王 茜 劉文秀 高 菲 王 蘭

(山西大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 太原 030006)

枝角類是生態(tài)毒理學(xué)中常用的化學(xué)物質(zhì)生態(tài)毒性評(píng)價(jià)模型之一[1]。多刺裸腹溞(Moina macrocopa)作為常見的枝角類, 是除大型溞(Daphnia magna)和蚤狀溞(Daphnia pulex)之外的又一理想材料, 是山西省水體中的優(yōu)勢(shì)物種, 全身透明、繁殖率高、對(duì)農(nóng)藥等化學(xué)品具有高的敏感性[2], 常被用于水環(huán)境的生物監(jiān)測(cè)。目前關(guān)于多刺裸腹溞分子生物學(xué)方面的研究較少, 相關(guān)分子生物學(xué)信息匱乏,限制了外源化學(xué)物質(zhì)對(duì)其毒性效應(yīng)的分子機(jī)制的研究。

實(shí)時(shí)定量PCR(Quantitative Real-Time PCR,qRT-PCR)是在傳統(tǒng)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase chain reaction, PCR)的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一項(xiàng)新的核酸定量技術(shù)[3], 操作快速靈敏、具有特異性強(qiáng)、定量準(zhǔn)確、檢驗(yàn)范圍廣等特點(diǎn), 隨著技術(shù)的不斷成熟, 廣泛應(yīng)用于多個(gè)領(lǐng)域[4]。qRT-PCR主要有絕對(duì)定量和相對(duì)定量?jī)煞N方法, 其中相對(duì)定量不需要已知的標(biāo)準(zhǔn)品, 相對(duì)簡(jiǎn)便因而被大量采用[5], 但前提是需要穩(wěn)定的內(nèi)參基因。

內(nèi)參基因是指在對(duì)某一個(gè)目的基因進(jìn)行定量研究時(shí), 在實(shí)驗(yàn)條件下待測(cè)樣品中表達(dá)相對(duì)恒定的一類基因, 其作用是校正目的基因的定量過程[6]。常用的內(nèi)參基因大多是管家基因(House-keeping gene), 包括編碼組蛋白基因、線粒體蛋白基因、編碼核糖體蛋白基因、生物代謝途徑中各種關(guān)鍵酶的基因等, 如rRNA、β-actin、cyclophilin、hsp、gapdh、rpl13等[7]。這些管家基因大多參與了生物體基本代謝活動(dòng), 因而具有穩(wěn)定表達(dá)的特性[8]。但內(nèi)參基因并非在所有生理?xiàng)l件下都能穩(wěn)定表達(dá), 在特定實(shí)驗(yàn)條件或某些組織細(xì)胞中各基因的表達(dá)穩(wěn)定性有差異[9], 至今還未發(fā)現(xiàn)一個(gè)適合所有條件下基因表達(dá)分析的內(nèi)參基因[10]。鎘脅迫斑馬魚(Danio rerio)后,ef1a、rpl13a、gapdh和rplp2分別是在腎脾臟、肝臟、鰓和腸道中穩(wěn)定表達(dá)的內(nèi)參基因[11]?；【庖吆髷M穴青蟹(Scylla paramamosain)的血細(xì)胞選擇ef1a、UPQ作為內(nèi)參基因, 但其他組織選擇18S rRNA和ef1a作為內(nèi)參基因[12]。因此, 在進(jìn)行目的基因相對(duì)定量分析中, 不同的實(shí)驗(yàn)條件甚至同一實(shí)驗(yàn)條件不同組織都需要進(jìn)行內(nèi)參基因的篩選。目前對(duì)多刺裸腹溞進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR分析研究的報(bào)道較少[13], 有關(guān)內(nèi)參基因的信息缺乏。鑒于此, 本研究設(shè)計(jì)合成了多刺裸腹溞β-actin、16S rRNA和12S rRNA的特異性引物, 利用內(nèi)參基因表達(dá)水平(Ct值)[11,14]、GeNorm[15]、NormFinder[16]和BestKeeper[17]四種方法分析了苯酚脅迫下各基因的表達(dá)穩(wěn)定性, 從中篩選出最佳內(nèi)參基因, 為進(jìn)一步研究苯酚脅迫下多刺裸腹溞相關(guān)目的基因的表達(dá)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

多刺裸腹溞(Moina macrocopa)采自山西省太原市小店區(qū)北張村, 在本實(shí)驗(yàn)室經(jīng)過三代以上孤雌生殖培養(yǎng), 其敏感度達(dá)到GB/T 13266—91的要求[18]。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

苯酚處理及樣品采集選取健康狀況良好的一日齡幼溞, 分別接種到盛有不同濃度苯酚(0、0.25、0.75、1.25、1.75和2.25 mg/L)的燒杯中, 水溫控制在(25±1)℃, 光照周期為光：暗=16h：8h。培養(yǎng)期間不喂食。在苯酚染毒處理后, 將存活的多刺裸腹溞過濾、用DEPC水清洗、吸掉多余水分, 稱量0.1 g置于提前裝有1 mL Trizol的無RNA酶的EP管中, 于-80℃保存。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次, 每次2個(gè)平行。

總RNA提取和cDNA合成用Trizol法[19]提取總RNA, 經(jīng)凝膠電泳和分光光度計(jì)檢測(cè)總RNA的質(zhì)量。利用5×All-In-One RT MasterMix試劑盒(鎮(zhèn)江ABM公司提供)將總RNA合成cDNA并置于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

引物設(shè)計(jì)、內(nèi)參基因的擴(kuò)增及PCR產(chǎn)物純化從NCBI數(shù)據(jù)庫獲得多刺裸腹溞三個(gè)內(nèi)參基因β-actin、16S rRNA和12S rRNA的CDS序列, 并利用Primer 3軟件設(shè)計(jì)了特異性引物(表1)。以不同濃度苯酚處理樣品的cDNA等量混合物為模板,擴(kuò)增反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性3min, 94℃變性30s,60℃退火30s, 72℃延伸1min, 35個(gè)循環(huán), 72℃延伸8min。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物按照SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒(上海生工提供)方法進(jìn)行兩輪回收, 得到三個(gè)純化的PCR產(chǎn)物作為標(biāo)準(zhǔn)品, 用分光光度計(jì)檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)品濃度, 并送公司測(cè)序(上海生工)。

表1 候選內(nèi)參基因的引物序列Tab. 1 Primer sequences of candidate reference genes

實(shí)時(shí)定量PCR分析參照EvaGreen 2×qPCR MasterMix試劑盒(鎮(zhèn)江ABM公司提供)說明書,將純化的三個(gè)基因標(biāo)準(zhǔn)品分別稀釋101—107倍為標(biāo)準(zhǔn)溶液作為模板, 利用ABI 7500實(shí)時(shí)定量PCR系統(tǒng)對(duì)三個(gè)內(nèi)參基因進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR分析。反應(yīng)體系為15 μL, 反應(yīng)條件： 50℃ 2min, 94℃ 10min; 40個(gè)循環(huán)： 95℃ 15s, 60℃ 1min。根據(jù)循環(huán)Ct值和拷貝數(shù)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立： 通過標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度, 計(jì)算出拷貝數(shù)。

拷貝數(shù)/μL=6.02×1023(copies/mol)×模板濃度(g/μL)/平均分子量(g/mol)

其中： 平均分子量(MW g/mol)=堿基數(shù)(bp)×660 (D/bp)

以拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo),Ct值為縱坐標(biāo), 制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

以不同濃度苯酚脅迫下的多刺裸腹溞cDNA作為模板, 將三個(gè)內(nèi)參基因和目的基因蛻皮激素接受子3(Hormone receptor 3,HR3)按照以上方法實(shí)時(shí)定量PCR。HR3基因在多刺裸腹溞中的相對(duì)表達(dá)量(R)的計(jì)算公式如下：R=2-??Ct。

數(shù)據(jù)處理與分析利用瓊脂糖凝膠電泳技術(shù)對(duì)總RNA質(zhì)量和內(nèi)參基因目的片段進(jìn)行檢測(cè), 所得結(jié)果采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行單因素方差分析(One-Way-ANOVA), 采用Waller-Duncan進(jìn)行非參數(shù)檢驗(yàn), 呈現(xiàn)顯著性差異(P＜0.05)的整體數(shù)據(jù), 繼續(xù)采用Tukey HSD檢驗(yàn)兩組數(shù)據(jù)之間的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,所得結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差表示(Mean±SD)。GeNorm根據(jù)M(平均表達(dá)穩(wěn)定值)的大小進(jìn)行穩(wěn)定性比較,M值越小穩(wěn)定性越好[15]。NormFinder根據(jù)運(yùn)算出內(nèi)參基因S(穩(wěn)定性)分析內(nèi)參基因表達(dá)穩(wěn)定性,S值越小表示穩(wěn)定性越好[16]。BestKeeper用于比較內(nèi)參基因表達(dá)穩(wěn)定性和基因表達(dá)水平的軟件,Geo mean (幾何平均數(shù))、SD(標(biāo)準(zhǔn)變異系數(shù))越小穩(wěn)定性越好[17]。

2 結(jié)果

2.1 總RNA質(zhì)量檢測(cè)和內(nèi)參基因目的片段的擴(kuò)增

圖1顯示, 在不同濃度的苯酚處理后多刺裸腹溞總RNA樣品條帶清晰, 無降解, 28S rRNA與18S rRNA的亮度比值至少為1：1。定量檢測(cè)結(jié)果顯示各樣品A260/A280值均在2.0左右, 說明多刺裸腹溞總RNA較完整且純度高, 可以進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。用不同濃度苯酚處理后的樣品cDNA等量混合, 分別擴(kuò)增了β-actin、16S rRNA和12S rRNA的目的DNA片段,瓊脂糖凝膠電泳分析顯示三個(gè)內(nèi)參基因條帶與預(yù)期大小一致, 且均為單一條帶(圖2), 而且測(cè)序結(jié)果也正確。這表明各內(nèi)參基因的目的條帶正確, 引物具有較好的特異性, 可以用于后續(xù)實(shí)時(shí)定量PCR分析。

圖1 多刺裸腹溞總RNA瓊脂糖凝膠電泳圖Fig. 1 Agarose gel electrophoresis of total RNA extracted from M. macrocopa

圖2 候選內(nèi)參基因的表達(dá)Fig. 2 PCR products of candidate reference genes

2.2 實(shí)時(shí)定量PCR分析

圖3為β-actin、16S rRNA和12S rRNA三個(gè)內(nèi)參基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線, 相關(guān)系數(shù)R2分別為0.996,0.998和0.995, 線性關(guān)系好, 可靠性高。引物的擴(kuò)增效率在97.43%—105.54%(表2), 符合實(shí)時(shí)定量PCR對(duì)擴(kuò)增效率的要求。各個(gè)內(nèi)參基因的熔解曲線有明顯的單一信號(hào)峰, 樣品間的重復(fù)性高, 在陰性對(duì)照中未檢測(cè)到熒光信號(hào)。表明實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)中模板與引物結(jié)合良好, 具有高的特異性。

圖3 候選內(nèi)參基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig. 3 Standard curve equation of the candidate reference genes

表2 三個(gè)內(nèi)參基因的相關(guān)系數(shù)及擴(kuò)增效率Tab. 2 Correlation coefficient and amplification efficiency of three internal reference genes

2.3 內(nèi)參基因表達(dá)的穩(wěn)定性分析

內(nèi)參基因在樣品中的表達(dá)水平(Ct值)圖4利用比較Ct值的方法評(píng)估各候選內(nèi)參基因在所有樣本中的表達(dá)水平。結(jié)果顯示不同苯酚濃度下的β-actin、16S rRNA和12S rRNA的表達(dá)無顯著性差異(β-actin,P=0.163; 16S rRNA,P=0.490; 12S rRNA,P=0.165), 表明三個(gè)基因均可以作為多刺裸腹溞的內(nèi)參基因, 并且三個(gè)基因的穩(wěn)定性依次為16S rRNA＞12S rRNA＞β-actin。

內(nèi)參基因的GeNorm分析圖5利用GeNorm軟件比較M值確定穩(wěn)定的內(nèi)參基因, 結(jié)果顯示在苯酚脅迫下, 三個(gè)內(nèi)參基因在多刺裸腹溞中表達(dá)穩(wěn)定性由高到低的順序?yàn)?6S rRNA=β-actin＞12S rRNA。

內(nèi)參基因的NormFinder分析利用NormFinder軟件對(duì)內(nèi)參基因的穩(wěn)定性(S值)進(jìn)行分析(表3), 在苯酚脅迫下, 三個(gè)內(nèi)參基因在多刺裸腹溞中表達(dá)穩(wěn)定性由高到低的順序?yàn)?6S rRNA＞β-actin＞12S rRNA。

圖4 苯酚脅迫下多刺裸腹溞候選內(nèi)參基因表達(dá)水平(Ct值)Fig. 4 Transcript levels of candidate reference genes of M.macrocopa exposed to phenol

內(nèi)參基因的Bestkeeper分析Bestkeeper軟件通過參數(shù)的大小反映內(nèi)參基因穩(wěn)定性差異。該軟件默認(rèn)的SD值大于1時(shí), 內(nèi)參基因的穩(wěn)定性較差。從表4中可以看出, 苯酚脅迫下多刺裸腹溞16S rRNA的SD、Geo Mean、CV、Min和Max在三個(gè)內(nèi)參中值都最小,β-actin的SD次之, 12S rRNA的SD值最大, 所以三個(gè)內(nèi)參基因在多刺裸腹溞中表達(dá)穩(wěn)定性由高到低的順序?yàn)?6S rRNA＞β-actin＞12S rRNA, 故16S rRNA為表達(dá)最穩(wěn)定的內(nèi)參基因。

圖5 GeNorm軟件分析候選內(nèi)參基因穩(wěn)定性Fig. 5 Stability of candidate reference genes analyzed by GeNorm

表3 NormFinder軟件分析候選內(nèi)參基因穩(wěn)定性Tab. 3 Stability of candidate reference genes analyzed by NormFinder

表4 Bestkeeper軟件分析候選內(nèi)參基因穩(wěn)定性Tab. 4 Stability of candidate reference genes analyzed by Bestkeeper

苯酚處理后多刺裸腹溞HR3的表達(dá)本研究選擇HR3基因評(píng)估選定的內(nèi)參基因?qū)Ψ治瞿康幕蛳鄬?duì)表達(dá)量的影響。如圖6所示, 隨著苯酚濃度的升高, 多刺裸腹溞的HR3 mRNA水平逐漸下降。在苯酚濃度1.75和2.25 mg/L時(shí),HR3 mRNA的表達(dá)量顯著低于對(duì)照組(P＜0.05)。

圖6 不同濃度的苯酚脅迫下, 多刺裸腹溞HR3相對(duì)于16S rRNA的表達(dá)變化Fig. 6 The effect of phenol exposure on the HR3 level of M.macrocopa

3 討論

實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)具有強(qiáng)特異性、高準(zhǔn)確性和靈敏度成為轉(zhuǎn)錄水平檢測(cè)目標(biāo)基因表達(dá)的有效方法之一, 因此內(nèi)參基因的相關(guān)研究越來越多[20]。在進(jìn)行目標(biāo)基因的相對(duì)定量分析中, 穩(wěn)定的內(nèi)參基因可以消除因不同樣本引起的RNA提取質(zhì)量和反轉(zhuǎn)錄效益上的誤差, 因此, 篩選最適內(nèi)參基因極為重要, 不穩(wěn)定的內(nèi)參基因會(huì)直接影響結(jié)果的可靠性[21,22]。篩選內(nèi)參基因需要參考前人研究結(jié)果, 然后再篩選穩(wěn)定表達(dá)的常用內(nèi)參基因, 并做進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證[23,24]。

本研究選用內(nèi)參基因的表達(dá)水平Ct值、Ge-Norm、NormFinder和Bestkeeper四個(gè)常用的分析方法對(duì)β-actin、16S rRNA和12S rRNA基因進(jìn)行穩(wěn)定性分析。Ct值分析結(jié)果顯示苯酚脅迫多刺裸腹溞三個(gè)內(nèi)參基因的穩(wěn)定性順序?yàn)?6S rRNA＞12S rRNA＞β-actin, GeNorm軟件分析的穩(wěn)定性結(jié)果為16S rRNA=β-actin＞12S rRNA, NormFinder的結(jié)果同Bestkeeper軟件分析結(jié)果一致, 穩(wěn)定性順序?yàn)?6S rRNA＞β-actin＞12S rRNA。因此確定16S rRNA作為苯酚脅迫下多刺裸腹溞實(shí)時(shí)定量PCR最適內(nèi)參基因。在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步了探討了蛻皮級(jí)聯(lián)反應(yīng)中的關(guān)鍵因子HR3基因來評(píng)估16S rRNA作為內(nèi)參基因?qū)Ψ治瞿繕?biāo)基因的相對(duì)表達(dá)量。研究表明, 節(jié)肢動(dòng)物的生長(zhǎng)發(fā)育過程中受到污染物脅迫后,HR3表達(dá)被抑制, 致使機(jī)體不能正常完成蛻皮過程,甚至導(dǎo)致幼蟲死亡[25]。在本研究中, 隨著苯酚濃度的升高,HR3基因表達(dá)顯著下調(diào)(P＜0.05), 與Tao[25]的結(jié)果一致。驗(yàn)證了16S rRNA可以作為苯酚脅迫下多刺裸腹溞實(shí)時(shí)定量PCR的內(nèi)參基因。

目前, 在大型溞(Daphnia magna)、蚤狀溞(Daphnia pulex)、隆線溞(Daphnia carinata)、劍水蚤(Tigriopus japonicus)等枝角類中篩選出了在不同實(shí)驗(yàn)條件下表達(dá)最為穩(wěn)定的內(nèi)參基因[26—29]。研究結(jié)果表明, 內(nèi)參基因β-actin在中華擬同形溞(Daphnia similoides sinensis)中表達(dá)較穩(wěn)定[30], 而在隆線溞中的表達(dá)穩(wěn)定性較差[28]; 18S rRNA在蚤狀溞中能穩(wěn)定表達(dá)[26], 而在大型溞中穩(wěn)定性較差[29]。在研究三丁基錫對(duì)大型溞的毒性作用時(shí), 選擇β-actin和gapdh作為最適內(nèi)參基因來評(píng)估目標(biāo)基因HR3的表達(dá)情況[31]。本研究中16S rRNA為苯酚脅迫下的多刺裸腹溞最適內(nèi)參基因, 與大型溞、蚤狀溞等的結(jié)果不一致, 表明內(nèi)參基因在不同物種中沒有絕對(duì)的通用性。因此, 在相對(duì)定量分析目標(biāo)基因的表達(dá)時(shí),內(nèi)參基因的篩選是十分必要的[32]。

四種方法對(duì)三個(gè)內(nèi)參基因的穩(wěn)定性分析時(shí),Ct值的篩選結(jié)果和其他三種方法有部分結(jié)果不一致, 這種差異的原因可能是分析的統(tǒng)計(jì)學(xué)原理不一致造成的[33]。本研究利用實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù), 采用四種常用內(nèi)參基因穩(wěn)定性分析法研究了苯酚脅迫下多刺裸腹溞β-actin、16S rRNA和12S rRNA三個(gè)基因的表達(dá)穩(wěn)定性, 確定了16S rRNA作為苯酚脅迫下多刺裸腹溞實(shí)時(shí)定量PCR的最佳內(nèi)參基因。為后續(xù)多刺裸腹溞相關(guān)基因的定量表達(dá)分析提供了參考依據(jù)。

致謝：

感謝實(shí)驗(yàn)室李少欽老師、張左兵老師、劉娜老師和井維鑫老師以及郎朗博士等對(duì)實(shí)驗(yàn)的幫助和文章的修改。