育肥豬腸道變形桿菌的分離鑒定及系統(tǒng)發(fā)育性分析

于季申，孟祥竹，陳宜賢，張曉軒，倪宏波，李鵬

（黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動物科技學(xué)院，大慶 163319）

豬是現(xiàn)今畜牧業(yè)中提供肉食品的重要雜食性動物，同時也是研究人的腸道菌群的主要模型動物之一[1]。在過去雖然在豬腸道菌群的結(jié)構(gòu)、功能及宿主關(guān)系等多方面都開展了大量研究[2]，但至今，學(xué)者們對豬腸道菌群的真實情況仍然不夠了解。維持動物胃腸道內(nèi)平衡的微生物群落是腸道健康的重要組成部分，豬腸道內(nèi)定居著數(shù)量龐大、種類繁多的微生物菌群。微生物菌群之間形成了相互依存、相互作用的整體。微生物與動物的生長、發(fā)育、消化、吸收、營養(yǎng)、代謝、免疫等方面的過程有直接關(guān)系。豬腸道微生物主要包括厭氧菌、需氧菌和兼性厭氧菌。其中，厭氧菌占腸道微生物的98%以上，是腸道中的優(yōu)勢細(xì)菌，而好氧菌和兼性厭氧菌占總菌數(shù)的1%以下[3]。通常情況下，豬腸道的微生物由生理性細(xì)菌、條件致病菌和病原菌組成。動物腸道微生物群也由多種細(xì)菌組成，影響宿主多方面功能。揭示豬腸道微生物群落的分類組成和功能對于鑒定微生物在宿主中的生理和健康具有重要意義。由于豬腸道微生物群落影響著豬機(jī)體健康和生產(chǎn)性能，因此，盡管大多數(shù)關(guān)于微生物菌群的研究都受到培養(yǎng)技術(shù)的限制，但腸道微生物的結(jié)構(gòu)和功能仍受到很多學(xué)者的關(guān)注，幾十年來一直是一個重要的研究熱點。

變形桿菌為人畜共感染的機(jī)會致病菌[4]。據(jù)報道，1962～2007 年國內(nèi)各個省份變形桿菌屬導(dǎo)致重大食物中毒事件264 起，中毒人數(shù)達(dá)1.7 萬人[5]。普通變形桿菌是多種細(xì)菌性感染與食物中毒的病原[6]。奇異變形桿菌為無莢膜、無芽孢、有鞭毛和有菌毛的革蘭陰性桿菌，其廣泛分布于自然界、動物糞便、臨床標(biāo)本以及人和動物的腸道內(nèi)，是導(dǎo)致人和動物感染的重要條件致病菌。BISGAARD 等[1]首次從患輸卵管炎的產(chǎn)蛋雞中分離到奇異變形桿菌；江益民等[7]首次從病死肉雞中分離到奇異變形桿菌。近年來，奇異變形桿菌感染流行趨勢不斷擴(kuò)大，鵪鶉[8]、狐貍[9]、鴿子[10]、貂[11-12]等動物感染奇異變形桿菌的報道屢見不鮮，盡管近些年國內(nèi)有關(guān)豬源變形桿菌的報道很多，但變形桿菌身為人畜共患條件致病菌，在健康人和動物腸道中存在，一定條件下引起食物中毒，表現(xiàn)惡心、嘔吐、腹瀉等，依然受到很多學(xué)者的關(guān)注。

廣泛分布的16S rRNA 基因的DNA 序列測定長期以來一直被用作確定原核生物系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系的金標(biāo)準(zhǔn)。它是目前唯一的分類標(biāo)記，Vinje 等[13]為其建立了包含綜合分類信息的數(shù)據(jù)庫。16S rRNA 基因的鑒別位點位于9 個可變區(qū)（V1-V9），這對準(zhǔn)確估計微生物多樣性的豐富度很重要，但其他區(qū)域也對鑒別能力有顯著貢獻(xiàn)。Klindworth 等[14]在用于16S rRNA 基因擴(kuò)增的寡核苷酸的設(shè)計中根據(jù)16 SrRNA 基因的總覆蓋度和譜系光譜，對其所包含的可變區(qū)進(jìn)行優(yōu)化。16S rRNA 基因序列大腸桿菌有1 542 bp 長。Amir等[15]為了克服現(xiàn)有的閱讀長度測序技術(shù)的不足，已經(jīng)有各種成功的嘗試，通過整合從16S rRNA 基因的多個可變區(qū)域獲得的短讀來獲得更高的分辨率。或由Miller 等[16]短讀的整個16 Srdna 序列組裝而成。然而，短讀序列的排列，特別是在組裝含有16S rRNA基因高度保守區(qū)域的基因時，可能具有挑戰(zhàn)性，而且容易出錯。通過對常規(guī)和焦測序水稻根系微生物16S rRNA（V1-V4）測序數(shù)據(jù)進(jìn)行比較，獲得不同長度的數(shù)據(jù)，Okubo[17]和他的同事們由于過高估計水稻根系微生物在屬水平上的顯著性差異，發(fā)現(xiàn)了根瘤菌在層面上沒有觀察到任何偏差。為了得出類似的結(jié)論，Yarza[18]和他的同事從16S 核糖體rna 部分序列的otu 聚類中預(yù)測，要全面、可靠地估計類群豐富度，尤其是對高分類等級的分類，需要近全長片段長度大于1 300 個核苷酸的序列。目前，GS FLX+測序器（Roche/454）使用鈦XL+化學(xué)可以達(dá)到1 000 bp 的閱讀長度。隨著新測序平臺的發(fā)展，16S rRNA 基因的全長分析成為可能。一個限制因素是，Yarza 目前發(fā)表的16S rRNA 序列長度中只有23%大于900 bp，測序技術(shù)的發(fā)展和數(shù)據(jù)庫的全長度讀取是相互依賴的，高質(zhì)量的16 SrRNA 數(shù)據(jù)將迅速增加。Mosher[19]和他的同事分析了PacBioRSⅡ測序器獲得從元基因組環(huán)境樣品中產(chǎn)生的16S rRNA 片段的全長度讀取的能力。雖然高誤差率（17%～18%）大大高估了他們在2013 年的初步研究中的物種豐富度，但16S 測序技術(shù)的進(jìn)一步改進(jìn)大大改善了結(jié)果，使微生物的準(zhǔn)確鑒定達(dá)到環(huán)境樣品中的物種水平。綜上所述，近些年的快速發(fā)展和新的創(chuàng)新測序技術(shù)的能力，經(jīng)過仔細(xì)的錯誤監(jiān)測和故障排除，已經(jīng)適應(yīng)科學(xué)時代的要求。16S 測序、宏基因組和培養(yǎng)組的聯(lián)合可以驗證前人海量的大數(shù)據(jù)分析結(jié)果，同時也為提高商品豬的高效安全養(yǎng)殖帶來可能。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器和試劑

試劑：Taq MasterMix，Marker 均選自（寶日生物公司）；EB，50xTAE，VK1 均選自（北京索萊寶公司）；16S 7F 引物，1510R 引物及測序服務(wù)由上海生工公司完成引物序列如下：

上游1510R 引物: 5′-ACGGYTAGGTTGTTACGACTTT -3′；

下 游 7F 引 物: 5′ -AGAGTAAGATYMTGGCTCAGG -3′。

1.1 方法

1.2.1 樣品的采集

采用直腸采集法從某豬場采集6 頭健康的大白品種育肥豬新鮮糞便各1 份。糞便樣本直接放置在厭氧袋中，并置于帶冰的泡沫箱中，立刻運(yùn)送回實驗室做下一步處理。

1.2.2 實驗前準(zhǔn)備工作

準(zhǔn)備工作：前期送到的所有的試劑及材料，都需要進(jìn)行滅菌處理，以保證無菌，減少損失。

（1）提前兩天將進(jìn)行營養(yǎng)液的無菌處理，需將牛瘤胃液和脫纖維的羊血進(jìn)行涂板檢驗。若發(fā)現(xiàn)有污染。先用0.45 μm，后用0.2 μm 孔徑的濾膜進(jìn)行過濾，再涂板檢驗，每次用完牛瘤胃液和羊血后，都需要涂板檢驗。將未使用的培養(yǎng)皿進(jìn)行紫外消毒。

（2）提前一天將培養(yǎng)基配置完成，共3 種培養(yǎng)基見表1，加熱溶解后進(jìn)行高壓滅菌后待培養(yǎng)基涼至60 ℃加入營養(yǎng)液，倒板。板放入4 ℃保存。每種平板拿出一塊放入37 ℃溫箱孵育確保無污染。

表1 培養(yǎng)基名稱及廠家Table 1 Name and manufacturer of culture medium

1.2.3 16S rRNA 基因PCR 擴(kuò)增

對應(yīng)試管在3 個1.5 mL EP 管標(biāo)號。搖晃試管，使菌體與培養(yǎng)液混勻。PCR 檢測及測序：吸取菌液500 μL 注入到一個EP 管中，12 000 rpm，10 min，棄上清，加入1 mL 去離子水，用封口膜封上。電磁爐100 ℃水浴煮6 min。取0.3～0.5 μL 進(jìn)行PCR。

擴(kuò)增PCR 反應(yīng)程序見（表2）。

表2 16S rRNA 基因擴(kuò)增PCR 反應(yīng)程序Table 2 PCR reaction procedure of 16Sr RNA gene amplification

（1）第一次PCR 體系為：25 μL max，0.5 μL 模板，1 μL 上游引物，1 μL 下游引物，22.5 μL 水，陰性對照模板改為水。

（2）將第一次顯示為陰性的樣本進(jìn)行二次PCR，此時模板量改為3 μL。

（3）對PCR 產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。0.2 g 瓊脂糖+20 mL TAE，加熱溶解后室溫放置至60 ℃左右，加入1 uLEB，混勻后對光檢查液體內(nèi)EB是否全部溶解，倒入模具。15 min 后加樣；0.4 g 瓊脂糖+40 mL TAE，加入2 μL EB。

（4）對電泳檢測條帶正確的PCR 產(chǎn)物送測序。

1.2.4 藥敏試驗

將鑒定為奇異變形桿菌和普通變形桿菌的純培養(yǎng)物用接種棒均勻涂布在鮮血培養(yǎng)基上，將藥敏紙片（氟苯尼考、頭孢曲松高度敏感；鏈霉素、鹽酸林可霉素、卡那霉素、新霉素、氨芐西林鈉、阿莫西林、慶大霉素9 種藥物）分別貼于平皿中，37 ℃培養(yǎng)24 h，測定抑制菌圈直徑大小，根據(jù)檢測標(biāo)準(zhǔn)判定結(jié)果。

1.2.5 數(shù)據(jù)分析

（1）測序結(jié)果與Genebank 數(shù)據(jù)庫中登錄的基因序列進(jìn)行同源性比對分析。

（2）用DNA Star 軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，并進(jìn)行同源性分析。

（3）將15 株菌的藥敏結(jié)果進(jìn)行對比分析，測定抑制菌圈直徑大小，根據(jù)檢測標(biāo)準(zhǔn)判定結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 PCR 鑒定結(jié)果

通過提取細(xì)菌DNA 為PCR 模板，應(yīng)用16S 通用引物1510R 和7f 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增得到目的片段約為1 700 bp，其部分結(jié)果如圖1：

圖1 細(xì)菌擴(kuò)增16S rRNA 結(jié)果Fig.1 Amplification of 16S rRNA by bacteria

2.2 菌分離鑒定結(jié)果

通過16S rRNA 基因測序鑒定，最終分離鑒定結(jié)果包括：奇異變形桿菌（Proteus mirabilis）、變形桿菌（Proteus mirabilis）、糞腸球菌（Enterococcus faecalis）、表皮葡萄球菌（Staphylococcus epidermidi）、腐生葡萄球菌（Staphylococcus saprophyticus）和地芽孢桿菌（Bacillus licheniformis），見表3。

2.3 16S rRNA 基因組DNA 序列分析

將分離菌株H1-H15 的PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測序，測序后利用MED6 軟件系統(tǒng)發(fā)育樹分析發(fā)現(xiàn)，H1-H15同源性都接近于100%；見圖2。最后在NCBI 上利用BLAST 軟件與Gen Bank 中公布的12 株參考菌株進(jìn)行同源性對比分析，與參考菌株的同源性為99.8%～100%，見圖3。最終確定H1-H15 都為變形桿菌。

表3 分離鑒定菌種結(jié)果Table 3 Isolation and identification of bacteria

圖2 分離菌株的16S rRNA 基因的進(jìn)化樹分析Fig.2 Evolutionary tree analysis of 16S rRNA gene of isolated strains

圖3 同源性比對分析結(jié)果Fig.3 Analysis results of homology comparison

2.4 藥敏實驗結(jié)果（見表4）

表4 15 株變形桿菌的綜合藥敏結(jié)果Table 4 15 comprehensive drug sensitivity results of proteus

3 討論

近年來，奇異變形桿菌感染流行趨勢不斷擴(kuò)大，鵪鶉、狐貍、鴿子、貂等動物感染奇異變形桿菌的報道屢見不鮮，禹文海等[20]報道了用PCR 的方法快速檢測獼猴的奇異變形桿菌；段二珍等[21]報道了從病死的狐貍體內(nèi)分離出奇異變形桿菌，該菌具有很強(qiáng)的致病力，通過系統(tǒng)發(fā)育樹分析與貉的奇異變形桿菌有很高的同源性；周芳等[22]報道了雞源的奇異變形桿菌感染后通過系統(tǒng)發(fā)育分析發(fā)現(xiàn)該菌發(fā)生變異，耐藥性增強(qiáng)，史同瑞等[23]報道了水貂的奇異變形桿菌對卡那霉素、鏈霉素、阿米考星等藥物敏感，對氧氟沙星、紅霉素等多種抗生素耐藥；任梅滲等[24]報道了豬源奇異變形桿菌對很多種抗生素有很強(qiáng)的耐藥性；李欣南等[25]報道了雞源奇異變形桿菌在肉雞養(yǎng)殖中具有較高的感染率，該菌對11 種抗生素的耐藥性普遍偏高，其中對黏桿菌素、氟苯尼考、恩諾沙星等9種藥物耐藥率達(dá)到了80% 以上，對頭孢噻呋等藥物敏感，綜合參看近年來CNKI 上關(guān)于動物奇異變形桿菌的文獻(xiàn)，目前只局限于對單株變形桿菌的動物致病力實驗、體內(nèi)分離、藥物分析等基本實驗數(shù)據(jù)分析，而且單個菌株到幾個菌株都只局限于小數(shù)據(jù)分析，不足以說明實質(zhì)問題。16S 測序、宏基因組和培養(yǎng)組的聯(lián)合可以驗證前人海量的大數(shù)據(jù)分析結(jié)果，利用組學(xué)的培養(yǎng)技術(shù)與16S 測序鑒定共鑒定出15 株變形桿菌；實驗主要著重于豬腸道變形桿菌的生長特性和大數(shù)據(jù)分析，這正是與海量前人的實驗結(jié)果的鮮明對比之處；實驗結(jié)果驗證豬腸道變形桿菌可以通過培養(yǎng)組學(xué)技術(shù)培養(yǎng)出來。在了解變形桿菌生長特性后入手并做了藥物分析實驗，結(jié)果顯示氟苯尼考、頭孢曲松高度敏感。實驗結(jié)果既能說明豬腸道變形桿菌的培養(yǎng)特性，又能從大數(shù)據(jù)實驗數(shù)據(jù)角度分析驗證前人海量的實驗數(shù)據(jù)。

奇異變形桿菌雖然在現(xiàn)今集約化養(yǎng)殖條件的豬場不易被發(fā)現(xiàn)，但通過培養(yǎng)組學(xué)技術(shù)以及16S 測序技術(shù)解決了實際問題，又通過系統(tǒng)進(jìn)化樹發(fā)育性分析及Gen Bank 中參考菌株的同源性比對最終確定了11 株奇異變形桿菌，4 株普通變形桿菌。說明了變形桿菌可以在體外分離培養(yǎng)，只要做好預(yù)防措施會大幅度的提升商品豬變形桿菌感染的安全問題，實驗雖然藥敏結(jié)果顯示氟苯尼考、頭孢噻呋高度敏感，但不可生搬硬套，因為有些養(yǎng)殖場，長期不科學(xué)使用抗生素可導(dǎo)致耐藥性過強(qiáng)，同時會增加奇異變形桿菌病的治療難度，各豬場在針對本病進(jìn)行預(yù)防時應(yīng)選用不同的抗生素，要靈活運(yùn)用，根據(jù)豬場的實際情況，做好防重于治的準(zhǔn)備，例如飼養(yǎng)密度、濕度、溫度、免疫程度、是否定期消毒；都要考慮在發(fā)病因素內(nèi)，一旦發(fā)現(xiàn)致病菌及時治療并對癥下藥[26]。

4 結(jié)論

（1）該試驗通過16S rRNA 基因測序技術(shù)和培養(yǎng)組學(xué)技術(shù)分離鑒定出11 株奇異變形桿菌和4 株普通變形桿菌，并且通過發(fā)育樹分析和同源性比對分析說明了健康大白品種育肥豬奇異變形桿菌和普通豬源性變形桿菌的親緣性和遺傳進(jìn)化規(guī)律。

（2）藥敏結(jié)果顯示奇異變形桿菌和普通變形桿菌對于氟苯尼考、頭孢曲松高度敏感；鏈霉素、鹽酸林可霉素、卡那霉素、新霉素、氨芐西林鈉中度敏感；阿莫西林、慶大霉素耐藥。氟苯尼考、頭孢曲松可作為臨床感染治療的參考用藥。