(中南林業(yè)科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,湖南長沙 410004)

我國是大米生產(chǎn)大國,但每年在儲(chǔ)藏過程中因霉變而造成的損失巨大[1]。研究表明,植物精油對植物病原菌具有很好的抑菌效果[2-3]。植物精油(Essential oils)是存在于植物組織中的一類次生代謝物質(zhì),主要化學(xué)成分有單萜、倍半萜烯、酯、醛、酮、醇等,常溫下多為油狀液體,易揮發(fā),具有強(qiáng)烈的香味和氣味[4]。

我國精油資源非常豐富,具有開發(fā)利用價(jià)值的植物種類多達(dá)60多個(gè)科,400多個(gè)種[5]。很多植物精油不僅抗菌活性強(qiáng),且在控制劑量的前提下安全性好[6-7]。有研究表明,復(fù)合植物精油防霉劑可有效防控玉米儲(chǔ)藏過程中霉菌和真菌毒素污染[8],曲春陽[9]的研究證實(shí),大蒜與肉桂復(fù)合精油對大米黃曲霉(Aspergillusflavus)具有很好的抑制效果。但植物精油對引起大米霉變常見的青霉和黑曲霉抑制效果如何,相關(guān)報(bào)道甚少。

本文以大米青霉和黑曲霉為供試菌,以抑菌圈直徑、最小抑菌濃度(Minimum inhibitory concentration,MIC)、最低生長下降濃度(Minimum growth decrease concentration,MGDC)和聯(lián)合抑菌效果為指標(biāo),對9種植物精油的抑菌效果進(jìn)行評價(jià),對抑菌效果較佳的精油進(jìn)行復(fù)配,據(jù)此篩選具協(xié)同抑菌效果的精油組合,以期為大米防霉復(fù)合植物精油保鮮劑的開發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

孜然精油、丁香精油、山蒼子精油、薄荷精油、花椒精油、香茅精油、迷迭香 分析純,江西雪松天然藥用油有限公司;藍(lán)桉葉精油 分析純,江西省廣博香料油有限公司;肉桂精油 分析純,武漢盛世精細(xì)化學(xué)品有限公司;青霉(Penicillium)、黑曲霉(Aspergillusniger) 購于廣東省微生物研究所。PDA培養(yǎng)基 實(shí)驗(yàn)室自制。

RGX-150人工氣候培養(yǎng)箱、MJX-250B霉菌培養(yǎng)箱、ZX-260立式壓力蒸汽滅菌器 北京中興偉業(yè)有限公司;SW-CJ超凈工作臺(tái) 上海新苗醫(yī)療機(jī)械制造有限公司;BX-53顯微鏡 日本奧林斯基。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 抑菌圈的測定 采用濾紙片法[10]。量取不同精油,加入丙酮稀釋,制得濃度為200 μL/mL的精油丙酮混合液供試驗(yàn)。無菌條件下,在無菌平皿中倒入培養(yǎng)基,待培養(yǎng)基凝固后,取0.1 mL濃度為106～107CFU/mL的霉菌懸液涂布于平皿培養(yǎng)基上,使之成為含菌平板。在無菌條件下,于每個(gè)培養(yǎng)皿中間貼3片圓濾紙片(d=6 mm),使之呈三角狀排列,每片濾紙上滴入 5 μL上述精油丙酮混合液,培養(yǎng)皿用保鮮膜密封。在37 ℃下分別培養(yǎng)36、48、72 h,觀察并測量抑菌圈直徑。并設(shè)空白對照,每個(gè)試驗(yàn)重復(fù)3次。

抑菌圈試驗(yàn)判定標(biāo)準(zhǔn)(培養(yǎng)至第36 h進(jìn)行評價(jià)):抑菌圈直徑>20 mm,高度敏感;10～20 mm,中度敏感;5～10 mm,低度敏感。

1.2.2 不同植物精油的協(xié)同抑菌效果 為探究優(yōu)選出的不同精油的協(xié)同抑菌效果,將不同精油原油分別等體積混合后,采用濾紙片法,精油不稀釋,每個(gè)培養(yǎng)皿在中央放置一片圓形濾紙(d=6 mm),滴加復(fù)合精油2.5 μL,其他操作同1.2.1,在37 ℃下分別培養(yǎng)36 h后,測定不同組合對青霉和黑曲霉的抑制圈直徑。每個(gè)試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.3 最低生長下降濃度(MGDC)試驗(yàn) 參考曲春陽[9]的方法。精油濃度起點(diǎn)低于MIC試驗(yàn),其他方法與MIC試驗(yàn)相同,以考察微生物出現(xiàn)明顯生長下降的最低濃度。每個(gè)試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.4 聯(lián)合抑菌效果評價(jià) 以分級抑菌濃度(Fractional inhibitory concentration,FIC)指數(shù)[9,12]作為聯(lián)合抗菌試驗(yàn)效果的判定依據(jù)。

FIC指數(shù)判定標(biāo)準(zhǔn):FIC指數(shù)≤0.5時(shí)為協(xié)同作用;0.52.0時(shí)為拮抗作用。

1.2.5 不同配比復(fù)合精油對青霉、黑曲霉的抑制作用的測定 對協(xié)同抑菌效果最好的精油組合分別按照1∶7、1∶3、1∶3、1∶1、3∶1、5∶1、7∶1的體積比兩兩復(fù)配,復(fù)合精油用0.22 μm的微孔過濾器過濾,加入Tween-80作為乳化劑,用丙酮溶液稀釋。在無菌操作下,吸取一定體積的精油稀釋液與無菌培養(yǎng)基均勻混合,置于培養(yǎng)皿中冷卻凝固,制成含相應(yīng)精油濃度的培養(yǎng)基。將0.1 mL濃度為106～107CFU/mL的菌懸液均勻涂抹于有培養(yǎng)基上,倒置培養(yǎng),于28 ℃培養(yǎng)96 h,以不生長菌的最低濃度為精油的最小抑菌濃度MIC[11]。每個(gè)試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)通過SPSS 12.0 軟件進(jìn)行單因素方差分析(one-way ANOVA)。P<0.05為差異顯著,P<0.01為差異極顯著。每次試驗(yàn)均設(shè)置三次重復(fù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 單一植物精油對大米青霉和黑曲霉的抑菌效果

9種植物精油對大米青霉和黑曲霉的抑菌效果見表1。由表1可見,丁香、肉桂精油對大米青霉的抑菌圈直徑在72 h內(nèi)都大于20 mm,而孜然精油在36 h內(nèi)大于20 mm,說明青霉對這3種精油高度敏感。山蒼子精油在48 h內(nèi)對青霉的抑菌圈直徑在10～20 mm之間,表明青霉對其中度敏感,而花椒、香茅和迷迭香精油的抑菌效果相對較差,72 h后濾紙片被霉菌完全覆蓋,這與李國林等[13]的研究結(jié)果有相似之處。

丁香、肉桂精油對黑曲霉的抑菌圈直徑在72 h內(nèi)均大于20 mm,表明黑曲霉對其高度敏感,具有很好的抑菌效果,而藍(lán)桉葉、山蒼子、薄荷精油的抑菌圈直徑48 h內(nèi)在10～20 mm之間,黑曲霉對其中度敏感,具有較好的抑菌效果,其他精油則抑菌效果較差。

由此可見,肉桂和丁香精油在9種植物精油中對青霉和黑曲霉的抑制效果最好,其次為山蒼子精油和藍(lán)桉葉精油,而孜然精油對青霉也有較好效果。

植物精油能抑制微生物的生長繁殖,原因在于其含有特定的功效成分。周明等[14]的研究表明,肉桂精油的主要成分為反式肉桂醛、肉桂醛和2-甲氧基肉桂醛,肉桂醛具有殺菌消毒防腐的功能,對真菌的效果特別顯著。肉桂醛通過破壞真菌的細(xì)胞壁,使外源活性成分可滲入真菌細(xì)胞內(nèi),破壞細(xì)胞器而起到殺滅真菌的作用。李寧等[15]和邱電等[16]的研究表明,丁香精油對食品中常見的霉菌均有不同程度的抑制作用,丁香精油的抗菌有效成分主要是丁香酚,丁香酚與大多數(shù)抗真菌藥物作用機(jī)理相似,主要通過破壞真菌的細(xì)胞膜達(dá)到抑制和殺滅真菌的作用。顧仁勇等[17]的研究發(fā)現(xiàn),山蒼子精油的主要成分有右旋萜二烯、桉葉油醇和芳樟醇,這些成分均有良好的抑菌效果。

表1 9種植物精油對大米青霉和黑曲霉的抑菌效果Table 1 Antimirobial effect of nine kinds of plant essential oils against Penicillium and Aspergillus niger

注:“-”表示無抑制作用。以上數(shù)據(jù)均為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(n=3);表2同。

表3 肉桂、山蒼子精油及復(fù)合精油對大米青霉、黑曲霉的MGDC、FICTable 3 The MGDC and FIC of mixture of essential oils from cinnamon and litsea cubeba against Penicillium and Aspergillus niger

注:FIC為3次重復(fù)的平均值,MGDC為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(n=3);表4同。

表4 肉桂、丁香精油及復(fù)合精油對青霉、黑曲霉的MGDC、FICTable 4 The MGDC and FIC of mixture of essential oils from cinnamon and clove against Penicillium and Aspergillus niger

2.2 不同植物精油對大米青霉和黑曲霉的協(xié)同抑菌效果

優(yōu)選復(fù)合植物精油對大米青霉和黑曲霉的抑菌圈直徑測定結(jié)果見表2。由表2可知,在單一精油中,無論是對青霉還是黑曲霉,肉桂精油的抑菌效果最好,其次為丁香,山蒼子精油最差,三者均存在顯著差異(P<0.05),其原因在于肉桂精油的主要抑菌成分肉桂醛具有很強(qiáng)的抑制霉菌作用,其不僅能抑制孢子的萌發(fā),還能抑制菌絲體生長和孢子的產(chǎn)生[18]。由于肉桂醛的揮發(fā)性比丁香酚低,因此抑菌效果比丁香酚更穩(wěn)定、持久[19]。將此三種植物精油全組合在一起及兩兩組合后,其對青霉和黑曲霉抑菌效果最好的為C組合(肉桂精油+山蒼子精油),B組合(肉桂精油+丁香精油)其次,而含三種精油的A組合并未展示出最強(qiáng)的抑菌活性,位列第三,各組合之間均存在顯著差異(P<0.05)。肉桂精油與山蒼子精油(C組合)、肉桂精油與丁香精油(B組合)復(fù)配后,其對青霉和黑曲霉的抑菌效果均顯著(P<0.05)優(yōu)于單一精油,顯示出極佳的協(xié)同增效作用。Júlia等[20]在用藍(lán)桉葉與巨尾桉葉復(fù)合精油對變形鏈球菌的抑菌試驗(yàn)中也發(fā)現(xiàn),兩種精油具有良好的協(xié)同增效作用。

表2 優(yōu)選植物精油復(fù)合對大米青霉和黑曲霉的抑制效果Table 2 Antimirobial effect of recombination of essential oils selected against Penicillium and Aspergillus niger

注:同一列標(biāo)有不同的小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。

分別對肉桂與山蒼子精油、肉桂與丁香精油對大米青霉、黑曲霉的MGDC 和FIC進(jìn)行測定,結(jié)果如表3、表4所示。由表3可見,肉桂精油和山蒼子精油等體積混合后,其抑制青霉和黑曲霉的FIC值均小于0.5,進(jìn)一步說明肉桂精油和山蒼子精油復(fù)配對青霉和黑曲霉的抑菌效果具有極佳的協(xié)同效應(yīng)。其對青霉和黑曲霉的MGDC值比單一精油明顯下降,也充分佐證了這一點(diǎn)。

由表4可知,肉桂和丁香精油等體積混合后,抑菌效果明顯提高,其對青霉和黑曲霉的抑菌FIC值均小于0.5,MGDC也明顯降低,說明二者也存在協(xié)同增效作用,但效果較肉桂和山蒼子精油組合略差。

2.3 不同配比復(fù)合精油對青霉、黑曲霉的抑制作用

肉桂和山蒼子精油,肉桂和丁香精油等體積混合后,展示出很好的協(xié)同抑菌效果,為了探明復(fù)合精油的最佳比例,對不同比例復(fù)合精油進(jìn)行對比試驗(yàn),篩選出效果最好的配方。

不同配比復(fù)合精油對青霉和黑曲霉的MIC分別見圖1和圖2。由圖1可以看出,對黑曲霉而言,當(dāng)肉桂精油與丁香精油的比例由1∶7向1∶3變化時(shí),其抑菌效果會(huì)隨著丁香精油占比的降低而提高,在1∶3時(shí)抑菌活性最強(qiáng),繼續(xù)由1∶3向7∶1變化時(shí),其抑菌效果會(huì)隨著肉桂精油占比的增加而降低;對青霉而言,變化趨勢與對黑曲霉的大體相同,但MIC最低值出現(xiàn)在兩者比例為1∶1時(shí)。

由圖2所知,肉桂精油與山蒼子精油體積比為3∶1時(shí)對青霉和黑曲霉抑菌效果最好,MIC均為0.1 μL/mL。但圖2卻有兩個(gè)相對低點(diǎn),分別出現(xiàn)在肉桂和山蒼子精油的比例為3∶1和1∶3時(shí),說明這兩種精油協(xié)同抑菌時(shí),可能是以一種為主導(dǎo)一種為輔的形式。當(dāng)以肉桂精油為主導(dǎo)時(shí),即當(dāng)比例在7∶1到1∶1之間時(shí),3∶1的比例抑菌效果最明顯;而當(dāng)以山蒼子精油為主導(dǎo)時(shí),即當(dāng)比例在1∶1到1∶7之間時(shí),1∶3的比例又是效果最好的。相對而言,以肉桂精油為主導(dǎo)的配比效果最佳,即肉桂與山蒼子精油體積比為3∶1時(shí),對青霉和黑曲霉的MIC均為0.1 μL/mL。綜上所述,肉桂精油和山蒼子精油的體積比為3∶1,對大米中的青霉、黑曲霉具有較好的抑制效果。

圖1 不同配比肉桂與丁香復(fù)合精油 對青霉和黑曲霉的MICFig.1 The MIC of different ratio of essential oil from cinnamon and clove against Penicillium and Aspergillus niger

圖2 不同配比肉桂與山蒼子復(fù)合精油 對青霉和黑曲霉的MICFig.2 The MIC of different ratio of essential oil from cinnamon and litsea cubeba against Penicillium and Aspergillus niger

3 結(jié)論

在9種供試植物精油中,肉桂精油和丁香精油對青霉和黑曲霉的抑菌效果最佳,山蒼子精油和藍(lán)桉葉精油次之。在復(fù)合精油中,肉桂精油和山蒼子精油組合的抑菌效果最好,說明兩者的協(xié)同增效性最佳,且當(dāng)肉桂精油與山蒼子精油的體積比為3∶1時(shí),該復(fù)合精油對青霉和黑曲霉的抑菌效果最好,其MIC僅為0.1 μL/mL。故肉桂與山蒼子精油按適當(dāng)比例復(fù)配,可作為一種具良好應(yīng)用前景的大米防霉保鮮劑。