，DAPK2表達(dá)被抑制后，線粒體自噬也隨之受到抑制。

2.3 DAPK2基因與膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖、侵襲的相關(guān)性

膠質(zhì)瘤細(xì)胞在不受控制的條件下具有強(qiáng)大的侵襲生長(zhǎng)能力。生物活細(xì)胞內(nèi)循環(huán)重塑的動(dòng)態(tài)平衡是由肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架參與維持的，動(dòng)態(tài)平衡的基礎(chǔ)是細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)控制平衡和肌動(dòng)蛋白絲可塑性平衡。腫瘤細(xì)胞維持強(qiáng)大的侵襲生長(zhǎng)能力的“密碼”就是細(xì)胞膜褶皺和細(xì)胞偽足，它們均依托肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架而生長(zhǎng)。微絲中F-action以聚合態(tài)形式呈現(xiàn)，G-action以游離態(tài)形式呈現(xiàn)，它們共同組成細(xì)胞肌動(dòng)蛋白。細(xì)胞肌動(dòng)蛋白除了維持細(xì)胞基礎(chǔ)形態(tài)這一核心功能之外，在細(xì)胞凋亡、細(xì)胞遷移、細(xì)胞黏附和細(xì)胞應(yīng)力纖維生成等生理過(guò)程中也發(fā)揮關(guān)鍵作用。

國(guó)內(nèi)學(xué)者[16]通過(guò)Transwell侵襲性實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，將膠質(zhì)瘤細(xì)胞內(nèi)DAPK2基因做沉默處理之后，F(xiàn)-action細(xì)胞褶皺和細(xì)胞偽足數(shù)量明顯減少,免疫熒光范圍縮小且著色強(qiáng)度降低，細(xì)胞整體侵襲能力明顯削弱。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，siDRP1組細(xì)胞穿過(guò)基質(zhì)膠細(xì)胞數(shù)為（88±1.2）個(gè)，對(duì)照組的穿過(guò)細(xì)胞數(shù)為（290±2.2）個(gè)(P<0.05)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明DAPK2基因能夠提升多種腫瘤細(xì)胞(如肺癌細(xì)胞、卵巢癌細(xì)胞、甲狀腺腫瘤細(xì)胞、大腸癌細(xì)胞和食管鱗狀癌細(xì)胞等)的侵襲能力。

肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架重塑的關(guān)鍵因子是RHOA/ROCK通路調(diào)節(jié)。ROCK在細(xì)胞凋亡、氧自由基產(chǎn)生和盈利纖維形成(由RHOA參與介導(dǎo))等生物學(xué)行為中均發(fā)揮重要作用，其中ROCK1在細(xì)胞骨架組裝過(guò)程中發(fā)揮重要作用。國(guó)內(nèi)學(xué)者通過(guò)免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)lag條帶無(wú)法在單獨(dú)轉(zhuǎn)染HA-DAPK2或Flag-RHOA質(zhì)粒的細(xì)胞樣本中被檢測(cè)到；Flag條帶能夠在共轉(zhuǎn)染HA-DAPK2或Flag-RHOA質(zhì)粒的細(xì)胞樣本中被檢測(cè)到，這說(shuō)明DAPK2基因和RHOA/ROCK通路之間可能存在交互作用，但是這種交互作用的詳細(xì)機(jī)理還沒(méi)有完全揭開。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在使用siRNA迫使DAPK2基因表達(dá)沉默之后，ROCK1蛋白和RHOA蛋白的表達(dá)水平明顯下降，膠質(zhì)瘤細(xì)胞表面褶皺和細(xì)胞偽足的數(shù)量也隨之下降，腫瘤細(xì)胞增殖受到明顯抑制。DAPK2基因能夠提升RHOA/ROCK2通路活性水平，促進(jìn)肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架重塑并提升叫膠質(zhì)瘤細(xì)胞侵襲能力。

3 總結(jié)與展望

DAPK2基因表達(dá)水平與腫瘤發(fā)生存在強(qiáng)關(guān)聯(lián)，通過(guò)技術(shù)手段將DAPK2基因沉默后能夠抑制腫瘤細(xì)胞的侵襲、增值和遷移，并誘發(fā)腫瘤細(xì)胞的自我凋亡，減輕腫瘤癥狀。隨著國(guó)內(nèi)外對(duì)DAPK2結(jié)構(gòu)功能分析的精度不斷提高，對(duì)于各類生物學(xué)行為機(jī)制研究的深入和完善，必將為腫瘤的靶向治療提供更多的選擇藥物和治療方式。