阻斷雙側終板營養(yǎng)途徑構建山羊椎間盤退變模型

尹 思，杜 恒，趙為公，麻少輝，張 明，管 民，劉 淼

椎間盤退變(intervertebral disc degeneration,IDD)可引起椎間盤突出、脊柱失穩(wěn)、椎管狹窄、椎間盤源性腰痛等疾病，已成為中老年病殘和生活質(zhì)量下降的主要病因[1]。IDD具體發(fā)病機制尚不明確，營養(yǎng)物質(zhì)的減少被認為是諸多因素中的最終途徑[2]。研究[3-4]證實椎間盤營養(yǎng)障礙會導致IDD，但是對于阻斷椎間盤終板營養(yǎng)途徑是否會造成IDD的發(fā)生，目前的研究結果存在爭議。Hutton et al(2004年)通過阻斷狗的單側終板營養(yǎng)途徑，70周后解剖學、形態(tài)學和影像學檢查均未發(fā)現(xiàn)明顯IDD的征象，而酶聯(lián)標記免疫吸附測定發(fā)現(xiàn)髓核和纖維環(huán)中蛋白多糖含量顯著增加。Kang et al[5]在未成熟豬的動物模型中，通過骨水泥注射的方法阻斷雙側椎板營養(yǎng)途徑長達3個月，影像學和組織學檢查證實阻斷營養(yǎng)途徑后的椎間盤較對照組發(fā)生顯著的退變表現(xiàn)。本實驗于2017年4月～2018年10月在西安交通大學第一附屬醫(yī)院實驗室完成。通過建立山羊椎間盤雙側終板營養(yǎng)途徑阻斷的動物模型，觀察IDD的情況，研究椎間盤終板營養(yǎng)途徑與IDD的相關性。

1 材料與方法

1.1 實驗動物選取來自同一畜牧區(qū)相同品種的雌性健康清潔級關中山羊8只(由西安交通大學醫(yī)學院動物中心提供)，24月齡，體重35～45 kg。檢疫合格，無任何畜類疾病及傳染病，標準飼養(yǎng)條件下適應性飼養(yǎng)2周。本研究中動物實驗已被西安交通大學第一附屬醫(yī)院倫理委員會批準實施，并遵守相關實驗動物飼養(yǎng)與使用指南。實驗過程中遵守實驗動物倫理原則，盡可能減少實驗動物的痛苦，妥善處理動物尸體。

1.2 山羊雙側終板營養(yǎng)途徑阻斷的動物模型建立術前禁飲食24 h，術前30 min肌注阿托品0.05 mg/kg和地西洋10 mg?；A麻醉并行氣管插管，山羊右側臥位，頭部略低于軀干，以最末一節(jié)肋骨下緣、髂嵴上緣、腰椎橫突下4 cm、腰椎橫突為邊界的矩形區(qū)域剃毛備皮、消毒。自山羊末肋下緣為起點，旁腰椎橫突外2 cm的縱線為切口，長約10 cm。依次切開皮膚、皮下組織、腹外腹內(nèi)斜肌，經(jīng)左側腹膜外入路暴露腰椎間盤，避免損傷椎體周圍組織和腰橫動、靜脈。以L2～3、L3～4為實驗椎間盤。平行于椎間盤上、下終板約2 mm處用骨刀和擺鋸在椎體開槽，寬2～3 mm，將椎體松質(zhì)骨切除，僅保留骨皮質(zhì)。骨缺損處用聚甲基丙烯酸樹脂(PMMA)骨水泥填塞，骨水泥量≤2 ml，阻斷椎體和終板之間的營養(yǎng)通路。見圖1。L1～2、L4～5未損傷椎間盤作為正常對照。操作完成后逐層縫合傷口。待動物麻醉作用消失后，拔出氣管插管并肌注地塞米松5 mg。術后1～3 d每日肌注青霉素180萬單位，術后常規(guī)飼養(yǎng)。

圖1 山羊雙側終板營養(yǎng)途徑阻斷模型的建立A.顯露腰椎椎體及椎間盤；B.平行于終板2 mm處截骨(箭頭為截骨處)；C.骨缺損處注射骨水泥填充(箭頭為骨水泥)；D.截骨骨板

1.3 影像學評估實驗動物于術后4、12、24、48周隨機選取2只?；A麻醉后將山羊置于側臥位攝腰椎側位X線片。使用Philips Intera Achieva 1.5 T雙梯度磁共振系統(tǒng)行腰椎MRI檢查。采用SENSE相共振體線圈包裹羊腰椎，側臥位，尾先進，先行T2WI-TSE-SPAIR(TR/TE=3 500 ms/60 ms，層厚/層間距=4.0 mm/0.6 mm，掃描時間為3 min 31 s)掃描，然后進行矢狀位T1-TSE-SPIR(TR/TE=400 ms/7.8 ms，層厚/層間距=4.0 mm/0.6 mm)平掃。根據(jù)X線片結果測量椎間隙高度變化，計算椎間高度指數(shù)(disc height index,DHI)，即椎間盤前、中、后平均高度除以相鄰兩椎體高度。前后椎間高度的變化以DHI百分比(DHI%)表示，DHI%=(術后DHI/術前DHI)×100%。根據(jù)椎間盤MRI在T2WI矢狀面的信號及形態(tài)，IDD的分級采用Pfirrmann分級評分方法：正常Ⅰ級(1分)；輕度退變 Ⅱ級(2分)；中度退變 Ⅲ級(3分)；重度退變Ⅳ級(4分)；嚴重退變Ⅴ級(5分)。

1.4 骨水泥有效阻斷面積的測定于術后4、12、24、48周各隨機選取2只山羊，行影像學檢查后通過吸入過量乙醚的方法執(zhí)行安樂死，同時取出L1～2、L2～3、L3～4和L4～5共8個椎間盤(包括4個兩側阻斷營養(yǎng)通路的椎間盤、4個正常對照的椎間盤)。將椎間盤行脫鈣處理和石蠟包埋。脫鈣后的組織標本用鋸片和切片刀沿骨水泥與終板之間的界面將椎間盤與椎體分離，再將骨水泥從椎體上剝離。分別對鄰近終板側的椎體斷面和骨水泥進行等距離、等倍數(shù)的數(shù)碼拍照。將數(shù)據(jù)用CAD軟件進行處理，分別計算出椎體和骨水泥的橫斷面積，計算骨水泥有效阻斷面積。有效阻斷面積=(頭側椎體橫斷面積+尾側椎體橫斷面積)/(頭側骨水泥橫斷面積+尾側骨水泥橫斷面積)×100%。

1.5 組織學檢查椎間盤組織行脫鈣處理和石蠟包埋后切片，每張厚度4～6 μm，分別行HE染色、Masson三色染色、蛋白多糖染色、番紅O染色。

2 結果

8只山羊均順利完成實驗，手術及麻醉過程平穩(wěn)，術后沒有發(fā)生呼吸困難、脫水、腸脹氣或傷口感染等副反應事件。

2.1 骨水泥有效阻斷面積見表1。在建立山羊雙側終板營養(yǎng)途徑阻斷的動物模型過程中，經(jīng)大體標本驗證8只山羊均是距終板1～2 mm處行椎體松質(zhì)骨切除，切除范圍為椎體中心區(qū)域的骨質(zhì)，骨水泥分布均勻，無滲漏。骨水泥有效阻斷面積為49.6%～69.6%(60.7%±5.3%)。

2.2 影像學結果見表1。術后48周時，DHI%實驗椎間盤為60.5%～81.7%(72.7%±5.6%)，對照椎間盤為79.4%～93.8%(86.5%±4.6%)；椎間盤退變Pfirrmann分級評分實驗椎間盤為3～5(4.0±0.7)分，對照椎間盤為1～2(1.4±0.5)分，兩者兩項比較差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。

2.3 組織學結果見圖2。

2.3.1HE染色 ① 對照椎間盤：髓核基質(zhì)均一，脊索及類軟骨細胞形態(tài)正常、細胞分布均勻，膠原纖維排列整齊，層次分明，纖維環(huán)和髓核聯(lián)系緊密，脊索及類軟骨細胞豐富；軟骨終板細胞排列整齊、細胞核清晰。② 實驗椎間盤：術后12周髓核出現(xiàn)皺縮或干癟、變小、纖維化，纖維環(huán)和髓核分界不清。髓核基質(zhì)分布不均一，脊索及類軟骨細胞分布不均勻；軟骨終板細胞排列紊亂、細胞核存在，血管增生。術后24周可見髓核基質(zhì)不均一，脊索及類軟骨細胞減少，纖維樣細胞增多；軟骨終板區(qū)血管增生，軟骨細胞核模糊、消失，只剩輪廓。術后48周可見髓核基質(zhì)明顯不均一，脊索及類軟骨細胞明顯減少；軟骨終板區(qū)血管增生，鈣化、纖維細胞增生，軟骨細胞消失。

表1 山羊雙側終板營養(yǎng)途徑阻斷48周后的骨水泥有效阻斷面積、DHI%和Pfirrmann分級評分

圖2 山羊雙側終板營養(yǎng)途徑阻斷實驗術后12、24、48周和正常對照的不同組織學結果A.正常對照；B.實驗12周；C.實驗24周；D.實驗48周；① 髓核組織HE染色×100; ② 軟骨終板HE染色×200; ③ Masson三色染色×100；④ 蛋白多糖染色×200；⑤ 番紅O染色×100

2.3.2Masson三色染色 ① 對照椎間盤：髓核膠原纖維排列整齊，層次分明，纖維環(huán)和髓核聯(lián)系緊密。② 實驗椎間盤：術后12周髓核膠原纖維排列欠整齊，層次尚分明；術后24周髓核膠原纖維排列紊亂，層次欠分明；術后48周髓核膠原纖維排列紊亂，不均一，纖維環(huán)和髓核間出現(xiàn)裂隙。

2.3.3蛋白多糖染色 ① 對照椎間盤：髓核蛋白多糖染色均一，排列整齊，脊索及類軟骨細胞分布均勻、形態(tài)正常。② 實驗椎間盤：術后12周髓核蛋白多糖染色不均，排列不整齊，脊索及類軟骨細胞減少；術后24周髓核蛋白多糖染色明顯變淡，排列較紊亂，脊索及類軟骨細胞有所減少；術后48周髓核蛋白多糖染色出現(xiàn)裂隙，排列紊亂，脊索及類軟骨細胞明顯減少。

2.3.4番紅O染色 ① 對照椎間盤：髓核膠原纖維排列整齊，層次分明，脊索及類軟骨細胞豐富。② 實驗椎間盤：術后12周髓核膠原纖維排列不整齊，染色欠均一，脊索及類軟骨細胞較多；術后24周髓核膠原纖維排列不整齊，染色不均一，脊索及類軟骨細胞減少；術后48周髓核膠原纖維排列紊亂，出現(xiàn)裂隙，染色明顯不均，脊索及類軟骨細胞明顯減少。

3 討論

椎間盤的營養(yǎng)通路主要有兩種：一是終板營養(yǎng)途徑，椎體內(nèi)血管的營養(yǎng)物質(zhì)通過骨髓腔-血竇-軟骨終板擴散到椎間盤，營養(yǎng)髓核及纖維環(huán)內(nèi)層，此途徑是椎間盤營養(yǎng)的主要途徑[5]；二是纖維環(huán)營養(yǎng)途徑，營養(yǎng)物質(zhì)從纖維環(huán)表面的血管擴散進入纖維環(huán)外層，營養(yǎng)范圍相對較局限[3]。當上述環(huán)節(jié)中的任何一環(huán)發(fā)生問題時，椎間盤的營養(yǎng)就會受到影響。目前阻斷終板營養(yǎng)途徑的動物模型多為單側阻斷模型，且阻斷后對IDD的影響也存在爭議[5-6]。本研究建立山羊椎間盤雙側終板營養(yǎng)途徑阻斷的動物模型，利用PMMA骨水泥注入的方法成功阻斷終板營養(yǎng)供應，有效阻斷面積達60.7%，并通過影像學和組織學評估證實椎間盤終板營養(yǎng)途徑與IDD的相關性。

理想的IDD動物模型應具有以下特點：① 所選動物解剖和生理特點盡可能與人類近似；② 能再現(xiàn)IDD的客觀規(guī)律；③ 模型重復性好[7-8]。本實驗選用24月齡的山羊，其生理年齡相當于人青春期，體格發(fā)育完善，椎間盤未出現(xiàn)退變，可較好地模擬IDD的過程。前期研究[9]通過對山羊腰椎結構的解剖和MRI動態(tài)增強掃描分析，證實山羊腰橫動脈分布于椎體中部，且營養(yǎng)物質(zhì)通過骨髓腔-血竇-軟骨終板界面彌散到髓核，為建立雙側阻斷終板營養(yǎng)途徑的山羊動物模型提供了實驗解剖和影像學基礎。

阻斷雙側終板營養(yǎng)途徑的山羊動物模型的設計原理是在不影響脊柱穩(wěn)定性的前提下，避免生物力學方面對椎間盤營養(yǎng)及代謝造成的影響，進行終板營養(yǎng)阻斷，進而促進IDD發(fā)生。因此，選用合適的阻斷物對于實驗結果的準確性和可信度至關重要。本實驗選用PMMA骨水泥作為阻斷終板營養(yǎng)途徑的阻斷物，不僅可以有效地阻斷椎體與終板之間的血液供應，而且利用骨水泥的強度可以保證椎體的完整性和力學強度[10-11]。另一個需要關注的問題是PMMA骨水泥的聚合反應所產(chǎn)生的熱量是否會造成椎間盤和終板的熱損傷，進而引起椎間盤和終板的退變，對實驗結果造成影響。聚合熱的高低與環(huán)境溫度、周圍組織結構、骨水泥初始溫度、體積、厚度等因素有關。Lai et al[12]報道在行椎體后凸成形術時，椎體前、后皮質(zhì)和椎間孔的峰值溫度不超過45 ℃，不會對周圍軟組織造成直接的熱損傷。鄧忠良 等[13]在骨質(zhì)疏松的患者中行椎體成形術過程中用計算機控制熱電偶型溫度傳感穿刺針動態(tài)檢測骨水泥表面部位溫度變化，注射骨水泥平均3.1 ml，峰值溫度為38.5～40.0 ℃，持續(xù)時間0.5～2.5 min，且峰值溫度與注射劑量呈正相關，上述溫度均低于組織蛋白熱凝固的溫度(47～56 ℃)。本實驗中，在確保有效阻斷椎體與終板間血供的情況下，骨缺損的厚度≤3 mm，骨水泥注射的體積≤2 ml，以確保椎體、終板及髓核不受到聚合熱的損傷。

終板阻斷的部位和阻斷面積是建立終板營養(yǎng)途徑阻斷的動物模型成功與否的重要因素。研究[14-15]證實髓核的營養(yǎng)供應主要依靠終板中央?yún)^(qū)域血管的彌散作用。因此，為有效地阻斷通往髓核的營養(yǎng)供應途徑，就必需阻斷椎體和終板之間的血液供應，尤其是終板中心區(qū)域。而在本研究建立動物模型過程中，術者在術中將距終板1～2 mm椎體中心區(qū)域的髓腔骨質(zhì)切除，并用PMMA骨水泥注射填充，其平均阻斷面積達60.7%，顯著高于先前文獻報道[5]的阻斷面積(38.92%)，因此從理論上證明能夠確實有效地阻斷終板營養(yǎng)途徑。本實驗在建立山羊動物模型的基礎上，成功阻斷雙側終板營養(yǎng)途徑48周后，通過影像學和組織學評估證實椎間盤營養(yǎng)和IDD的相關性。術后48周時實驗椎間盤的椎間高度丟失和Pfirrmann退變分級評分均顯著高于對照。HE染色、Masson三色染色、蛋白多糖染色、番紅O染色等多種組織學檢查也均證實了阻斷雙側終板營養(yǎng)途徑后IDD的發(fā)生，包括纖維環(huán)塌陷、脊索及類軟骨細胞的減少、1型膠原的增加和2型膠原的減少等，且隨時間延長逐步加重。

本研究建立了阻斷雙側終板營養(yǎng)途徑的山羊IDD的動物模型；骨水泥注射填塞48周后影像學和組織學結果證實阻斷終板營養(yǎng)途徑可以導致IDD的發(fā)生。本研究的局限性：實驗中未設置如纖維環(huán)穿刺等陽性對照，且陰性對照選擇了同一動物體內(nèi)的相鄰節(jié)段椎間盤，而非不同動物的相同節(jié)段椎間盤；這些會一定程度地影響實驗結果的可靠性。在今后的研究中，以建立的阻斷雙側終板營養(yǎng)途徑的動物模型為基礎，可以開展一系列椎間盤退變相關的基礎研究，包括利用動態(tài)增強MRI技術研究毛細血管網(wǎng)灌注與軟骨終板彌散的相關性、軟骨終板退變或鈣化導致IDD的機制研究等，為深入研究IDD的發(fā)病機制、提升椎間盤退變性疾病的臨床治療水平奠定基礎。