69份國(guó)外小麥品種(系)抗葉銹性鑒定及基因分析

王思曼，張 靜，張培培，Gebrewahid Takele Weldu，閆曉翠，劉大群，李在峰

(河北農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院植物病理學(xué)系小麥葉銹病研究中心/河北省農(nóng)作物病蟲害生物防治技術(shù)創(chuàng)新中心/國(guó)家北方山區(qū)農(nóng)業(yè)工程技術(shù)研究中心,河北保定 071001)

小麥葉銹病是由小麥葉銹菌(Pucciniatriticina)引起的氣傳真菌性病害，發(fā)病嚴(yán)重時(shí)可造成小麥高達(dá)40%以上的減產(chǎn)，已成為全世界小麥最重要的病害之一[1-2]。近年來由于全球氣候變暖，葉銹病在我國(guó)有加重的趨勢(shì)，特別是2012和2015年，葉銹病在河南、山東、陜西和甘肅等省大面積發(fā)生[3]，造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。由于小麥葉銹菌生理小種變異，小麥抗病基因抗性頻繁喪失，因此明確小麥品種中所攜帶的抗病基因?qū)τ诳共∑贩N的選育和合理布局有重要意義。

小麥抗葉銹病基因可分為小種專化抗病基因和非小種?；共』騕4]。目前國(guó)內(nèi)外發(fā)現(xiàn)的小麥抗葉銹病基因有100多個(gè)，已經(jīng)被正式命名的有79個(gè)[5]，大多數(shù)表現(xiàn)為全生育期抗病，為小種專化抗病基因。成株抗葉銹病基因有12個(gè)[6]，其中Lr34[7]、Lr46[8]、Lr67[9]和Lr68[10]為成株慢銹基因，成株慢銹基因一般為非小種?；共』騕11]。目前，我國(guó)許多抗葉銹病基因已喪失抗性，僅有Lr9、Lr19、Lr24、Lr38、Lr47、Lr51和Lr53等少數(shù)抗葉銹病基因仍具有良好抗性[12-13]。因此，不斷發(fā)掘新的抗病基因，并利用抗病基因防治小麥葉銹病至關(guān)重要。

基因推導(dǎo)結(jié)合分子標(biāo)記技術(shù)可以快速鑒定出小麥品種中所攜帶的抗葉銹病基因。趙麗娜等[14]對(duì)23份小麥微核心種質(zhì)材料進(jìn)行了苗期抗性鑒定和標(biāo)記檢測(cè)，共推導(dǎo)出Lr1、Lr10等13個(gè)抗葉銹病基因。Ren等[15]在84份冬小麥材料中推導(dǎo)出Lr1、Lr3等12個(gè)抗葉銹病基因。Takele等[16]利用基因推導(dǎo)的方法在我國(guó)83份品種(系)中推導(dǎo)出Lr1、Lr26等9個(gè)抗葉銹病基因。

國(guó)內(nèi)外小麥種質(zhì)資源豐富，很多材料都攜帶有效的抗葉銹病基因，了解這些材料中所攜帶的抗葉銹病基因，可為抗病育種和基因布局防治小麥葉銹病提供有效抗源材料。本試驗(yàn)選用69份國(guó)外小麥品種(系)進(jìn)行苗期和成株抗葉銹性鑒定，同時(shí)結(jié)合分子標(biāo)記檢測(cè)供試材料中所攜帶的苗期及成株期抗葉銹病基因，以期為合理實(shí)施抗病基因布局、防治小麥葉銹病提供參考信息。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試材料包括36份已知抗病基因的近等基因系、69份從國(guó)外引進(jìn)材料中篩選出來的小麥品種(系)、感病對(duì)照鄭州5389和成株期慢銹對(duì)照SAAR，以及17個(gè)小麥葉銹菌生理小種(具體見表1)和田間成株期所用的混合生理小種(TGPS、PHTS和FHSS)均由河北省農(nóng)作物病蟲害生物防治工程技術(shù)研究中心提供。69份國(guó)外小麥品種(系)中，5份來自羅馬尼亞(Romania)，10份來自南斯拉夫(Yugoslavia)，54份來自國(guó)際玉米小麥改良中心(CIMMYT)，具體名稱見表2。17個(gè)葉銹菌生理小種是由提供者根據(jù)Long等[17]提出的四字母命名法進(jìn)行命名。

1.2 苗期基因推導(dǎo)及抗葉銹性鑒定

將所有供試材料播種于溫室育苗穴盤中，共播種17套。待小麥第一片葉片完全展開后，采用掃抹法將17個(gè)不同毒力的葉銹菌生理小種分別接于17套小麥葉片上，黑暗保濕16 h，再將其移入光照溫室(約25 ℃)培養(yǎng)大約兩周，待感病對(duì)照鄭州5389充分發(fā)病后，按照Roelfs等[18]的6級(jí)分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行侵染型鑒定。利用Dubin等[19]提出的基因推導(dǎo)原則對(duì)69份小麥品種(系)進(jìn)行基因推導(dǎo)。

1.3 田間接種及成株期抗葉銹性鑒定

于2017-2018年度將所有材料分別播種于河北保定河北農(nóng)業(yè)大學(xué)試驗(yàn)田和河南周口黃泛區(qū)農(nóng)場(chǎng)試驗(yàn)田。種植方法采用完全隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，設(shè)置兩個(gè)重復(fù)，行長(zhǎng)1.5 m，行距0.25 m，每10行種植一行感病對(duì)照鄭州5389，并且在兩側(cè)垂直種植感病對(duì)照鄭州5389作為誘發(fā)行。將用于田間接種的葉銹菌生理小種按等量的比例混合，制成含有0.05%吐溫20的葉銹菌孢子懸浮液，在小麥分蘗期噴施于誘發(fā)行，并用地膜覆蓋保濕 16 h。當(dāng)感病對(duì)照鄭州5389嚴(yán)重度達(dá)到50%時(shí)，開始按照Li等[20]的方法鑒定病害嚴(yán)重度，之后每周鑒定一次，待感病對(duì)照嚴(yán)重度達(dá)100%時(shí)，所調(diào)查數(shù)據(jù)即為最終嚴(yán)重度(final disease severity,FDS)。

1.4 數(shù)據(jù)分析

利用軟件SAS 9.1進(jìn)行方差分析，并計(jì)算品種間的LSD值。根據(jù)苗期和成株期的侵染型，將FDS明顯小于或與慢性對(duì)照SAAR無顯著差異的品種作為慢銹品種。

1.5 抗葉銹病基因的分子檢測(cè)

用CTAB法[21]提取小麥葉片基因組DNA，用0.5×TE把DNA溶解成100 μL原液，用分光光度計(jì)檢測(cè)提取DNA的純度和濃度。用ddH2O將DNA原液稀釋到40 ng·μL-1，作為進(jìn)行PCR的模板DNA。選用與已知抗葉銹病基因Lr1[22]、Lr9[23]、Lr10[24]、Lr19[25]、Lr20[26]、Lr24[27]、Lr26[28-29]、Lr34[30]、Lr37[31]緊密連鎖的分子標(biāo)記進(jìn)行檢測(cè)，引物序列參照相應(yīng)文獻(xiàn)，由生物工程(上海)股份有限公司合成。所有引物的PCR反應(yīng)體系為10 μL，包括1 μL 40 ng·μL-1DNA、 1 μL 40 μmol·L-1引物、5 μL 2×Taq PCR Mix、 3 μL ddH2O。各Lr基因PCR擴(kuò)增按照相應(yīng)文獻(xiàn)進(jìn)行，擴(kuò)增后用1.5%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 苗期基因推導(dǎo)及分子標(biāo)記檢測(cè)結(jié)果

由表1可以看出，在36份已知抗病基因的近等基因系中， 攜帶Lr2c、Lr3、Lr16、LrB、Lr10、Lr3bg、Lr13和Lr14b這8個(gè)基因的載體品種對(duì)供試的17個(gè)葉銹菌生理小種均表現(xiàn)為感病，而攜帶Lr9、Lr19、Lr24、Lr28、Lr29、Lr42、Lr44、Lr47、Lr51和Lr53這10個(gè)基因的載體品種對(duì)所有供試小種均表現(xiàn)為抗病，因此這18個(gè)基因無法通過基因推導(dǎo)的方法在69份國(guó)外小麥品種(系)中鑒定出來，其余18個(gè)抗葉銹病基因?qū)?7個(gè)供試小種表現(xiàn)出不同的抗病性，可以在69份國(guó)外小麥品種(系)中被推導(dǎo)出來。根據(jù)基因推導(dǎo)結(jié)合分子標(biāo)記檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Lr1、Lr10、Lr19、Lr26、Lr34和Lr37存在于在69份國(guó)外小麥品種(系)中(圖1)。

從表1和表2可以看出，Lr1對(duì)15個(gè)小種表現(xiàn)為抗性，而供試的國(guó)外材料中有8份小麥品種(系)(Lovrin-34、Transilvania-1、Agrounija、Sutjeska、CIM-3、CIM-14、CIM-26和CIM-42)的抗性與Lr1相同或較Lr1具有更廣譜的抗性，其中，Transilvania-1、Agrounija和Sutjeska對(duì)Lr26無毒的小種也表現(xiàn)出抗性，表明這些材料可能同時(shí)攜帶Lr1和Lr26。分子標(biāo)記檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，Transilvania-1、Agrounija、Sutjeska、CIM-3、CIM-14和CIM-26這6份材料與Lr1有相同的特異性片段，進(jìn)一步說明這6份材料含有Lr1基因。Lovrin-34和CIM-42這兩份材料只對(duì)TGPS和PHTS 2個(gè)小種表現(xiàn)感病，分子標(biāo)記檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，這2份材料可能攜帶Lr10和Lr34。

Lr15對(duì)14個(gè)小種表現(xiàn)出抗性，而Flamura-80、CIM-31、CIM-41、CIM-49和CIM-51對(duì)這14個(gè)小種也表現(xiàn)為抗性，表明這些材料可能攜帶Lr15。其中，F(xiàn)lamura-80、CIM-31和CIM-49對(duì)Lr2a無毒的小種也表現(xiàn)出抗性，故推測(cè)這些材料可能也攜帶Lr2a。

Lr36對(duì)16個(gè)小種表現(xiàn)為低侵染型，而Fundulea-262、CIM-19、CIM-22、CIM-29、CIM-30、CIM-32和CIM-44對(duì)這16個(gè)小種也表現(xiàn)為抗性，表明這些材料可能攜帶Lr36。

Lr26對(duì)4個(gè)小種表現(xiàn)為低侵染型，而Fundulea-262、Lovrin-10、Transilvania-1、Agrounija、Posavka、Radusa、Stizanka、Sutjeska、CIM-23和CIM-50這10份材料與Lr26的抗性譜相似，表明這些材料可能攜帶Lr26。其中，Posavka和CIM-23對(duì)Lr11無毒的小種也表現(xiàn)出抗性，表明這2份材料可能同時(shí)攜帶Lr11和Lr26。利用分子標(biāo)記檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，這10份材料與Lr26特異性片段一致，進(jìn)一步說明這10份材料含有Lr26。

Lr11對(duì)3個(gè)小種表現(xiàn)出抗性，而Posavka、CIM-2、CIM-4、CIM-5、CIM-8、CIM-9、CIM-21、CIM-23、CIM-41、CIM-45、CIM-51、CIM-53和CIM-54這13份材料與Lr11的抗性譜相似，表明這些材料可能攜帶Lr11。其中，CIM-8和CIM-21對(duì)Lr3ka無毒的小種也表現(xiàn)出抗性，表明這2份材料可能同時(shí)攜帶Lr11和Lr3ka。

Lr45對(duì)3個(gè)小種表現(xiàn)為低侵染型，而CIM-2、CIM-4、CIM-11、CIM-27、CIM-28、CIM-35、CIM-38、CIM-45、CIM-46、CIM-47、CIM-53和CIM-54這11份材料對(duì)3個(gè)Lr45無毒小種也表現(xiàn)為低侵染型，表明這些材料可能攜帶Lr45。其中，CIM-2、CIM-4、CIM-27、CIM-28、CIM-35、CIM-38、CIM-45、CIM-47和CIM-54對(duì)2個(gè)Lr17低毒小種也表現(xiàn)為抗病，推測(cè)這些材料可能同時(shí)攜帶Lr45和Lr17。此外，CIM-11、CIM-27、CIM-35、CIM-46對(duì)9個(gè)Lr14a低毒小種表現(xiàn)出抗性，推測(cè)這4份材料可能同時(shí)攜帶Lr14a和Lr45。

分子標(biāo)記檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，有18份國(guó)外小麥品種(系)檢測(cè)到與Lr10相同的條帶，但Lr10在苗期對(duì)所有供試小種均表現(xiàn)為感病，無法利用基因推導(dǎo)的方法鑒定出來。有5份供試小麥品種(系)與Lr19的抗性譜相似，即對(duì)17個(gè)葉銹菌小種均表現(xiàn)為高抗，分子標(biāo)記檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，其攜帶有與Lr19一致的特異性片段，進(jìn)一步表明這些材料中含有Lr19。Lr34和Lr37是成株抗病基因，無法進(jìn)行苗期基因推導(dǎo)，利用分子標(biāo)記檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，攜帶Lr34的材料有11份，攜帶Lr37材料的有26份。

在69份供試國(guó)外小麥材料中，有31份材料(Flamura-80、Fundulea-262、Agrounija、 Transilvania-1、Sutjeska、CIM-2、CIM-4、CIM-7、CIM-10、CIM-12、CIM-14、CIM-16、CIM-17、CIM-18、CIM-19、CIM-20、CIM-21、CIM-22、CIM-25、CIM-29、CIM-30、CIM-31、CIM-32、CIM-37、CIM-39、CIM-40、CIM-44、CIM-49、CIM-50、CIM-51和CIM-52)對(duì)所有供試葉銹菌小種表現(xiàn)為抗病，或僅對(duì)其中1個(gè)小種表現(xiàn)為感病，說明 這些材料中可能攜帶未知的抗葉銹病基因 (表2)。

M:DL2000; Z:鄭州5389; 1:Flamura-80; 2:Fundulea-262; 3:Lovrin-10; 4:Lovrin-34; 5:Transilvania-1; 6:Agrounija; 7:Jarka; 8:Krajinka; 9:Lepenica; 10:Panonija; 11:Posavka; 12:Radus。 Lr19和 Lr26右上角的“+、-”表示檢測(cè)所使用的標(biāo)記不同。

2.2 田間成株期抗病性鑒定結(jié)果

對(duì)2017-2018年度河北保定和河南周口試驗(yàn)田的田間抗葉銹性鑒定數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析發(fā)現(xiàn)，品種間、環(huán)境間以及品種與環(huán)境間的差異均極顯著性，說明小麥抗葉銹性基因的表達(dá)受基因型和環(huán)境的共同影響。由表3可以看出，慢銹對(duì)照SAAR田間平均嚴(yán)重度為5.25%，47份小麥品種的FDS低于慢銹對(duì)照SAAR或與慢銹對(duì)照的FDS差異不顯著，且在苗期對(duì)供試小種均表現(xiàn)為感病，表明這些品種為成株慢銹性品種。

表1 17個(gè)葉銹菌生理小種對(duì)36個(gè)含有已知抗葉銹病基因的品系的苗期侵染型

表2 17個(gè)葉銹菌生理小種對(duì)69份小麥品種(系)的苗期侵染型

表3 47份成株抗性品種苗期對(duì)混合小種的反應(yīng)型及成株期在田間的最終嚴(yán)重度

3 討 論

國(guó)外許多小麥品種攜帶有優(yōu)良抗病基因，引進(jìn)國(guó)外小麥品種在我國(guó)麥區(qū)種植，可以有效減輕小麥葉銹病對(duì)小麥的侵害，從而提高產(chǎn)量。因此，可以利用這些高抗品種作為抗源，培育抗性更加持久的抗病品種，用于我國(guó)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)。

經(jīng)鑒定，本試驗(yàn)中69份國(guó)外材料的抗性基因是單個(gè)抗性基因或多個(gè)抗性基因聚合的形式存在。根據(jù)苗期基因推導(dǎo)發(fā)現(xiàn)，Lr1對(duì)Lr3ka、Lr30和Lr14a無毒的小種也表現(xiàn)出抗性，因此攜帶基因Lr1的小麥品種無法推導(dǎo)出這些基因；當(dāng)材料中有Lr36時(shí)，不能推導(dǎo)出Lr1和Lr26；當(dāng)材料中攜帶Lr20時(shí)，不能推導(dǎo)出Lr26；當(dāng)材料中同時(shí)攜帶Lr15和Lr2a兩個(gè)基因時(shí)，不能推導(dǎo)出Lr1；當(dāng)材料中同時(shí)攜帶Lr15和Lr11兩個(gè)基因時(shí)，不能推導(dǎo)出Lr26；而當(dāng)在材料中同時(shí)攜帶Lr20和Lr45兩個(gè)基因時(shí)，不能推導(dǎo)出Lr11。

根據(jù)苗期基因推導(dǎo)發(fā)現(xiàn)，有8份小麥品種與Lr1抗性相同或比Lr1表現(xiàn)出更廣譜的抗性，分子標(biāo)記檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，有6份品種攜帶有與Lr1相同的特異性片段，其余2份品種可能攜帶Lr10和Lr34。Lr10[32]位于1A染色體短臂上，研究發(fā)現(xiàn)，該基因已喪失抗性，本研究中Lr10在苗期對(duì)所有小種均表現(xiàn)為感病，只能利用分子標(biāo)記檢測(cè)該基因是否存在。因此，在鑒定供試品種中是否含有抗病基因時(shí)，需要基因推導(dǎo)與分子標(biāo)記檢測(cè)相結(jié)合互相驗(yàn)證，以確保試驗(yàn)結(jié)果的可靠性。

Lr26[33]位于1BL/1RS易位系上，多年來被廣泛用于小麥抗病育種。本研究中共發(fā)現(xiàn)有10份小麥材料攜帶Lr26，通過系譜分析(http://www.wheatpedigree.net)發(fā)現(xiàn)，Transilvania-1、Sutjeska、Fundulea-262這3個(gè)材料的親本都有AVRORA。Purnhauser等[34]發(fā)現(xiàn)品種AVRORA攜帶Lr26基因。因此，這3份小麥品種中含有的Lr26來自AVRORA。黃國(guó)紅等[35]研究發(fā)現(xiàn)，品種Lovrin-10攜帶Lr26，這與本研究結(jié)果一致。

成株抗性基因Lr37[36]最早在小麥栽培品種VPM1中發(fā)現(xiàn)，本試驗(yàn)通過分子標(biāo)記檢測(cè)，共發(fā)現(xiàn)26份小麥品種攜帶有Lr37，所占比率達(dá)到 37.68%，這些品種在田間鑒定均表現(xiàn)出良好的抗性。Lr34[37]是成株慢銹基因，具有良好的抗葉銹性，本試驗(yàn)中共檢測(cè)到11份品種攜帶Lr34，所占比率為15.94%，其在田間均表現(xiàn)為抗病。本研究共發(fā)現(xiàn)47份材料為成株慢銹品種，這些小麥材料可作為抗源用于培育持久抗葉銹病小麥品種。