刀鱭肌間骨新類型的發(fā)現(xiàn)

常永杰 周佳佳 張麗紅 孟佑廉 高澤霞 ,

(1. 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院, 農(nóng)業(yè)部淡水生物繁育重點實驗室/農(nóng)業(yè)動物遺傳育種與繁殖教育部重點實驗室, 武漢 430070;2. 淡水水產(chǎn)健康養(yǎng)殖湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心, 武漢 430070; 3. 池塘健康養(yǎng)殖湖北省工程實驗室, 武漢 430070)

魚類的肌間骨(Intermuscular bone, IB)又名肌間刺或肌間小骨, 是位于脊椎骨兩側(cè)肌隔中的硬骨小刺, 由肌隔結(jié)締組織骨化而成的硬骨, 且通過結(jié)締組織連在其他骨骼上[1—4]。目前被認知的魚類肌間骨類型包括三類, 髓弓小骨、椎體小骨和脈弓小骨[5]。我國大宗淡水魚類普遍存在肌間骨, 對人類的食用、出口和深加工造成很大困擾, 嚴重影響了其經(jīng)濟價值[6]。

近年來有關(guān)魚類肌間骨的研究大多集中在肌間骨的數(shù)目及形態(tài), 如國外Patterson和Johnson[5]對125屬真骨魚代表種的肌間骨進行了詳細的觀察和分析。國內(nèi)對肌間骨形態(tài)學(xué)的研究集中于鯉科魚類, 董在杰等[7]對鰱(Hypophthalmichthys molitrix)、鳙(Aristichthys nobilis)、團頭魴(Megalobrama amblycephala)和異育銀鯽(Carassius auratus gibelio)的肌間骨進行了初步的探究; 柯中和等[8]、萬世明等[3]、陳琳等[4]分別對鰱、團頭魴和黃河鯉(Cyprinus carpio haematopterus)肌間骨發(fā)育的形態(tài)學(xué)進行了觀察。呂耀平等[9]對骨舌魚總目、海鰱總目、鯡形總目和骨鰾總目等共計14種低等真骨魚類的肌間骨形態(tài)學(xué)進行了系統(tǒng)研究, 認為肌間骨的形態(tài)是由簡單向復(fù)雜演化, 然后逐漸退化。在肌間骨的發(fā)現(xiàn)和分類上面僅有秉志[1]提及, 現(xiàn)今延用的是Patterson和Johnson[5]的分類標準。

刀鱭(Coilianasus), 隸屬鯡形目(Clupeiformes),鳀科(Engraulidae), 鱭屬(Coilia), 是經(jīng)濟價值較高的魚類[10,11], 其上頜骨較長, 向后延伸達到胸鰭基部,故又名長頜鱭。短頜鱭(C.brachygnathus)和刀鱭隸屬于同一屬, 其上頜骨較刀鱭短, 向后延伸不超過鰓蓋骨。鱭雖然骨刺較多, 但肉嫩味美, 深受人們喜愛。目前對鱭屬魚類, 尤其是刀鱭種群的生物學(xué)參數(shù)、繁殖特征等方面有著大量的研究[12—14], 但針對鱭屬魚類肌間骨的研究卻很少提及。本文主要對刀鱭和短頜鱭肌間骨的分布進行觀察, 在人們普遍認知的魚類三種類型肌間骨基礎(chǔ)上, 發(fā)現(xiàn)了另外一種類型肌間骨的存在。此外本文對刀鱭肌間骨數(shù)目和長度進行研究分析, 作為對魚類肌間骨形態(tài)學(xué)研究的補充。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

用于骨骼染色的刀鱭體重128 g, 體長34 cm; 短頜鱭體重45.8 g, 體長23 cm。形態(tài)解剖刀鱭共10尾,平均體重(49.58±6.16) g, 平均體長(24.39±4.39) cm。以上用于染色的刀鱭和短頜鱭于2017年8月份從鄱陽湖捕撈獲得, 解剖的刀鱭個體于2018年3月份購于江蘇省啟東市連興港碼頭。刀鱭胸鰭上部游離絲狀鰭條5—6枚, 脊椎骨77—82根, 臀鰭甚長, 與尾鰭基相連; 上頜骨游離, 超過鰓蓋后緣, 延伸至胸鰭基部。短頜鱭基本特征與刀鱭相似, 但其上頜骨較刀鱭短, 向后延伸不超過鰓蓋骨。因刀鱭和短頜鱭活魚運輸較困難, 所購買的實驗魚均為冰鮮魚。

1.2 刀鱭物種鑒定

提取刀鱭鰭條組織DNA, 根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫中已有的刀鱭COⅠ基因序列(GBGCA10305-15; Gen-Bank： KJ710626), 利用Primer Premier 5.0設(shè)計PCR引物(COI-F： 5′-TATTTAGTATTCGGT GCCTG-3′; COI-R： 5′-TGCTACTTCTCGTTTGGC-3′), 送至武漢擎科生物技術(shù)公司合成; 以實驗魚DNA為模板, PCR擴增目的基因(COⅠ), 并送至武漢昆泰銳生物公司測序。PCR反應(yīng)產(chǎn)物測序后獲得實驗魚的COⅠ基因序列1304 bp, 與NCBI數(shù)據(jù)庫中已有的刀鱭COⅠ基因序列匹配度高達99%。結(jié)合捕獲地點和形態(tài)學(xué)特征可確定實驗魚為刀鱭。

1.3 整體骨骼染色方法

骨骼染色方法在白鳳熙[15]染色方法的基礎(chǔ)上略有改動, 具體方法如下： (1)無水乙醇脫水固定1周;(2)將標本轉(zhuǎn)移至2% KOH和3% H2O2的混合溶液中漂白3h; (3)將漂白的標本轉(zhuǎn)移至2% KOH溶液中透明; (4)3h后去除鱗片和內(nèi)臟, 繼續(xù)透明(透明時間以魚體隱約半透明為佳, 約6h); (5)經(jīng)透明的標本轉(zhuǎn)移至新的茜素紅染色液(1 g茜素紅溶于100 mL 1%KOH溶液中配制成染色液), 染色時間約6h; (6)染好色的標本依次在20%、50%和100%甘油進行梯度透明。最后對染色結(jié)果用數(shù)碼相機(佳能IXUS170)進行拍照觀察。

1.4 肌間骨數(shù)目、形態(tài)的觀察和測定

實驗魚經(jīng)紗布擦干魚體后進行體重與體長的測量。然后用紗布將整條魚包裹好, 置于沸水中煮10—15min, 取出, 待其自然冷卻后去除紗布, 用鑷子小心剝?nèi)テつw和肌肉, 根據(jù)刀鱭染色結(jié)果來挑取肌間刺, 并依次從前往后排列, 然后用數(shù)碼相機(佳能IXUS170)拍照, 并用游標卡尺(廣陸0—200, 精度0.01 mm)測量肌間骨長度。

1.5 肌間骨組織學(xué)觀察

取刀鱭髓弓小骨、脈弓小骨、背部上方和腹部下方的肌間骨樣品(包含骨組織周圍的結(jié)締組織)于4%多聚甲醛固定, 并進行后續(xù)的組織學(xué)分析。固定后的樣品于雙蒸水中漂洗后轉(zhuǎn)于EDTA脫鈣液(谷歌生物公司)中進行脫鈣處理, 在室溫下肌間骨脫鈣12h; 脫鈣完成后將樣品進行一系列脫水處理后用石蠟進行組織包埋, 并進行連續(xù)切片(5 μm);將切片于二甲苯中脫蠟透明、梯度酒精復(fù)水后將其分成兩份, 分別進行茜素紅染色和阿利新藍染色。其中茜素紅染色過程為： 將切片放于茜素紅染液中浸染5min, 自來水洗去切片浮色后轉(zhuǎn)置于60℃烘箱烘片30min, 烘片結(jié)束后于二甲苯透明, 最后中性樹脂封片; 阿利新藍染色過程為： 阿利新藍染液中浸染15min, 置于水中洗去浮色后轉(zhuǎn)置于核固紅復(fù)染5min, 依次對切片進行水洗、二甲苯透明處理, 最后用中性樹脂封片。

2 結(jié)果

2.1 肌間骨形態(tài)及分布

對刀鱭和短頜鱭整體骨骼染色結(jié)果觀察發(fā)現(xiàn),刀鱭和短頜鱭不僅有髓弓小骨、脈弓小骨和椎體小骨, 在其背部上方和腹部下方也存在肌間骨, 分別存在于背部上方和腹部下方肌膈的皺褶部(圖1)。解剖后觀察顯示刀鱭肌間骨的形態(tài)有“1”形、“卜”形、“y”形、一端多叉形和“(”形5種類型。髓弓小骨和脈弓小骨的形態(tài)較復(fù)雜, 主要有“1”形、“y”形、“卜”形, 少量“(”形和“一端多叉”形(圖2); 椎體小骨的形態(tài)僅有“1”形; 背部上方肌間骨形態(tài)簡單,多數(shù)為“(”形, 分布于背鰭下方至尾鰭處; 腹部下方肌間骨多為“1”形, 少數(shù)是“(”形, 分布于肛門至尾鰭處; 背部上方和腹部下方肌間骨較其他部位的肌間骨短而細(圖2)。

2.2 肌間骨的數(shù)目和長度

刀鱭的肌間骨的數(shù)目見表1。個體肌間骨總數(shù)范圍為492—543, 平均為521; 左側(cè)肌間骨范圍為233—274, 平均為256; 右側(cè)肌間骨范圍為239—301, 平均為265; 左右兩側(cè)肌間骨數(shù)目差異不顯著(P＞0.05)。背部上方肌間骨、椎體小骨、腹部下方肌間骨與髓弓小骨和脈弓小骨在數(shù)目上存在顯著差異(P＜0.05), 背部上方肌間骨、椎體小骨、腹部下方肌間骨三者之間數(shù)目差異顯著(P＜0.05), 髓弓小骨與脈弓小骨數(shù)目差異不顯著(P＞0.05)。

刀鱭各種類型肌間骨的長度如表2所示。背部上方肌間骨的長度為(1.44±0.16) cm; 髓弓小骨的長度為(2.09±0.24) cm; 椎體小骨的長度為(1.02±0.17) cm;脈弓小骨的長度為(2.13±0.19) cm; 腹部下方肌間骨長度為(1.08±0.12) cm。髓弓小骨和脈弓小骨的長度顯著長于背部上方肌間骨(P＜0.05)和腹部下方肌間骨(P＜0.01), 背部上方肌間骨的長度顯著長于椎體小骨和腹部下方肌間骨(P＜0.05)。不同部位肌間骨長度相關(guān)性分析結(jié)果顯示背部上方肌間骨的長度與腹部下方肌間骨(r=0.744)和髓弓小骨(r=0.762)呈顯著正相關(guān)(P＜0.05), 髓弓小骨的長度與腹部下方肌間骨長度的相關(guān)性極顯著(P＜0.01), 其他部位的肌間骨之間沒有顯著的相關(guān)性(表3)。此外, 不同部位的肌間骨與個體體長和體重也存在一定的相關(guān)性分析(表4), 其中體長與脈弓小骨(r=0.967)長度存在極顯著相關(guān)性(P＜0.01), 體重與脈弓小骨(r=0.742)的相關(guān)性顯著(P＜0.05), 與其他部位肌間骨長度沒有顯著的相關(guān)性。

圖1 刀鱭和短頜鱭整體骨骼染色肌間骨結(jié)果圖Fig. 1 Whole-mount staining of skeleton for intermuscular bones in C. nasus and C. brachygnathus

圖2 刀鱭右側(cè)肌間骨形態(tài)圖Fig. 2 The morphology of IBs in C. nasus

表1 刀鱭肌間骨的數(shù)目Tab. 1 The number of IBs in C. nasus

表2 刀鱭肌間骨的長度Tab. 2 The length of IBs in C. nasus

2.3 組織學(xué)結(jié)構(gòu)

為了解刀鱭不同部位肌間骨(椎體小骨除外)的組織學(xué)結(jié)構(gòu)及其差異, 本研究采用茜素紅與阿利新藍兩種染色方法分別對其切片組織進行染色分析,茜素紅可使鈣化結(jié)節(jié)或硬骨組織染成紅色, 阿利新藍可使軟骨組織、結(jié)締組織染成藍色。染色結(jié)果顯示刀鱭的背部上方肌間骨(圖版Ⅰ-1—4)、髓弓小骨(圖版Ⅰ-5—8)、脈弓小骨(圖版Ⅰ-9—12)和腹部下方肌間骨(圖版Ⅰ-13—16)均被茜素紅染成紅色, 而阿利新藍未使肌間骨組織著色, 但其四周結(jié)締組織被染色為藍色, 表明各種類型的肌間骨均為鈣化的硬骨組織。肌間骨外周結(jié)締組織染色結(jié)果表明在髓弓小骨和脈弓小骨中, 每根肌間骨并不是獨立存在的, 而是由肌膈等結(jié)締組織連接在一起,形成一個網(wǎng)狀的結(jié)構(gòu)(圖版Ⅰ-7、11); 在背部上方肌間骨(圖版Ⅰ-3)和腹部下方肌間骨(圖版Ⅰ-15)中,各肌間骨之間未發(fā)現(xiàn)明顯互相連接的結(jié)締組織。

3 討論

Patterson和Johnson[5]根據(jù)魚類肌間骨附著的部位把其分為三類, 包括髓弓小骨、椎體小骨和脈弓小骨。本研究以刀鱭為主要的研究對象, 魚體解剖和整體骨骼染色結(jié)果都顯示, 刀鱭除了包含Patterson和Johnson[5]描述的三種肌間骨以外, 還有另外兩種在國內(nèi)研究中未被提起的背部上方和腹部下方肌間骨的存在。Chapman[16]在鯡科魚類中也發(fā)現(xiàn)有兩類額外的獨立肌間骨, 背部分布于除前5—6個肌節(jié)之外的肌節(jié)中, 腹部分布于從肛門至尾鰭基部的肌節(jié)中, 這兩類肌間骨都存在于肌膈的皺褶部, 將其統(tǒng)一命名為肌骨桿(Myorhabdoi)。本研究在刀鱭和短頜鱭中發(fā)現(xiàn)的背部上方肌間骨和腹部下方肌間骨與Chapman[16]描述的肌骨桿位置相似, 因此將本研究中發(fā)現(xiàn)的背部上方肌間骨和腹部下方肌間骨定義為背上肌骨桿和腹下肌骨桿。Chapman[16]認為這種類型的肌間骨是鯡科魚類的典型特征, 鳀科魚類沒有, 這與本研究發(fā)現(xiàn)的鯡形目鳀科的刀鱭相悖。呂耀平等[9]報道的刀鱭肌間骨只有三種類型, 未提及背上和腹下肌骨桿的存在,因此其報道的肌間骨數(shù)目僅有221根, 較本研究的521根少很多。本研究發(fā)現(xiàn)的刀鱭椎體小骨的平均數(shù)目為42根, 這與蔣燕等[17]的44根接近。刀鱭背上和腹下肌間骨類型(統(tǒng)稱肌骨桿)的發(fā)現(xiàn)豐富了國內(nèi)魚類肌間骨類型的基礎(chǔ)資料。

表3 刀鱭肌間骨數(shù)目和長度的相關(guān)性分析Tab. 3 The correlation between IB’s number and IB’s length in C. nasus from different parts

表4 刀鱭體長體重與肌間骨長度的相關(guān)性分析Tab. 4 The correlation of IBs’ length with body length and body weight in C. nasus from different parts

關(guān)于魚類肌間骨的形態(tài)類型, 蘇錦祥等[18]曾把鰱的肌間骨分為4種類型： “1”形、“卜”形、“y”形和樹枝形。根據(jù)低等真骨魚類肌間骨形態(tài)的復(fù)雜程度, 呂耀平等[9]為便于分析各種形態(tài)肌間骨演化規(guī)律, 將其歸納為7種類型(“ I”形、“卜”形、“Y”形、一端多叉形、兩端兩分叉形、兩端多叉形、樹枝形)。萬世明等[3]將團頭魴肌間骨形態(tài)分為6種形態(tài),分別是“1”形、“卜”形、“y”形、一端多叉形、兩端多叉形、“(”形。董在杰等[7]通過對幾種常見的鯉科魚類肌間骨的研究把其主要歸于兩類： “1”形和“y”形, 其他形態(tài)均是在其基礎(chǔ)上分化的。本文采用萬世明等[3]的分類方法, 把刀鱭肌間骨分為從最簡單的“1”形到最復(fù)雜的一端多叉形在內(nèi)的5種形態(tài)。刀鱭肌間骨形態(tài)的分類研究已有文獻報道, 但可能由于采取的分類標準不同, 本文對刀鱭肌間骨的形態(tài)比呂耀平等[9]的分類多出一種“(”形。刀鱭的椎體小骨形態(tài)相較于海鰻(Muraenesox cinereus)和鰣(Tenualosa reevesii)簡單, 僅有“1”形, 與蔣燕等[17]的研究一致。刀鱭肌間骨解剖結(jié)果可以看出靠近尾部的肌間骨形態(tài)結(jié)構(gòu)較為簡單, 中間部位的形態(tài)較為復(fù)雜且較兩端長, 這可能與魚體不同部位的形態(tài)結(jié)構(gòu)及機體自身的運動相關(guān)。

肌間骨是由肌隔結(jié)締組織骨化而成的硬骨。本研究各種類型的肌間骨均被茜素紅染成紅色, 而阿利新藍未使肌間骨組織著色, 但其四周結(jié)締組織被染色為藍色, 組織學(xué)結(jié)果證實了刀鱭各種類型的肌間骨均為鈣化的硬骨組織。哺乳動物肌膈分化的相關(guān)研究表明, 肌膈中的間充質(zhì)干細胞可以分化為肌腱源性干細胞, 而肌腱源性干細胞可以分化為成骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、成纖維細胞和肌腱細胞[19]。因此, 肌間骨可能是由間充質(zhì)干細胞首先分化為肌腱源性干細胞, 之后在肌腱源性干細胞分化相關(guān)基因的作用下分化為成骨細胞, 進而形成骨細胞, 最終形成肌間骨, 但其具體的形成機制還有待進一步研究。

圖版Ⅰ 刀鱭背部上方肌間骨(1—4)、髓弓小骨(5—8)、脈弓小骨(9—12)、腹部下方肌間骨(13—16)組織的茜素紅(1, 2, 5, 6, 9, 10,13, 14)和阿利新藍(3, 4, 7, 8, 11, 12, 15, 16)染色結(jié)果PlateⅠ Histological analysis of different IBs in C. nasus, transverse sections (1-16). transverse sections, stained with Alizarin red (1, 2, 5,6, 9, 10, 13, 14) and Alcian blue (3, 4, 7, 8, 11, 12, 15, 16), showing the dorsal IBs (1—4), epineurals (5—8), epipleurals (9—12), ventral IBs (13—16) of C. nasus黑色圓圈為各類肌間骨所在位置, 偶數(shù)字母(2, 4, 6, 8, 10, 12, 14 and 16)圖片為對應(yīng)奇數(shù)字母(1, 3, 5, 7, 9, 11, 13 and 15)圖片中黑色實心圓圈部位的放大圖The IBs indicated by black circle in odd number (1, 3, 5, 7, 9, 11, 13 and 15) were magnified in even number (2, 4, 6, 8, 10, 12, 14 and 16)