鄭耀通, 李文燕

(1.福建農(nóng)林大學(xué) 資源與環(huán)境學(xué)院，福建 福州 350002；2.福建農(nóng)林大學(xué) 應(yīng)用微生物技術(shù)研究所，福建 福州 350002)

白腐菌產(chǎn)生的木質(zhì)素過氧化物酶(LiP)、錳過氧化物酶(MnP)和漆酶(Lac)是木質(zhì)素降解的關(guān)鍵酶，在木質(zhì)素及其結(jié)構(gòu)類似物的降解中起重要作用，木質(zhì)素酶的合成是由培養(yǎng)基中碳、氮饑餓觸發(fā)的次生代謝過程，因而其產(chǎn)酶量低且不穩(wěn)定[1-3],了解白腐菌抗?fàn)I養(yǎng)阻遏產(chǎn)酶機(jī)理是提高酶產(chǎn)量的關(guān)鍵。Lac是一種含銅多酚的氧化酶，比LiP、MnP等過氧化物酶應(yīng)用更廣泛[4]，Lac可與多種底物作用[5]，除降解木質(zhì)素外還在生物檢測[6]、生物制漿與漂白[7]、污染治理[8]等方面得到應(yīng)用，了解白腐菌模式種黃孢原毛平革菌(Phanerochaete.chrysosporium)產(chǎn)Lac特性具有特別重要的意義。自Srinivasan等[9]以纖維素代替葡萄糖培養(yǎng)P.chrysosporiumBKM-F-1797產(chǎn)生Lac到Gnanamani等[10]發(fā)現(xiàn)硫酸銅可使P.chrysosporium以葡萄糖為碳源產(chǎn)生Lac并用光譜、磁共振與凝膠電泳證實(shí)P.chrysosporiumNCIM 1197能產(chǎn)生兩種組成型Lac同工酶以來，P.chrysosporium產(chǎn)Lac日益受到重視，Prabu等[11]從多年灌溉制漿與造紙污水的土壤中分離到P.chrysosporiumTL1，可在纖維二糖-天冬酰胺介質(zhì)中產(chǎn)生分子量為65 kDa的Lac，其基因序列與Trametesvillosalcc2(L49377)、Pycnoporuscinnarinuslac1基因(AF170093)分別具有85%的相似性。Buddolla等[12]從不同環(huán)境中分離到產(chǎn)Lac的P.chrysosporium；Jhadav等[13]對NCIM 1197深層發(fā)酵產(chǎn)Lac碳源條件進(jìn)行了優(yōu)化并部分純化了Lac，發(fā)現(xiàn)其分子量大約66 kDa。國內(nèi)對P.chrysosporium產(chǎn)Lac研究也受到重視，董旭杰等[14]發(fā)現(xiàn)P.chrysosporium5.0776在不同的培養(yǎng)條件下均能產(chǎn)生Lac；段新源等[15]發(fā)現(xiàn)P.chrysosporium在搖床培養(yǎng)條件下可產(chǎn)極少量的Lac；Gao等[16]發(fā)現(xiàn)P.chrysosporiumBKM-F-1767在限氮且初始C/N=100∶8條件下可產(chǎn)生20 U/L的 Lac。本研究篩選到2株解除營養(yǎng)阻遏在初生代謝產(chǎn)3種木質(zhì)素酶的突變菌株[17-18]，并對P.chrysosporiumR5305在不同營養(yǎng)條件下的產(chǎn)Lac動(dòng)力學(xué)研究時(shí)發(fā)現(xiàn)，在任一營養(yǎng)條件下均在培養(yǎng)前后出現(xiàn)兩個(gè)產(chǎn)Lac高峰，推測可能是由產(chǎn)酶不同調(diào)控因子調(diào)控產(chǎn)生的不同同工酶造成，為驗(yàn)證這種可能，本研究利用這兩株抗?fàn)I養(yǎng)阻遏產(chǎn)木質(zhì)素酶突變菌株，通過比較在富氮條件下不同時(shí)間產(chǎn)生Lac同工酶的差異，分析同工酶的產(chǎn)生與碳氮營養(yǎng)消耗的相關(guān)性，揭示黃孢原毛平革菌Lac同工酶產(chǎn)生機(jī)制及其與碳氮營養(yǎng)調(diào)控的關(guān)系，為白腐菌模式菌種木質(zhì)素酶合成調(diào)控的深入研究及實(shí)際應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 以黃孢原毛平革菌野生型pc530(Phanerochaetechrysosporium,pc530)為出發(fā)菌株，經(jīng)誘變選育的解除營養(yǎng)阻遏產(chǎn)酶菌株pcR5305、pcR5324，由福建農(nóng)林大學(xué)應(yīng)用微生物技術(shù)研究所提供。

1.1.2 培養(yǎng)基 ①PDA固體培養(yǎng)基,用于菌種擴(kuò)大培養(yǎng)；②液體富營養(yǎng)培養(yǎng)基(g/L)：在Tien等[1](1983)經(jīng)典培養(yǎng)基基礎(chǔ)上改進(jìn)，葡萄糖10，酒石酸銨 2.2，酒石酸鈉0.28，CaCl20.01，KH2PO40.2，MgSO4·7H2O 0.05，CuSO4·5H2O 0.125，5 mg/L VB11 mL，無機(jī)鹽溶液1 mL，用0.1 mol/L HAc-NaAc緩沖液調(diào)節(jié)至pH 4.5，用于液體產(chǎn)酶培養(yǎng)。無機(jī)鹽溶液(g/L)：甘氨酸 1.5，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.1，MgSO4·7H2O 3.0，NaCl 1.0，CoSO40.1，CaCl20.082，ZnSO40.1，CuSO4·5H2O 0.01，H3BO30.01，AlK(SO4)20.01，NaMoO40.01。

1.1.3 主要試劑 3,5-二硝基水楊酸(3,5-Dinitrosalicylicacid,DNS),2′-聯(lián)氨-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(ABTS)、乙酸鈉、酒石酸銨、乙酸、蒽酮、過硫酸銨、丙烯酰銨、愈創(chuàng)木酚、碘化鉀和碘化汞等。DNS 和ABTS 購自Sigma 公司,其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.1.4 儀器與設(shè)備 超凈工作臺(tái)(VS-1300U,蘇州凈化設(shè)備有限公司);生化培養(yǎng)箱(SPX-520B-Z,上海博迅);電泳儀(DYY-12C,北京六一儀器廠);紫外可見光分光光度計(jì)(UV-1200,上海美譜達(dá));高速冷凍離心機(jī)(GL-20G-II，上海安亭)等。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)方法與粗酶液制備 將上述液體培養(yǎng)基接種相應(yīng)的菌株到裝有30 mL培養(yǎng)液的300 mL三角瓶中，3個(gè)重復(fù)，37 ℃恒溫靜置培養(yǎng)，每天取1瓶發(fā)酵液過濾，80 ℃烘干至恒重，稱量并計(jì)算菌體生物量。濾液經(jīng)9 300×g，4 ℃離心5 min后制成粗酶液用于酶活測定。

1.2.2 Lac活性測定 在3 mL反應(yīng)體系中，含粗酶液0.5 mL、pH 5.0的 0.1 mol/L乙酸-乙酸鈉緩沖液1.5 mL、H2O2酶60 U，用1 mL 0.5 mmol/L ABTS啟動(dòng)反應(yīng)，25 ℃水浴保溫5 min，分光光度計(jì)在420 nm處測定吸光度隨時(shí)間的變化。1個(gè)酶活力單位(U)以每分鐘催化1 μmol ABTS氧化所需的酶量表示。

1.2.3 氨氮與葡萄糖濃度測定 采用納氏試劑比色法測定氨氮[19]，DNS試劑比色法測定葡萄糖濃度[20]。

1.2.4 Native-PAGE凝膠電泳 主要參考文獻(xiàn)[21]的方法進(jìn)行電泳，分離同工酶。方法如下：用4 ℃冰箱保存的全過程粗酶液進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠垂直板電泳分離Lac同工酶。用10%的分離膠和5%濃縮膠溶液制備成PAGE凝膠，將需分析的粗酶液與PAGE樣品緩沖液按4∶1的體積混合，用微量進(jìn)樣器吸取該混合液分別順序加樣20～30 μL至樣品槽中。電泳條件：恒溫4～8 ℃，電壓200 V，電流20 mA，電功率40 W，電泳至溴酚藍(lán)指示劑距離下端約1 cm處時(shí)，停止電泳，取出凝膠，蒸餾水沖洗2～3次后加入愈創(chuàng)木酚染色液，37 ℃恒溫箱內(nèi)染色約1 h，待酶帶呈現(xiàn)較為清晰的紅褐色時(shí)停止染色，取出凝膠漂洗干凈，進(jìn)行酶帶分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 突變菌株在富營養(yǎng)條件下產(chǎn)Lac同工酶動(dòng)態(tài)分析

前期的研究發(fā)現(xiàn)，在富氮條件下，野生型黃孢原毛平革菌pc530(WT)僅在營養(yǎng)基本耗盡的次生代謝過程中產(chǎn)生極其微量的Lac,而突變菌株pcR5305、pcR5324卻能在整個(gè)培養(yǎng)過程中產(chǎn)生Lac，且分別在培養(yǎng)前期與后期各有1個(gè)產(chǎn)酶高峰[18]，這可能是受不同調(diào)控因素調(diào)控產(chǎn)生不同Lac同工酶造成的。為驗(yàn)證這種可能性，比較了突變菌株不同時(shí)間產(chǎn)生的Lac同工酶的差異。結(jié)果顯示，不同培養(yǎng)時(shí)間的酶液經(jīng)電泳分離與Lac特異性染色后，出現(xiàn)了1～3條不等的同工酶條帶(圖1)，酶帶顏色深淺及寬度反映了Lac含量與活性的高低。菌株pcR5305培養(yǎng)1～3 d產(chǎn)生1條顏色較淺的酶帶，而培養(yǎng)4～7 d則產(chǎn)生多達(dá)3條同工酶條帶，其中1條顏色較深，另2條顏色逐漸變深，8～15 d產(chǎn)生2種同工酶，其中12～14 d產(chǎn)生的同工酶條帶顏色較深且酶帶較寬(圖1a)。另一菌株pcR5324培養(yǎng)12～15 d產(chǎn)生顏色較深的2條酶帶，培養(yǎng)1～11 d只產(chǎn)生1條同工酶酶帶，6～8 d產(chǎn)生的酶帶顏色較深(圖1b)。為進(jìn)一步比較菌株產(chǎn)生同工酶的差異，對同工酶電泳圖譜進(jìn)行了聚類分析。

圖1 不同時(shí)間(d)產(chǎn)Lac同工酶譜分析Fig.1 The analysis of the isoenzyme zymogram of the laccase produced by the mutants at different time a：pcR5305;b：pcR5324

2.2 Lac同工酶電泳遷移率及其聚類分析

依據(jù)圖1電泳結(jié)果計(jì)算各同工酶的相對遷移率Rf值(表1)，并以Rf為特征繪制酶譜模式圖(圖2)，用DPS軟件以最長距離法進(jìn)行聚類并構(gòu)建樹狀圖(圖3)。結(jié)果顯示，不同菌株在不同培養(yǎng)時(shí)間產(chǎn)生的同工酶條帶雖存在差異，但酶帶排列仍具有相似性，如2個(gè)菌株在整個(gè)培養(yǎng)過程中都存在1條Rf為(0.595±0.02)的酶帶，pcR5305在4～7 d和pcR5324在12～15 d均有Rf為(0.52±0.020)的酶帶，但pcR5305在4～15 d出現(xiàn)了pcR5324并不具有的Rf為(0.458±0.02)的酶帶。

表1 Lac同工酶相對遷移率(Rf)

圖2 Lac同工酶酶譜模式圖Fig.2 The model map of the isoenzyme zymogram of the laccases from mutants a：pcR5305；b：pcR5324

圖3 Lac同工酶酶譜聚類分析(最長距離法)Fig.3 Cluster analysis of the isoenzyme zymogram (furthest neighbor)a：pcR5305同工酶聚類；b： pcR5324同工酶聚類； c：pcR5305 與pcR5324同工酶聚類(F為pcR5305,B為pcR5324)a:pcR5305 isozyme cluster; b:pcR5324 isozyme cluster; c:pcR5305 and pcR5324 isozyme clusters (F is pcR5305, B is pcR5324)

pcR5305 在不同時(shí)間產(chǎn)生的同工酶可分為2～3類(圖3a)，在0.33≤D≤1.10水平上，同工酶的產(chǎn)生可分為3類，分別與該菌株在1～3 d產(chǎn)生1條同工酶帶、4～7 d產(chǎn)生3條酶帶和8～15 d產(chǎn)生2條酶帶結(jié)果相對應(yīng)(圖1)；在更低水平1.10

2.3 突變菌株產(chǎn)Lac動(dòng)力學(xué)及其與Lac同工酶之間的相關(guān)性

突變菌株pcR5305、pcR5324分別在第7天和第6天完成對數(shù)生長期，在15 d的培養(yǎng)過程中均有2個(gè)產(chǎn)酶高峰(圖4)，兩菌株均呈現(xiàn)出產(chǎn)酶與菌體生長同步的初生代謝產(chǎn)酶特性，都分別在第7天和第6天出現(xiàn)第一個(gè)產(chǎn)酶峰值。pcR5305菌體生長差于pcR5324，但產(chǎn)酶量高于pcR5324，可能是pcR5305在此階段合成3種同工酶Lac1～3，而pcR5324僅有1種同工酶Lac3。pcR5305菌株產(chǎn)生的Lac3同工酶條帶顏色深淺及其產(chǎn)酶時(shí)間分布與產(chǎn)酶動(dòng)力學(xué)中的產(chǎn)Lac活性相對應(yīng)，在6～8 d及12～14 d產(chǎn)生的酶譜帶顏色較深。在4～7 d產(chǎn)生的3條酶帶中，Lac2顏色較Lac1深，說明在菌體初生代謝期間，產(chǎn)生的Lac主要由Lac2和Lac3組成；而在12～14 d時(shí)，pcR5305只產(chǎn)生Lac1和Lac3兩條酶帶，而且Lac1顏色較Lac3深，說明Lac1在次生代謝期酶活峰值出現(xiàn)中起主要作用。同樣pcR5324也分別在第6天的初生代謝(128.833 U/L)和第12天的次生代謝階段(382.489 U/L)出現(xiàn)2個(gè)產(chǎn)酶峰值。對應(yīng)于其同工酶圖譜，Lac3的顏色深淺與產(chǎn)酶酶活高低相對應(yīng)，在12～15 d時(shí)pcR5324還產(chǎn)生了Lac2，這不同于pcR5305在初生代謝時(shí)期產(chǎn)生的Lac2，可能正是Lac2的產(chǎn)生使pcR5324在次生代謝期的酶活高于初生代謝期的酶活。

圖4 菌體生長與產(chǎn)Lac動(dòng)力學(xué)Fig.4 The thalli growth and the laccase-producing kinetics

2.4 突變菌株產(chǎn)Lac與營養(yǎng)基質(zhì)中C、N濃度的關(guān)系

突變菌株pcR5305與pcR5324在富氮條件下啟動(dòng)Lac合成與達(dá)到產(chǎn)酶高峰以及與培養(yǎng)基中C、N濃度的對應(yīng)關(guān)系列于表3，發(fā)現(xiàn)兩個(gè)突變菌株啟動(dòng)Lac合成與達(dá)到產(chǎn)酶高峰對應(yīng)的介質(zhì)中碳源葡萄糖、氮源氨氮濃度閥值遠(yuǎn)高于野生型，突變菌株產(chǎn)Lac已不需要白腐菌產(chǎn)木質(zhì)素酶固有的營養(yǎng)饑餓條件。野生型黃孢原毛平革菌合成木質(zhì)素酶受碳氮營養(yǎng)調(diào)控，有文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)C、N對黃孢原毛平革菌產(chǎn)LiP、MnP的調(diào)控路徑是分開的[22-23]，雖然從表3中難以發(fā)現(xiàn)突變菌株產(chǎn)Lac是由碳調(diào)控還是由氮調(diào)控的，也難以確定C或N調(diào)控是否獨(dú)立，但培養(yǎng)過程中C/N的降低是啟動(dòng)及合成Lac達(dá)到高峰的趨勢(圖5)，在這個(gè)過程中基質(zhì)氨氮的濃度變化不大。因此，基質(zhì)中碳源濃度的降低則是Lac合成更為重要的調(diào)控因素，事實(shí)上Lac合成的啟動(dòng)總是發(fā)生在葡萄糖快速消耗而導(dǎo)致C/N快速下降之后，這些現(xiàn)象說明突變菌株產(chǎn)Lac雖然不受營養(yǎng)限制，但可能存在更高水平上的C、N互作調(diào)控機(jī)制。

表3 葡萄糖、氨氮濃度及C/N與產(chǎn)Lac的關(guān)系

圖5 營養(yǎng)基質(zhì)C/N變化動(dòng)力學(xué)Fig.5 The changing kinetic of the C/N in the mediums

同工酶 Lac3的產(chǎn)生貫穿于兩個(gè)菌株的整個(gè)生長周期，其產(chǎn)生不受基質(zhì)中C/N的影響；而同工酶Lac1和Lac2在菌株pcR5305培養(yǎng)的4～7 d出現(xiàn)，且隨培養(yǎng)時(shí)間的延長產(chǎn)酶量逐漸增加,說明這兩種同工酶啟動(dòng)合成需滿足較低的基質(zhì)C/N，而這又同pcR5305能使C/N快速降低達(dá)到產(chǎn)酶條件有關(guān)。菌株pcR5324在1～5 d內(nèi)C/N仍處于較高水平，此時(shí)僅產(chǎn)生不受C/N影響的Lac3，但Lac2并沒有在6～7 d其 C/N與pcR5305 C/N相近時(shí)出現(xiàn)，反而在菌體進(jìn)入次生代謝期的12～15 d才合成,說明Lac2在pcR5324的合成主要受控于次生代謝的其它調(diào)節(jié)因素。突變菌株產(chǎn)生的3種Lac同工酶中，同工酶Lac3在兩個(gè)菌株中應(yīng)該具有相似的合成調(diào)控機(jī)制，其合成啟動(dòng)及其酶合成的消長均貫穿于兩個(gè)菌株的整個(gè)培養(yǎng)過程，其同工酶的合成啟動(dòng)與積累幾乎不受營養(yǎng)基質(zhì)中N、C以及C/N的限制，Lac2則在不同的菌株中具有不同的調(diào)控與產(chǎn)生機(jī)理，而同工酶Lac1可能是菌株pcR5305特有的同工酶，在初生代謝期間合成，在介質(zhì)中C/N較低(約5.0～7.0)時(shí)誘導(dǎo)產(chǎn)生。

3 討 論

目前，有關(guān)黃孢原毛平革菌產(chǎn)Lac同工酶的報(bào)導(dǎo)不多，而動(dòng)態(tài)產(chǎn)Lac同工酶的報(bào)導(dǎo)還未發(fā)現(xiàn)。僅Srinivasan等[9]利用非變性凝膠電泳發(fā)現(xiàn)黃孢原毛平革菌能產(chǎn)生兩種同工酶；Jhadav等[13]發(fā)現(xiàn)黃孢原毛平革菌NCIM 1197菌株含有兩種組成型同工酶；Dittmer等[24]在MonoQ洗脫柱中觀察到4個(gè)酶峰并認(rèn)為黃孢原毛平革菌能產(chǎn)生4種同工酶，MonoQ柱洗脫出現(xiàn)的峰值是否就表示不同的同工酶，還有待于進(jìn)一步證實(shí)。同工酶數(shù)的不同可能是由于不同的方法、菌株或生長條件所致。本研究結(jié)果顯示，不同的同工酶除存在菌株差異外，還與培養(yǎng)條件和時(shí)間有關(guān)，pcR5305、pcR5324在富氮條件下，不同培養(yǎng)時(shí)間內(nèi)可分別產(chǎn)生1～3種同工酶(Lac1、Lac2和Lac3)，其中pcR5305在4～7 d時(shí)最多可產(chǎn)生3種同工酶，pcR5324在12～15 d最多可產(chǎn)生2種同工酶。在產(chǎn)生的3種同工酶中，兩個(gè)菌株都能產(chǎn)生Lac3，其產(chǎn)酶過程伴隨菌體從初生代謝到停止生長的次生代謝的整個(gè)生長周期，Lac2同工酶在pcR5305的初生代謝階段產(chǎn)生，但菌株pcR5324的Lac2同工酶卻在營養(yǎng)基本耗盡的次生代謝階段產(chǎn)生；Lac1只有pcR5305菌株代謝產(chǎn)生，而且既可在初生代謝期間也可在次生代謝期產(chǎn)生，其產(chǎn)酶規(guī)律顯然同Lac3有所不同，在培養(yǎng)的前3 d基本不產(chǎn)生Lac1，在第4天才出現(xiàn)Lac1的活性并隨培養(yǎng)時(shí)間的延長其產(chǎn)酶能力逐漸提高。顯然Lac1～Lac3的合成在不同的菌株中具有不同的調(diào)控機(jī)理，這一點(diǎn)與黃孢原毛平革菌另2種木質(zhì)素降解酶LiP、MnP同工酶產(chǎn)生受營養(yǎng)調(diào)控現(xiàn)象基本一致。白腐菌模式種黃孢原毛平革菌產(chǎn)Lac及其同工酶的營養(yǎng)調(diào)控以及分子機(jī)理還有待于進(jìn)一步研究，而良好的實(shí)驗(yàn)材料pcR5305和pcR5324則為這些研究提供了基礎(chǔ)。

野生型黃孢原毛平革菌木質(zhì)素酶(LiP、MnP、Lac)是典型的次生代謝產(chǎn)物，喻國策等[25]對P.chrysosporium(BKM-F-1767)的研究顯示，在初始氨氮濃度低于0.154 g/L時(shí)，可檢測到Lac的產(chǎn)生，在第6天出現(xiàn)微弱Lac酶活，并在葡萄糖0.06 g/L，氨氮0.01 g/L時(shí)的第9天達(dá)到產(chǎn)Lac峰值(8.15 U/L)，Lac峰值出現(xiàn)的時(shí)間與葡萄糖完全耗盡或接近耗盡以及氨氮處于最低值相對應(yīng)。當(dāng)初始氨氮大于0.308 g/L時(shí)，很難檢測到Lac的活性。本研究中，突變菌株pcR5305及pcR5324可在初始氨氮濃度達(dá)2.2 g/L富氮環(huán)境下合成Lac，啟動(dòng)Lac合成及達(dá)到產(chǎn)酶峰值對應(yīng)的葡萄糖、氨氮濃度閥值不僅遠(yuǎn)高于P.chrysosporium(BKM-F-1767)，而且也是WT啟動(dòng)Lac合成時(shí)葡萄糖濃度的6～9倍、氨氮的2.5倍、達(dá)到第一個(gè)產(chǎn)Lac高峰時(shí)葡萄糖濃度的11～13倍以及氨氮的2～2.5倍。顯然，突變菌株pcR5305及pcR5324對在白腐菌中普遍存在的產(chǎn)酶營養(yǎng)阻遏已不敏感，雖然其抗?fàn)I養(yǎng)阻遏產(chǎn)酶的分子機(jī)理有待進(jìn)一步研究，但培養(yǎng)過程中C/N的降低是啟動(dòng)及合成Lac達(dá)到高峰的總趨勢(圖5)，碳濃度的降低應(yīng)該是Lac合成更為重要的調(diào)控因素，誘變菌株pcR5324和pcR5305在培養(yǎng)過程中的碳氮消耗比例相近，酶活高峰均在C/N低至7～8左右出現(xiàn)，pcR5305的Lac2、pcR5324的Lac3對第一個(gè)酶峰貢獻(xiàn)大，而pcR5305的Lac1、pcR5324的Lac2是出現(xiàn)第二個(gè)酶峰的主要原因，進(jìn)一步弄清不同同工酶合成調(diào)控的分子機(jī)理及其影響因素，將有助于闡明白腐菌木質(zhì)素酶合成的營養(yǎng)阻遏機(jī)制。