2覃小珊2陳椿

(1. 右江民族醫(yī)學(xué)院研究生學(xué)院，廣西 百色 533000；2. 右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，廣西肝臟疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心，廣西 百色 533000)

原發(fā)性肝細胞癌(primary hepatocellular carcinoma，PHC)是世界上最常見的惡性腫瘤之一，在世界衛(wèi)生組織(World Health Organization，WHO)發(fā)表的《全球癌癥報告2018》中，肝癌的死亡率僅次于肺癌和結(jié)腸癌[1]；而根據(jù)2019年國家癌癥中心發(fā)布的中國最新癌癥數(shù)據(jù)顯示：在男性患者中，肝癌的發(fā)病率僅次于肺癌及胃癌[2]。目前肝癌的治療手段仍以手術(shù)切除為主，輔以放化療和藥物治療，手術(shù)復(fù)發(fā)率較高、預(yù)后差。MicroRNA(簡稱miRNA)是指廣泛存在于動物、植物、病毒中，大小為18～24個核苷酸的非編碼RNA小分子，它主要通過與靶基因mRNA的3端非編碼區(qū)的結(jié)合來進行轉(zhuǎn)錄后的基因表達調(diào)控，從而參與細胞的增殖、凋亡、侵襲和轉(zhuǎn)移等。目前已有研究表明，mir-181a不僅與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，同時也在肝癌細胞的增殖、凋亡、侵襲和轉(zhuǎn)移方面發(fā)揮著重要作用[3]。苦參素，從我國傳統(tǒng)中藥苦參和廣豆根提純而來，具有抗炎、抗腫瘤等多種藥理作用。近年來我們課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，苦參素能夠在體外及體內(nèi)環(huán)境中抑制肝癌細胞的增殖、轉(zhuǎn)移，并改善肝癌細胞的多藥耐藥性[4-5]。因此，本研究通過構(gòu)建人肝癌細胞耐藥株HepG2/ADM裸鼠皮下移植瘤模型，在體內(nèi)環(huán)境中研究苦參素及miR-181a在肝癌化療耐藥中的作用，進而探討苦參素逆轉(zhuǎn)肝癌化療耐藥的機制，為肝癌的分子治療提供理論和實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1細胞株 人肝癌耐藥細胞株HepG2/ADM購自廣州吉妮歐生物科技有限公司，由本?？蒲兄行谋４嬗谝旱?。

1.1.2實驗動物 45只SPF級BALB/c-nu雌性裸鼠，4周齡，質(zhì)量12～13 g，購于湖南省長沙市天勤生物技術(shù)有限公司，飼養(yǎng)于SPF級動物房內(nèi)，裸鼠飼料、水均經(jīng)高壓滅菌處理并由動物實驗室提供。

1.1.3主要試劑 苦參素注射液：正大天晴藥業(yè)集團股份有限公司(批號：國藥準字H20057480)；注射用鹽酸多柔比星：深圳萬樂藥業(yè)有限公司(批號：國藥準字H44024359) ； PBS，RPMI-1640細胞培養(yǎng)基、胰蛋白酶消化液來自索萊寶公司，胎牛血清來自Gibco公司；miR-181a mimic，mirna mimic NC購自廣州銳博生物技術(shù)有限公司；體內(nèi)轉(zhuǎn)染試劑Entranster-in vivo購自英格恩生物公司；兔抗P-gp、 β-action、辣根過氧化物酶標記羊抗兔免疫球蛋白 G 購自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司；高效RIPA裂解液購自索萊寶公司；BCA法蛋白定量試劑盒、SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液、SDS-PAGE凝膠配制試劑盒購自上海碧云天公司；底物發(fā)光液購自北京全品速生物科技有限公司；人ABCB1、GAPDH引物購自上海生工；總RNA小量制備試劑盒購自AxyPrep公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自Thermo公司； FastStart Universal SYBR Green Master (Rox)購自Roche公司。

1.2方法

1.2.1細胞培養(yǎng) 人肝癌耐藥細胞株HepG2/ADM需在阿霉素濃度為2 μg/ml含10%胎牛血清的PRMI-1640細胞培養(yǎng)液中培養(yǎng)以維持其耐藥性，并在37℃、5%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；細胞貼壁生長于培養(yǎng)基中，取對數(shù)生長期細胞用于實驗。

1.2.2裸鼠耐藥模型建立 購買45只4周齡BALB/C裸鼠(均為雌性)，嚴格飼養(yǎng)在恒溫(20℃～26℃)、恒濕(50%～56%)、無特定病原體(specific pamogen-free，SPF)的空氣潔凈層流架內(nèi)；裸鼠盒、空氣過濾罩、墊料、飼料和飲水等均經(jīng)高壓蒸氣滅菌，并在無菌條件下2～3 d左右適時更換。適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，常規(guī)消毒，右前肢腋背部皮下接種HepG2/ADM細胞，接種細胞數(shù)為1×107個。接種后繼續(xù)飼養(yǎng)裸鼠，并每天觀察裸鼠的飲食、排便、精神狀態(tài)。接種7～10 d后，在接種部位可見米粒大小的結(jié)節(jié)，觸之質(zhì)硬時為HepG2/ADM裸鼠移植瘤構(gòu)建成功。

1.2.3實驗分組及處理 待腫瘤長至直徑5 mm時，從45只裸鼠中隨機選取42只，其余3只備用，取42只雌性裸鼠隨機分為6組(苦參素組、阿霉素組、miR-181a mimic組、苦參素+miR-181a mimic組、mirna mimic NC組、空白對照組)，每組7只，分別瘤內(nèi)注射：苦參素，阿霉素，miR-181a mimic，苦參素+miR-181a mimic，mirna mimic NC，PBS，每兩天一次，共注射18 d。苦參素組：每只裸鼠注射苦參素100 mg/kg；阿霉素組：每只裸鼠注射阿霉素6 mg/kg；miR-181a mimic組：取5 μg miR-181a mimic溶于8 μl體內(nèi)轉(zhuǎn)染劑 Entranster-in vivo中，然后以PBS稀釋至終濃度50 μg/ml，每只裸鼠每次注射0.1 ml；苦參素+miR-181a mimic組：每只裸鼠注射0.1 ml濃度為50 μg/ml的miR-181a mimic和苦參素100 mg/kg；mirna mimic NC組：取5 μg mirna mimic NC溶于8 μl體內(nèi)轉(zhuǎn)染劑Entranster-in vivo中，然后以PBS稀釋至終濃度50 μg/ml，每只裸鼠每次注射0.1 ml；空白對照組：直接注射0.1 ml PBS。

1.2.4觀察和測量 接種后每天觀察裸鼠的飲食、排便、精神狀態(tài)。隔天觀察并測量成瘤體積大小，計算1/2×最長徑線(mm)×(最短徑線)2(mm2)為瘤體體積(mm3)。開始給藥后，每次注射前，重新測量瘤體體積并記錄，根據(jù)數(shù)據(jù)繪制生長曲線。注射結(jié)束后，拉頸法處死裸鼠，用手術(shù)剪和手術(shù)刀剝離瘤體，進行拍照并稱取腫瘤重量；取部分瘤組織作常規(guī)固定，石蠟包埋，切片，HE染色后觀察組織病理學(xué)；剩余部分瘤組織放置于-80℃冰箱，用作其余實驗。

1.2.5免疫組織化學(xué)檢測P-gp蛋白的表達 取出部分瘤體使用4%甲醛固定，蠟塊包埋與切片后染色。結(jié)果判定標準：在細胞質(zhì)或/和細胞膜出現(xiàn)黃色、棕色或褐色顆粒的細胞為P-gp陽性細胞，每個樣本切片在400倍光鏡下隨機選取1個視野，四組共20個視野，用IPP 6.0(Image-Pro Plus)圖像分析系統(tǒng)掃描后，取各組的視野積分光密度值(IOD)進行對比。

1.2.6Western blot 法檢測P-gp蛋白的表達 提取各組總蛋白，BCA 法檢測各組總蛋白濃度并配平，加入上樣蛋白緩沖液后100℃加熱變性， 按照SDS-PAGE凝膠試劑盒制膠，上樣5 μl，70 V電泳，待溴酚藍進入分離膠時將電壓調(diào)為120 V，溴酚藍到達膠的底部時停止電泳(約1.5 h)；準備膜與凝膠，制作轉(zhuǎn)移“三明治”膜，在電流0.3 mA中轉(zhuǎn)膜1～2 h，轉(zhuǎn)膜結(jié)束后取出PVDF膜，加入封閉液封閉15 min，用TBST漂洗3次，根據(jù)抗體說明書稀釋一抗，將PVDF膜與一抗共孵育，在4℃中孵育過夜，根據(jù)抗體說明書稀釋二抗，取出PVDF膜，用TBST漂洗3次，將PVDF膜與二抗共孵育1 h，取出PVDF膜，用TBST漂洗3次，最后加入發(fā)光液進行曝光。使用 Image J 軟件分析各條帶灰度值。

1.2.7實時熒光定量PCR法檢測ABCB1基因的表達 使用總RNA小量制備試劑盒(AP-MN-MS-RNA-50G)和逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(K1622)提取總RNA并逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。按4913914001-5 ml試劑盒說明進行兩步法擴增，然后溶解、冷卻。ABCB1引物由上海生工公司設(shè)計合成，F(xiàn)：GATTGCTCACCGCCTGTCCAC，R：CGTGCCATGCTCCTTGACTCTG。內(nèi)參HS-GAPDH，F(xiàn)： CAGGAGGCATTGCTGATGAT，R：GAAGGCTGGGGCTCATTT。計算：Ct(目標基因-內(nèi)參基因)，Ct(樣品△Ct-空白對照樣品△Ct)，結(jié)果是2-△△Ct。

2 結(jié)果

2.1腫瘤生長情況及裸鼠一般狀況 裸鼠成瘤率為100%，將腫瘤細胞接種于裸鼠右背近腋部皮下，15 d左右可見皮下腫瘤結(jié)節(jié)，瘤體長徑5～6 mm，腫瘤為類圓形，表面光滑。實驗期間各組裸鼠均存活，且未出現(xiàn)明顯異常，大小便及飲食情況均正常。干預(yù)18 d后，各組體積皆為正態(tài)分布，因方差具有齊性，采用LSD法組間兩兩比較，阿霉素組、空白對照組及mirna mimic NC組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，其他組之間兩兩比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。表1、圖1可見，miR-181a mimic組對腫瘤的生長促進作用最好，苦參素+miR-181a mimic組的促進效果次之，苦參素組對腫瘤的生長抑制作用明顯，單獨使用阿霉素對人肝癌耐藥細胞株HepG2/ADM移植瘤效果較差。

表1干預(yù)18d后各組移植瘤體積比較單位：mm3

組別瘤體積miR-181a mimic組558.86±13.32acdef苦參素組152.57 ±3.67abdef苦參素+ miR-181a mimic組414.71 ±8.90abcef阿霉素組258.71 ±8.77bcdmirna mimic NC組283.57 ±7.64bcd空白對照組275.29 ±7.86bcdF259.530P<0.05

圖1 各組移植瘤體積生長曲線圖

2.2病理學(xué)結(jié)果及HE染色 表面觀察形態(tài)裸鼠移植瘤和人肝癌組織相似。早期移植組織一般顯示為堅硬結(jié)節(jié)狀，隨著時間推移，逐步顯示為圓形。部分為卵形或不規(guī)則形，上面有突起。裸鼠體內(nèi)未出現(xiàn)轉(zhuǎn)移灶、腹水、胸水。200倍數(shù)光鏡下觀察HE染色。見圖2。所有樣本組織結(jié)構(gòu)與細胞形態(tài)都沒有明顯區(qū)別，體現(xiàn)為肝癌實體：細胞大小不均，其胞質(zhì)為嗜堿性，核漿比例增多，核分裂隨處可見；一部分肝癌細胞有脂肪變性現(xiàn)象，有小片或大片凝固性壞死。miR-181a mimic組(見圖2A)與苦參素+miR-181a mimic組(見圖2B)類似，凝固性壞死較少。miRNA mimics NC組(見圖2C)、空白對照組(見圖2D)及阿霉素組組(見圖2E)出現(xiàn)少量凝固性壞死。苦參素組(見圖2F)出現(xiàn)大片凝固性壞死。結(jié)果表明：阿霉素對人肝癌耐藥細胞株HepG2/ADM基本無效，苦參素有促進腫瘤組織壞死作用，miR-181a mimic有抑制腫瘤組織壞死作用。

圖2 各組移植瘤石蠟切片HE染色表現(xiàn)(200倍光鏡下)

注：A為miR-181a mimic組；B為苦參素+miR-181a mimic組；C為miRNA mimics NC組；D為空白對照組；E為阿霉素組；F為苦參素組

2.3P-gp蛋白免疫組化結(jié)果 P-gp若呈陽性，染色多數(shù)在細胞胞漿內(nèi)(部分在包膜)，顏色呈棕黃色或褐色，在組織視野中出現(xiàn)片狀、彌漫分布。經(jīng)過IPP 6.0掃描后，取各自的視野積分光密度值(IOD)進行對比。得出IOD值后用SPSS 24.0處理數(shù)據(jù)。因方差具有齊性，使用LSD法，空白對照組與mirna mimic NC組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，其他組之間兩兩比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。表2、圖3可見miR-181a mimic組P-gp蛋白表達最高，其次是苦參素+miR-181a mimic組和阿霉素組，苦參素組中P-gp蛋白表達明顯降低。

表2 各組P-gp蛋白表達積分光密度值IOD對比

圖3 各組P-gp蛋白免疫組化圖(400倍光鏡下)

注：A為miR-181a mimic組；B為苦參素+ miR-181a mimic組；C為miRNA mimics NC組；D為空白對照組；E為阿霉素組；F為苦參素組

2.4Western Blot法檢測P-gp蛋白的結(jié)果 曝光后的圖片經(jīng)Image J軟件進行分析，得出灰度值后用SPSS 24.0處理數(shù)據(jù)，各組內(nèi)參蛋白β-action的表達經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析無顯著性差異。因方差具有齊性，使用LSD法，空白對照組與mirna mimic NC組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，其他組之間兩兩比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。圖4、圖5、表3可見miR-181a mimic組P-gp蛋白表達最高，其次是苦參素+miR-181a mimic組和阿霉素組，苦參素組中P-gp蛋白表達最低。

2.5實時熒光定量PCR法檢測ABCB1 mRNA結(jié)果 空白對照組與mirna mimic NC組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，其他組之間兩兩比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。表4、圖6可見miR-181a mimic組中ABCB1基因表達最高，其次是苦參素+miR-181a mimic組和阿霉素組，苦參素組中ABCB1基因表達最低。

圖4 各組移植瘤中P-gp蛋白及β-action蛋白的Western Blot蛋白印跡圖

注：1為空白對照組；2為mirna mimic NC組；3為阿霉素組；4為苦參素+ miR-181a mimic組；5為苦參素組；6為miR-181a mimic組

圖5 各組移植瘤中P-gp蛋白的相對表達

表3各組移植瘤中P-gp蛋白相對表達量

組別相對表達量miR-181a mimic組1.07±0.05acdef苦參素組0.54±0.07abdef苦參素+miR-181a mimic組0.96±0.03abcef阿霉素組0.84±0.02abcdfmirna mimic NC組0.69±0.09bcde空白對照組0.72±0.09bcdeF30.292P<0.05

3 討論

肝癌傳統(tǒng)的治療方式主要可分為手術(shù)切除、肝移植、局部消融、常規(guī)化療以及綜合輔助治療等。但由于目前大部分的HCC患者被診斷出肝癌時已經(jīng)處于疾病晚期，中位生存期僅為6～8個月，因此手術(shù)切除后再進行輔組化療是目前應(yīng)用最廣泛的肝癌根治性治療方法。常用的化療藥物包括索拉非尼、阿霉素、5-氟尿嘧啶、含鉑抗癌藥物等，但是這些藥物對患者的生存率改善并不明顯，主要原因就是多藥耐藥性的產(chǎn)生。多藥耐藥現(xiàn)象幾乎存在于所有惡性腫瘤中，是指一種腫瘤細胞同時對多種結(jié)構(gòu)和作用機制完全不同的抗腫瘤藥物產(chǎn)生交叉耐藥性的現(xiàn)象，臨床上多分為原發(fā)耐藥和繼發(fā)耐藥兩種。目前認為腫瘤原發(fā)耐藥與基因遺傳學(xué)水平的變異密切相關(guān)，而繼發(fā)耐藥與不改變DNA序列的基因表觀遺傳學(xué)水平的變異密切相關(guān)，常見的方式有對組蛋白、非編碼RNA序列以及DNA位點的修飾，其結(jié)果往往會影響到相關(guān)基因序列的表達，從而影響到繼發(fā)耐藥的產(chǎn)生過程[6]。關(guān)于腫瘤多藥耐藥，目前研究認為其機制主要有[7-8]：以耐藥相關(guān)蛋白的表達等為例的生化耐藥，常起因于腫瘤細胞的遺傳特性發(fā)生生物化學(xué)修飾改變所致的；機體在不同病理情況下產(chǎn)生的藥理性耐藥，常起因于作用于腫瘤細胞的有效的藥物濃度減少所致的；以及在遺傳信息分子因素發(fā)生變化產(chǎn)生的細胞凋亡耐藥，常起因于不同促抗凋亡基因的異常表達所致的。而后者與臨床上使用的諸多化學(xué)治療藥物作用原理相關(guān)，因此，進一步探索逆轉(zhuǎn)細胞凋亡耐藥的有效途徑，將會為提高臨床化學(xué)治療質(zhì)量帶來希望。

表4 各組移植瘤中ABCB1 mRNA相對表達量

圖6 各組移植瘤中ABCB1 mRNA的相對表達

miR-181a是miR-181家族成員之一，其作用機制主要通過與靶基因mRNA的3 端非編碼區(qū)的結(jié)合來進行轉(zhuǎn)錄后的基因表達調(diào)控，從而參與細胞的增殖、凋亡、侵襲和轉(zhuǎn)移等。有研究顯示miR-181a不僅參與腫瘤的增值、侵襲和轉(zhuǎn)移，還參與多種腫瘤的多藥耐藥性的產(chǎn)生，并在不同的腫瘤耐藥中具有不同的作用，如miR-181a可促進使乳腺癌細胞對阿霉素的耐藥性[9]，但在肺癌中miR-181a卻可以提高肺癌細胞對化療藥物的敏感性[10]。在肝癌中，已有研究發(fā)現(xiàn)miR-181a在耐藥的肝癌細胞中高表達[11]，Azumi J等[12]研究發(fā)現(xiàn)miR-181a可以通過靶向抑制信號轉(zhuǎn)導(dǎo)因子RASSF1來誘導(dǎo)肝癌細胞對索拉菲尼耐藥。而我們課題組前期研究已發(fā)現(xiàn)miR-181a可以通過抑制促凋亡蛋白Bim的表達來促進肝癌細胞對阿霉素的耐藥性[13]?？鄥⑺?，是從豆科槐屬植物苦參中提取分離出的一種生物堿，以氧化苦參堿為主，并含有少量氧化槐果堿?？鄥⑺卦隗w外具有抑制人肝癌細胞HepG2增殖、侵襲和遷移能力的能力[14]，用于晚期肝癌患者和肝功能嚴重失代償無法耐受其他治療的患者，可改善機體全身狀況，延長生命。近年來也有研究表明苦參素有逆轉(zhuǎn)腫瘤MDR的作用[15-16]，我們課題組前期研究也發(fā)現(xiàn)，苦參素可以通過調(diào)控ABCG2的表達來提高阿霉素抗人肝癌耐藥裸鼠移植瘤的療效[17]。

近年研究發(fā)現(xiàn)，miR-181a與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，并參與多種腫瘤化療耐藥，我們課題組已對苦參素抗腫瘤作用研究多年，發(fā)現(xiàn)其具有抗肝癌作用和部分逆轉(zhuǎn)肝癌細胞耐藥作用。故本實驗以人肝癌細胞耐藥株HepG2/ADM皮下移植瘤裸鼠為研究對象，利用HE染色法、免疫組化法、Western-blot法、實時熒光定量PCR法等技術(shù)，在體內(nèi)環(huán)境中研究苦參素及miR-181a對人肝癌細胞耐藥株HepG2/ADM裸鼠移植瘤中耐藥蛋白P-gp的影響，從而探討苦參素及miR-181a在肝癌化療耐藥中的作用。實驗發(fā)現(xiàn)，與空白對照組相比，miR-181a mimic組的P-gp蛋白及ABCB1基因的表達提高，而苦參素組的P-gp蛋白及ABCB1基因的表達降低；與miR-181a mimic組相比，加入苦參素的苦參素+miR-181a mimic組P-gp蛋白及ABCB1基因的表達降低。所以miR-181a在裸鼠體內(nèi)可能參與調(diào)節(jié)肝癌細胞對化療藥的敏感性，能夠通過促進P-gp蛋白的表達而提高其多藥耐藥性，而苦參素可在裸鼠體內(nèi)通過抑制P-gp蛋白的表達，從而逆轉(zhuǎn)肝癌耐藥細胞HepG2/ADM的耐藥性。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)，苦參素在體內(nèi)環(huán)境中不僅可以抑制人肝癌耐藥移植瘤的生長，還可提高人肝癌耐藥細胞對化學(xué)治療藥的敏感性，而miR-181a在體內(nèi)環(huán)境中可以促進人肝癌耐藥移植瘤的生長，提高人肝癌耐藥細胞的多藥耐藥性。這一研究進一步探討了苦參素逆轉(zhuǎn)肝癌化療耐藥的機制，為肝癌的分子治療提供理論和實驗依據(jù)。