隱匿性乙型肝炎病毒感染的生物學及臨床影響的研究進展

王榮明 江建寧

2018年10月，眾多國際專家齊聚意大利陶爾米納參加隱匿性乙型肝炎病毒感染(OBI)研討會。本次研討會回顧和討論了OBI的現(xiàn)有認識，通過小組討論，所有與會者達成共識，最終提出了2018版OBI聲明，本文將簡要介紹本次聲明的內(nèi)容。

一、OBI定義

隱匿性乙型肝炎病毒感染(OBI)是指通過目前的檢測方法，在乙型肝炎表面抗原(HBsAg)檢測陰性者的肝臟和(或)血液中，檢測到具有復制能力的HBV DNA(即游離型共價閉合環(huán)狀DNA，cccDNA)。根據(jù)HBV特異性抗體譜，OBI分為：血清陽性OBI——乙型肝炎核心抗體(抗-HBc)和(或)乙型肝炎表面抗體(抗-HBs)陽性；血清陰性OBI——抗-HBc和抗-HBs陰性。研究發(fā)現(xiàn)，OBI患者的HBV DNA僅在血清/血漿中間歇性檢測陽性，當HBV DNA可檢測到時，其濃度很低，通常低于200 IU/mL[1]。

二、病毒學和免疫學

(一)OBI分子基礎與被感染肝細胞核中cccDNA穩(wěn)定性和長期持久性有關

染色體外的HBV cccDNA以染色病毒微型染色體形式存在，非常穩(wěn)定且持久，加上肝細胞半衰期很長，這意味著HBV感染一旦開始，即使經(jīng)過有效的免疫控制，也可能終身感染[2-3]。

(二)宿主免疫和表觀遺傳機制抑制病毒復制活性和病毒蛋白表達 OBI患者具有低水平轉錄活性的cccDNA，導致HBV RNA轉錄水平低或不可測，影響隨后的蛋白質翻譯和表達[2-4]。但在OBI患者中cccDNA具有完全復制能力[5]。HBsAg自發(fā)清除或由于治療引起HBsAg清除后，HBV感染者的肝細胞中可能存在整合到宿主基因組的HBV DNA[6]。然而， OBI被認為是具有復制能力的HBV DNA的長期存在，而整合的HBV DNA不具有復制能力，因此診斷OBI不需要檢測整合的HBV DNA。

(二)OBI的HBV免疫應答 OBI與抗病毒免疫應答有關，這些免疫應答被認為是維持HBV控制的重要因素。OBI在全球高流行表明，免疫系統(tǒng)可控制大多數(shù)OBI患者的HBV(即使沒有完全清除)。持續(xù)/間歇性低濃度HBsAg持續(xù)刺激OBI患者的抗病毒免疫應答[7-8]?？共《颈Ｗo機制的效率差異可能與免疫系統(tǒng)暴露于高抗原和高病毒載量的時長有關[9]。一項通過檢測HBV DNA證實OBI患者免疫應答的研究顯示，OBI血清陽性和OBI血清陰性患者的T細胞對HBV表位的免疫應答不同，盡管體外反應同樣微弱，但在血清陽性的OBI患者中，特異性肽刺激后的體外T細胞擴增通常比血清陰性的OBI患者更明顯[10]。不僅T細胞，用B細胞選擇性單克隆抗體治療的患者中觀察到頻繁的HBV再激活，也提示體液免疫反應在OBI宿主調控中也很重要[11]。固有免疫也可能有助于隱匿感染的乙型肝炎病毒的控制，但目前還沒有這方面研究。

三、診斷

OBI的診斷基礎是檢測HBsAg陰性者的血液或肝臟中的HBV DNA。肝內(nèi)cccDNA檢測是金標準。血液中的HBV DNA檢測是常用的方法。OBI的診斷基于HBV DNA和HBsAg檢測方法的靈敏度。當前大多數(shù)HBsAg檢測試劑下限為0.05 IU/mL。 最近研究發(fā)現(xiàn)，使用這些試劑檢測陰性的樣本中有1%至48%的樣本使用更敏感試劑(檢測下限為0.005 IU/mL)檢測出現(xiàn)HBsAg陽性[12-13]。除了靈敏度外，目前的HBsAg檢測試劑在檢測S-逃逸變體的能力上也存在差異[12,14]。建議所有HBsAg的檢測都應該使用針對HBsAg多表位的抗-HBs探針，以確保檢測到HBV S基因變異。

此外，所有血清學檢測均在免疫復合物存在下檢測到過量的HBsAg。因此，在HBV感染者中，如果同時出現(xiàn)過量的抗-HBs，可能會干擾HBsAg的檢測。在這種情況下，如果能通過某些檢測方法，將HBsAg與HBsAg和抗-HBs結合的免疫復合物解離，那么某些OBI患者可能會變成HBsAg陽性[15]。

目前大多數(shù)HBV DNA檢測試劑的檢測下限為10～20 IU/mL。HBV DNA通常以低濃度存在，并且只能在OBI患者中間歇性地檢測到，對不少于1 mL血清或血漿的提取物進行檢測，以診斷OBI。

診斷OBI的理想方法是檢測肝臟中cccDNA。但目前尚無用于檢測肝臟cccDNA的標準化有效檢測方法。目前推薦的方法包括擴增至少3個不同的病毒基因組區(qū)域的巢式PCR、實時熒光定量PCR或液滴數(shù)字PCR[2,16-17]。

血液中抗-HBc檢測可作為識別血液或器官供者、即將接受免疫抑制治療的人以及流行病學研究中OBI的替代標記。在這些情況中，通常無法獲得肝組織，血液中HBV DNA的檢測可能受到限制或延遲，并且在1個時間點檢測的血液中檢測不到HBV DNA并不排除OBI。 抗-HBc檢測可能會發(fā)現(xiàn)一些OBI的獻血者，他們在微型池核酸檢測中有檢測到之前無法檢測到的HBV DNA[18]。值得注意的是，盡管血清陰性OBI在人群中的流行和臨床意義尚不清楚，但是抗-HBc檢測陰性并不排除OBI。

四、流行病學

由于OBI的流行病學取決于HBsAg和HBV DNA檢測方法的性能和靈敏度，因此要確定OBI的流行病學可能存在一定困難，具體取決于HBV暴露和存在的危險因素、肝病的嚴重程度、特定國家普通人群中HBV的流行率，以及OBI的定義。目前大多數(shù)流行病學研究都是針對獻血者和肝病患者進行的。這些人群中OBI的患病率與該地理區(qū)域和研究人群中的顯性HBV感染率有關。由于檢測方法的局限，一般人群中OBI的患病率仍然沒有定義。OBI在慢性肝病中的患病率較高，在HBsAg陰性的肝細胞癌(HCC)中可能高達40%～75%[19]。在獻血者中很少檢測到OBI，HBsAg陰性的血樣中HBV DNA檢出率通常低于0.5%[20]。HBsAg和HBV DNA檢測的特異性和敏感性、研究人群的特征、HBsAg陽性感染在一般人群中的流行情況以及用于定義OBI的標準都可以影響OBI流行率。因此，很難在不同研究之間進行數(shù)據(jù)比較和薈萃分析。

五、傳播

(一)輸血 HBsAg陰性、HBV DNA陽性的血液被認為具有傳染性。在低收入和中等收入國家，來自OBI獻血者的HBV傳播仍然是一個主要的健康問題，因為這些國家沒有實施抗-HBc和/或核酸檢測。即使在發(fā)達國家，也存在輸血傳播OBI的殘留風險，因為HBV DNA的最低感染劑量低于當前核酸檢測的檢測下限。來自OBI供體的輸血相關HBV傳播的發(fā)生率可能被低估了?？赡鼙坏凸赖脑虬ǎ?1)獻血者體內(nèi)無法檢測或間歇性檢測到HBV DNA；(2)難以追蹤或不愿追蹤受試者；(3)獻血者血樣數(shù)量不足或有限；(4)沒有明顯臨床表現(xiàn)的急性肝炎受者的HBV感染通常不被注意。

(二)肝移植 HBV可從OBI血清陽性的肝供體傳播到HBV易感的受體。這些受體應接受終身預防性核苷類似物(NUC)治療，以防止HBV感染。即使清除了HBsAg，HBV仍會在感染者的肝臟中持續(xù)存在。因此，OBI肝供體可以將HBV感染傳播給HBsAg陰性、抗-HBc陰性和抗-HBs陰性的受者，并可能發(fā)展為乙型肝炎[21]。建議使用NUC長期預防性抗病毒治療，例如恩替卡韋或替諾福韋[22]。但是，雖然可以預防HBsAg陽性感染，但抗病毒藥物的預防可能無法阻止受體OBI的發(fā)生[23]。盡管血清中沒有檢測到HBsAg和HBV DNA，但肝移植的OBI仍很常見。因此，對于所有因乙型肝炎進行肝移植的患者，建議終生預防性使用NUC[23]。

(三)母嬰傳播 盡管出生時有主動/被動免疫預防，但HBsAg陽性母親的新生兒仍可能會發(fā)生OBI[24-25]。世界衛(wèi)生組織提出了2030年消滅乙型肝炎病毒的目標。消除乙型肝炎母嬰傳播是實現(xiàn)這一目標的重要策略之一。新生兒1歲之后，來自母體被動轉移的抗體應該已經(jīng)消失，這時候如果免疫預防不能完全阻止HBV感染，但成功調節(jié)了感染，防止其進展為慢性HBV感染，這時候如果檢測抗-HBc陽性、HBsAg陰性，則診斷為新生兒OBI。

六、臨床意義

在絕大多數(shù)情況下，OBI不會導致任何臨床后遺癥。然而，OBI可能導致HBV感染血液或器官移植受者，并且在接受癌癥化療或其他免疫抑制治療患者HBV復制的再激活[26]。

七、抗病毒治療

當前不建議OBI患者進行抗病毒治療。基于數(shù)字微滴PCR的cccDNA定量檢測和更敏感的檢測方法的發(fā)展，研究表明在NUC治療期間，病毒抑制的慢性乙型肝炎患者和有OBI的肝臟供體中，有檢測到低至1拷貝/105肝細胞的cccDNA的可能性[27]。為了從OBI患者中消除HBV，必須消除感染了HBV的肝細胞或治愈這些細胞。理論上可以研究幾種途徑：(1)通過cccDNA靶向策略消除肝細胞內(nèi)cccDNA(如采用CRISPR/Cas9技術等基因編輯方法或細胞因子介導的cccDNA降解)；(2)使用旨在恢復HBV特異性T細胞應答的策略、治療疫苗接種策略、工程化T細胞療法來特異性殺死感染的肝細胞或HBV-T細胞受體工程化的T細胞殺死肝臟中殘留的感染細胞。

這不僅需要這些尖端技術適應臨床應用，還需要對cccDNA生物學和免疫控制以及在OBI環(huán)境中感染的肝細胞數(shù)量有更多的了解。

2018年OBI研討會圍繞OBI患病率、臨床影響和病毒/免疫機制的爭議和不確定性，提出了以下待解決的問題：

1. 流行病學和臨床研究

(1) 采用標準化的OBI研究報告方法，以便對研究結果的比較和合并；

(2) 開發(fā)更靈敏、標準化和有效的用于檢測血液和肝臟中HBV DNA的檢測方法；

(3) 開發(fā)更靈敏、標準化和經(jīng)過驗證的用于檢測血液中HBsAg的檢測方法，包括檢測HBV S變異體和存在抗-HBs免疫復合物中的HBsAg；

(4) 使用標準化的定義和適當?shù)臋z測方法，確定世界各地，特別是獻血者中的OBI患病率；

(5) 確定從OBI血液、器官、組織和細胞供體傳播HBV的風險，并根據(jù)當?shù)氐幕疾÷屎涂捎觅Y源，確定防止此類傳播的最佳策略；

(6) 定義OBI的臨床意義，尤其是OBI在具有其他可確定的肝病原因的患者以及無可確定的病因(隱源性肝病)的患者中在HCC中的作用，以及在加速(或不加速)發(fā)展為肝硬化中的作用；

(7) 協(xié)調關于預防OBI患者乙型肝炎病毒再激活的國際建議指南。

2. 基礎/轉化醫(yī)學研究

病毒學：確定因HBV變異導致的OBI的普遍性，以及OBI的分子病毒學的決定因素；免疫學：確定OBI的免疫調控與顯性HBV感染之間的區(qū)別，以及如何利用OBI的免疫調控機制實現(xiàn)HBV功能性治愈，確定干擾OBI的免疫調控導致HBV再激活的原因。

OBI是一種常見性疾病，值得科學界、醫(yī)學界和公共衛(wèi)生界的關注。本次研討會提出的許多關于OBI的問題，希望在10年后的下一次研討會上能得到令人滿意的解決。