姚 慧 張 歡 王松波 耿 紅

(1. 中南民族大學生命科學學院, 武陵山區(qū)特色資源植物種質(zhì)保護與利用湖北省重點實驗室, 武漢 430074;2. 中國科學院水生生物研究所, 武漢 430072; 3. 中南民族大學資源與環(huán)境學院, 武漢 430074)

在水生態(tài)系統(tǒng)中, 浮游動物起著承上啟下的樞紐作用[1]。輪蟲是浮游動物的一大類群, 其豐度和群落組成是反應(yīng)水質(zhì)的一個重要指標[2]。萼花臂尾輪蟲(Brachionus calyciflorus)是魚類開口餌料, 也是浮游植物的牧食者[3], 因繁殖快、世代周期短、易培養(yǎng)等特點被作為生態(tài)毒理學研究的受試動物[4]。在自然環(huán)境中萼花臂尾輪蟲種群數(shù)量龐大, 其種群動態(tài)受多種生物因子(如捕食、競爭、食物)和非生物因子(如光照、溫度、pH等)的影響, 其中食物種類、濃度、質(zhì)量以及培養(yǎng)溫度是影響輪蟲生長繁殖及其種群動態(tài)重要的生態(tài)因子。關(guān)于食物種類和濃度對輪蟲生長繁殖的影響已有大量的研究[5,6],而食物質(zhì)量對輪蟲生長繁殖的影響研究相對較少,且研究結(jié)果N和P限制對萼花臂尾輪蟲的影響具有爭議[7,8]。

在藍藻水華發(fā)生時, 浮游植物群落中95%是由微囊藻組成, 結(jié)果導致浮游動物群落豐度大量減少[9]。銅綠微囊藻(Microcystis aeruginosa)是最為常見的水華藍藻[10], 有毒和無毒銅綠微囊藻共存于自然水體。大量的研究表明有毒微囊藻產(chǎn)生的內(nèi)源性毒素可引起魚類和無脊椎動物中毒死亡[11]。輪蟲作為濾食性的浮游生物, 微囊藻也是其食物源之一,Rothhaupt[10]發(fā)現(xiàn)紅臂尾輪蟲(Brachionus rubens)攝取食物質(zhì)量低的有毒銅綠微囊藻時, 輪蟲種群存活率降低。Zhao等[12]和Huang等[13]的研究表明有毒微囊藻對輪蟲的生長影響是不利的。但是目前已有研究卻未能區(qū)分微囊藻對輪蟲種群的影響是毒性還是食物質(zhì)量。因此, 本研究的目的之一是探討微囊藻毒性和食物質(zhì)量對萼花臂尾輪蟲的影響。

水體溫度直接影響生物有機體的體溫, 體溫的高低又決定了浮游動物新陳代謝、生長、發(fā)育、繁殖和行為等, 從而影響浮游動物的豐度[14,15]。盡管大量的研究表明溫度對輪蟲的個體大小、生長以及生活史特征有顯著的影響[16,17], 但是很少有研究關(guān)注溫度與其他因子(例如食物質(zhì)量、產(chǎn)毒藍藻)的交互作用對輪蟲生長繁殖影響。且少有的關(guān)于溫度和食物濃度對輪蟲種群增長及繁殖的研究結(jié)果存在不一致性[18,19]。為了分析不同溫度下銅綠微囊藻對萼花臂尾輪蟲的影響, 我們研究了有毒銅綠微囊藻濃度、溫度以及兩者交互作用對輪蟲的影響。旨在豐富浮游動物與藍藻關(guān)系, 為以后的研究提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 輪蟲的來源及培養(yǎng)

實驗選取的萼花臂尾輪蟲采自湖北省武漢市南湖水體, 在實驗室培養(yǎng)半年以上。輪蟲置于(25±1)℃光照培養(yǎng)箱100 mL燒杯中培養(yǎng), 光照強度為2200 lx, 光照周期為12L： 12D。培養(yǎng)輪蟲所用培養(yǎng)基為EPA培養(yǎng)基(NaHCO396 mg/L; CaSO460 mg/L; MgSO460 mg/L; KCl 4 mg/L)[20]。

1.2 藻種來源及培養(yǎng)

輪蟲培養(yǎng)食物為蛋白核小球藻(Chlorella pyrenoidosa), 有毒銅綠微囊藻(Microcystin-producingM. aeruginosaFACHB905)和無毒銅綠微囊藻(Microcystin-freeM. aeruginosaFACHB526), 均由中國科學院水生生物研究所藻種庫提供。藻類培養(yǎng)條件為于(25±1)℃光照培養(yǎng)箱250 mL錐形瓶中進行培養(yǎng), 光照強度為2500 lx, 周期為18L： 6D。藻類所用培養(yǎng)基為BG11[21], 121℃高壓滅菌20min后冷卻至室溫, 在無菌環(huán)境下接種。取對數(shù)生長期的綠藻和藍藻進行離心(7000 r/min, 10min), 濃縮富集后放置于4℃冰箱中備用。實驗前, 在顯微鏡下計數(shù)濃縮過的綠藻和藍藻, 并用EPA培養(yǎng)基稀釋到實驗所需濃度。

1.3 實驗設(shè)計

本研究首先探討在相同實驗條件下, 兩種不同品系的銅綠微囊藻(有毒和無毒)對萼花臂尾輪蟲生活史的影響; 隨后開展不同溫度和不同濃度的有毒銅綠微囊藻對萼花臂尾輪蟲生活史的影響?？傆袡C碳總氮分析儀(Multi N/C 3100)測藻類碳含量, 結(jié)果如下： 蛋白核小球藻： 0.9×10-8mg/cell; 無毒銅綠微囊藻： 0.545×10-8mg/cell; 有毒銅綠微囊藻： 0.98×10-8mg/cell。

實驗一： 研究兩個品系銅綠微囊藻(有毒與無毒)在不同濃度下對萼花臂尾輪蟲生活史的影響,在25℃溫度下, 分別用100%無毒銅綠微囊藻+100%蛋白核小球藻(對照組碳含量為4.50 μg C/mL, 處理組1碳含量為4.55 μg C/mL, 處理組2碳含量為4.77 μg C/mL, 處理組3碳含量為5.05 μg C/mL, 處理組4碳含量為7.23 μg C/mL)和100%有毒銅綠微囊藻+100%蛋白核小球藻(對照組碳含量為4.50 μg C/mL, 處理組1碳含量為4.60 μg C/mL, 處理組2碳含量為4.99 μg C/mL, 處理組3碳含量為5.48 μg C/mL, 處理組4碳含量為9.40 μg C/mL)的組合作為食物, 其中蛋白核小球藻濃度為5×105cells/mL(碳含量為4.50 μg C/mL), 銅綠微囊藻濃度有5個梯度, 共10組, 如表1所示, 以萼花臂尾輪蟲作為受試生物進行生命表實驗。

實驗二： 研究不同溫度和有毒銅綠微囊藻濃度以及它們的交互作用對萼花臂尾輪蟲生活史的影響, 實驗設(shè)計在5個溫度梯度下進行, 食物是有毒銅綠微囊藻和蛋白核小球藻的組合, 其中小球藻濃度為5×105cells/mL(碳含量為4.50 μg C/mL), 銅綠微囊藻有5個濃度梯度(對照組碳含量為4.50 μg C/mL,處理組1碳含量為4.60 μg C/mL, 處理組2碳含量為4.99 μg C/mL, 處理組3碳含量為5.48 μg C/mL, 處理組4碳含量為9.40 μg C/mL), 實驗共25組, 如表2所示。

1.4 動態(tài)生命表實驗

實驗一： 正式實驗前, 將萼花臂尾輪蟲置于25℃光照培養(yǎng)箱中進行一周預培養(yǎng)實驗, 取帶卵的非混交雌體, 放置燒杯中進行培養(yǎng), 再取孵出的非混交后代(年齡≤6h)若干, 分別放置于24孔板中進行實驗, 實驗所用的食物濃度如表1所示。每孔放一只輪蟲。每12h觀察一次, 記錄輪蟲帶卵數(shù)量、母體存活數(shù)量以及新生幼體數(shù), 并將新生幼體從培養(yǎng)體系中移除, 每24h更換一次食物和EPA培養(yǎng)液,實驗至全部母體死亡為止。

表1 實驗一中不同處理組食物情況(濃度單位cells/mL)Tab. 1 Food concentration of different treatments in experiment 1(cells/mL)

實驗二： 實驗開始前, 將萼花臂尾輪蟲分別置于15℃、20℃、25℃、30℃和35℃光照培養(yǎng)箱中進行1周預培養(yǎng)實驗, 其他操作同實驗一, 實驗所用的食物濃度如表2所示。

表2 實驗二中不同處理組食物情況(濃度單位cells/mL)Tab. 2 Food concentration of different treatments in experiment 2 (cells/mL)

1.5 實驗參數(shù)與統(tǒng)計分析

輪蟲生活史參數(shù)計算方法參照Hu和Xi[22]：

種群內(nèi)稟增長率rm： 種群在特定實驗條件下的最大增長率; 根據(jù)方程rm=lnR0/T在粗略計算的基礎(chǔ)上, 再根據(jù)方程在Excel中試算求得種群內(nèi)稟增長率的精確值。其中l(wèi)x代表存活率,mx代表繁殖率。

實驗一中的銅綠微囊藻品系和濃度及實驗二中銅綠微囊藻濃度和培養(yǎng)溫度對萼花臂尾輪蟲3個生活史參數(shù)的影響均采用非參數(shù)雙因素方差分析(Scheirer-Ray-Hare test)進行檢驗。該數(shù)據(jù)分析在R軟件中完成[23]。

2 結(jié)果

2.1 兩種品系銅綠微囊藻對萼花臂尾輪蟲生命表參數(shù)的影響

結(jié)果分析得出隨著無毒銅綠微囊藻濃度升高,輪蟲生活史參數(shù)凈生殖率(R0)下降(圖1), 世代時間(T)先上升后下降(圖2), 內(nèi)稟增長率(rm)呈現(xiàn)下降趨勢(圖3)。與對照組相比較, 當無毒銅綠微囊藻濃度為104cells/mL時, 輪蟲凈生殖率上升19.9%, 世代時間上升13.6%, 內(nèi)稟增長率上升6.1%, 無毒銅綠微囊藻濃度為5×105cells/mL時, 輪蟲內(nèi)稟增長率為負值。

圖1 五種不同濃度的有毒和無毒銅綠微囊藻下萼花臂尾輪蟲的凈生殖率Fig. 1 Net reproductive rate of Brachionus calyciflorus at five different concentrations of microcystin-producing and microcystinfree Microcystis aeruginosa

圖2 五種不同濃度的有毒和無毒銅綠微囊藻下萼花臂尾輪蟲的世代時間Fig. 2 Generation time of Brachionus calyciflorus at five different concentrations of microcystin-producing and microcystinfree Microcystis aeruginosa

有毒銅綠微囊藻濃度升高, 輪蟲生活史參數(shù)凈生殖率顯著下降, 世代時間縮短, 內(nèi)稟增長率明顯下降。并且有毒銅綠微囊藻濃度升高, 微囊藻毒性會增強, 輪蟲攝食微囊藻機率變大, 食物品質(zhì)下降,有毒銅綠微囊藻濃度為5×104和1×105cells/mL輪蟲內(nèi)稟增長率為負值, 而銅綠微囊藻濃度為5×105cells/mL內(nèi)稟增長率和世代時間無法計算。與對照組相比較, 當銅綠微囊藻濃度為1×105cells/mL時, 在無毒銅綠微囊藻中輪蟲凈生殖率下降9.1%, 有毒銅綠微囊藻中下降86.5%; 在無毒銅綠微囊藻中輪蟲世代時間下降9.2%, 而在有毒銅綠微囊藻中下降48.9%,無毒銅綠微囊藻中輪蟲內(nèi)稟增長率下降2.0%, 而在有毒銅綠微囊藻中下降303.2%。方差分析結(jié)果顯示銅綠微囊藻毒性與食物濃度對輪蟲凈生殖率和內(nèi)稟增長率的影響具有顯著性交互作用(表3)。

2.2 溫度與有毒銅綠微囊藻濃度對萼花臂尾輪蟲生命表參數(shù)的影響

在五個溫度下不同濃度的有毒銅綠微囊藻對萼花臂尾輪蟲凈生殖率的影響的研究結(jié)果顯示, 在不添加有毒銅綠微囊藻的情況下, 即有毒銅綠微囊藻濃度為0時, 隨著溫度升高, 輪蟲凈生殖率總體呈上升趨勢(圖4), 與最低溫15℃相比較, 20℃凈生殖率上升81.6%, 25℃凈生殖率上升77.7%, 30℃凈生殖率上升80.0%, 溫度為35℃時, 凈生殖率最高。因為在高溫條件下, 輪蟲新陳代謝加速, 生長繁殖變快。處理組則隨溫度和有毒銅綠微囊藻濃度變化而有所不同, 有毒微囊藻濃度為1×104、5×104和1×105cells/mL, 隨著溫度升高凈生殖率也呈現(xiàn)出上升趨勢, 但是在高濃度(5×105cells/mL)下輪蟲的凈生殖率基本為0, 在高溫(30℃和35℃)作用下高濃度有毒銅綠微囊藻抑制輪蟲生長繁殖的作用更加顯著。圖5實驗結(jié)果顯示, 世代時間隨著溫度的升高整體呈下降趨勢, 隨著有毒銅綠微囊藻濃度增加,世代時間逐漸下降。

圖3 五種不同濃度的有毒和無毒銅綠微囊藻下萼花臂尾輪蟲的內(nèi)稟增長率Fig. 3 Intrinsic growth rate of Brachionus calyciflorus at five different concentrations of microcystin-producing and microcystinfree Microcystis aeruginosa

表3 銅綠微囊藻毒性和濃度對輪蟲生活史參數(shù)R0及rm影響的非參數(shù)雙因素方差分析的結(jié)果Tab. 3 Effects of toxicity and concentrations of Microcystis aeruginosa on the R0 and rm of Brachionus calyciflorus by the Scheirer-Ray-Hare test

圖4 五個溫度、不同濃度的有毒銅綠微囊藻下萼花臂尾輪蟲的凈生殖率變化情況Fig. 4 Net reproductive rate of Brachionus calyciflorus at five temperatures and different concentrations of microcystin-producing Microcystis aeruginosa

圖5 五個溫度、不同濃度的有毒銅綠微囊藻下萼花臂尾輪蟲的世代時間Fig. 5 Generation time of Brachionus calyciflorus at five temperatures and different concentrations of microcystinproducing Microcystis aeruginosa

圖6 五個溫度、不同濃度的有毒銅綠微囊藻下萼花臂尾輪蟲的內(nèi)稟增長率Fig. 6 Intrinsic growth rate of Brachionus calyciflorus at five temperatures and different concentrations of microcystinproducing Microcystis aeruginosa

溫度與有毒銅綠微囊藻濃度對萼花臂尾輪蟲內(nèi)稟增長率的影響的實驗結(jié)果表明, 溫度升高, 內(nèi)稟增長率變化顯著(圖6和表4)。在15℃下內(nèi)稟增長率為負值說明低溫環(huán)境下不利于輪蟲的生長繁殖。有毒銅綠微囊藻低濃度(1×104cells/mL)時, 輪蟲種群的內(nèi)稟增長率隨著溫度的升高而增加。與對照組相比, 低濃度微囊藻對輪蟲有抑制作用, 但是這種抑制作用并不總是隨溫度的升高而加強。銅綠微囊藻在較高濃度(1×105cells/mL)時, 內(nèi)稟增長率為負值, 且從20℃、25℃和30℃得出溫度升高內(nèi)稟增長率變化幅度變大, 所以隨著溫度升高有毒銅綠微囊藻對萼花臂尾輪蟲抑制作用更加明顯。有毒銅綠微囊藻高濃度(5×105cells/mL)下輪蟲種群的內(nèi)稟增長率有些組無法計算, 因為輪蟲個體只存活了2d, 沒有產(chǎn)子代。

經(jīng)低溫或高溫脅迫后的輪蟲生活史參數(shù)均變化顯著, 且有毒銅綠微囊藻濃度升高輪蟲生活史參數(shù)顯著下降。方差分析結(jié)果表明濃度和溫度的交互作用對輪蟲種群的凈生殖率和內(nèi)稟增長率變化極顯著(F=28.00,P＜0.01;F=33.94,P＜0.01; 表4), 實驗結(jié)果表明在高溫30℃和35℃環(huán)境下有毒銅綠微囊藻濃度升高對輪蟲抑制作用更加明顯, 有毒銅綠微囊藻對輪蟲的抑制作用隨著溫度的升高而加強。

表4 有毒銅綠微囊藻濃度和溫度對輪蟲生活史參數(shù)R0及rm影響的非參數(shù)雙因素方差分析的結(jié)果Tab. 4 Effects of temperatures and concentrations of microcystinproducing Microcystis aeruginosa on the R0 and rm of Brachionus calyciflorus based on the Scheirer-Ray-Hare test

3 討論

無毒銅綠微囊藻在低濃度下對萼花臂尾輪蟲的生長和繁殖有促進作用, 表明無毒銅綠微囊藻可作為輪蟲食物來源, 無毒銅綠微囊藻缺乏脂肪酸等營養(yǎng)物質(zhì), 且食物質(zhì)量沒有蛋白核小球藻食物質(zhì)量高, 高濃度下輪蟲攝食無毒銅綠微囊藻機率變大,整體食物品質(zhì)下降, 臂尾輪蟲是濾食性動物, 無法根據(jù)顆粒物的質(zhì)量來選擇食物[24], 只能根據(jù)顆粒物的大小來選擇食物, 輪蟲不可避免地攝食銅綠微囊藻[10], 所以無毒銅綠微囊藻高濃度下對輪蟲有抑制作用。與無毒銅綠微囊藻相比, 有毒銅綠微囊藻對輪蟲種群的抑制作用更加明顯, 微囊藻濃度升高凈生殖率和內(nèi)稟增長率顯著下降, 表明有毒銅綠微囊藻不利于輪蟲的生長繁殖。有毒銅綠微囊藻需要考慮食物質(zhì)量和微囊藻毒素兩個方面, 以微囊藻毒素-LR為例, MC-LR能夠在浮游動物體內(nèi)產(chǎn)生生物富集作用[25]。微囊藻與綠藻混合作為輪蟲食物, 微囊藻不能被認為是輪蟲致命的有毒物質(zhì), 盡管在細胞中存在MC, 但它僅是一個營養(yǎng)不足的食物來源,但是當微囊藻作為輪蟲唯一的食物, 微囊藻不支持輪蟲生長, 高濃度時甚至在2d內(nèi)全部死亡[26,27], 這與本實驗中高濃度下輪蟲只存活兩天結(jié)果一致。不同種類的輪蟲也會有類似的結(jié)果, 褶皺臂尾輪蟲(Brachionus plicatilis)在銅綠微囊藻(PCC7820)低濃度(1×104cells/mL)時, 能夠從中攝取一定營養(yǎng)以供其生長繁殖, 在銅綠微囊藻高濃度(1×106cells/mL)時, 抑制輪蟲種群密度的增長[28]。不僅是生活史參數(shù)會受銅綠微囊藻的影響, 輪蟲的表型和攝食率都會受到微囊藻的影響。有研究發(fā)現(xiàn)高濃度的MCLR對低溫下萼花臂尾輪蟲的形態(tài)學特征產(chǎn)生顯著抑制作用并且輪蟲會通過改變表型特征抵御不良環(huán)境[29,30], 還有研究表明在無MC-LR和低MC-LR濃度組中, 溫度升高會刺激萼花臂尾輪蟲的攝食行為[15]。不論無毒還是有毒銅綠微囊藻, 對于萼花臂尾輪蟲都是質(zhì)量不佳的食物, 且有毒銅綠微囊藻還會產(chǎn)生毒素抑制萼花臂尾輪蟲的生長繁殖及其表型特征。

有毒銅綠微囊藻對輪蟲有抑制作用, 溫度和微囊藻濃度以及二者之間的交互作用對輪蟲生活史參數(shù)凈生殖率和內(nèi)稟增長率均有顯著性影響, 銅綠微囊藻濃度升高對輪蟲的抑制作用加強, 且這種抑制作用隨著溫度的升高而加劇, 這與Zhang和Geng[31]的研究結(jié)果一致。溫度是影響每一個生命周期中由單個雌性產(chǎn)生后代總數(shù)的一個因素, 且高溫下的繁殖力高于低溫下的繁殖力[24], 同時溫度的升高提高輪蟲對微囊藻毒素的吸收能力[32], 在本實驗中溫度能夠顯著影響輪蟲生活史參數(shù)凈生殖率和內(nèi)稟增長率。溫度加強有毒銅綠微囊藻對輪蟲的抑制作用部分是因為溫度升高加劇藻類的磷限制, 有研究結(jié)果表明藻類的氮磷限制都會抑制輪蟲的生長速度, 磷限制會隨溫度的升高而增強[8]。溫度升高會導致微囊藻產(chǎn)生更高濃度的MC-LR并導致更高毒性的MC-LR變異比例增加, 從而加劇微囊藻對輪蟲生長繁殖的影響[33]。裂足臂尾輪蟲在3個食物密度下, 溫度對其凈生殖率均有顯著影響, 對其種群內(nèi)稟增長率均無顯著的影響[18]。輪蟲對微囊藻表現(xiàn)出不同的耐受性, 是由于輪蟲對微囊藻毒素的敏感性存在種間差異造成的[32]。溫度升高能夠加強有毒銅綠微囊藻對萼花臂尾輪蟲的抑制作用。

綜上, 銅綠微囊藻毒性, 銅綠微囊藻濃度, 溫度以及毒性×濃度與溫度×濃度之間的相互作用顯著影響了萼花臂尾輪蟲的生活史參數(shù)凈生殖率和內(nèi)稟增長率。藻類的營養(yǎng)限制比溫度效應(yīng)更重要[7], 本實驗通過無毒微囊藻與有毒銅綠微囊藻在不同濃度下各生活史參數(shù)整體比較, 得出食物質(zhì)量與微囊藻毒性對輪蟲均有影響。在以后的研究中應(yīng)結(jié)合野外實驗, 利用化學計量學方法探討影響輪蟲生長繁殖的主要因素, 重點分析各種因素之間的相互聯(lián)系。