骨骼發(fā)育中骨骼干細胞的鑒定

石玉

口腔疾病研究國家重點實驗室 國家口腔疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心四川大學(xué)華西口腔醫(yī)學(xué)院 成都 610041

骨是骨骼系統(tǒng)的核心組成部分，因結(jié)構(gòu)高度礦化而具有堅固而穩(wěn)定的特性。骨骼的功能除保護重要器官以及幫助人體自由運動外，骨髓腔內(nèi)存在大量的生命活動所必需的造血細胞；同時，骨骼可分泌調(diào)節(jié)碳水化合物和礦物質(zhì)離子代謝的激素，提供大量的鈣和磷酸鹽儲備，可用于調(diào)節(jié)全身性礦物質(zhì)離子穩(wěn)態(tài)。因此，骨骼結(jié)構(gòu)內(nèi)多種不同類型細胞相互作用，使骨骼具有眾多重要功能。骨骼細胞處于一個高度復(fù)雜、密閉的硬組織包圍的環(huán)境中，導(dǎo)致在技術(shù)和概念上嚴(yán)重制約了對其中各類細胞的研究。

骨骼干細胞是處于骨骼細胞分化鏈條上游的重要細胞群，其研究成為硬組織領(lǐng)域的重點和難點之一。目前，對骨骼干細胞尚無明確且統(tǒng)一的鑒定標(biāo)準(zhǔn)；骨骼細胞譜系的復(fù)雜性以及缺乏對骨骼干細胞特異性標(biāo)志物的掌握，也阻礙了對這些重要細胞群的理解。不過可以確定的是，以往認(rèn)為一種或幾種類型的全能干細胞就可以協(xié)調(diào)骨骼發(fā)育和再生的想法并不準(zhǔn)確，當(dāng)前的觀點更支持多種不同類型的骨骼干細胞相互協(xié)作并共同分化形成骨組織。

1 骨骼發(fā)育

在骨骼系統(tǒng)中，最為主要的細胞類型是前成骨細胞（pre-osteoblast）、成骨細胞（osteoblast）、骨襯細胞（bone lining cell）以及骨細胞（osteocyte），這些細胞都是由骨骼干細胞（skeletal stem cell）分化形成的不同階段的骨骼譜系細胞（osteoblast lineage cell）[1]。目前公認(rèn)的觀點是，骨骼干細胞位于骨骼譜系細胞的上游，通過復(fù)雜且精細的調(diào)控，形成這些前期或者終末分化狀態(tài)的細胞。目前所知的干細胞的特征是具有兩種重要功能：1）自我更新，即在保持其特性的同時進行自我復(fù)制的能力；2）多向分化潛能，即向多種類型細胞分化的能力。骨骼在其整個生命周期中經(jīng)歷了許多生物學(xué)上重要的步驟，例如形態(tài)發(fā)生和發(fā)育、激增性增長和功能成熟、穩(wěn)態(tài)維持以及組織結(jié)構(gòu)的再生與修復(fù)。在每個步驟中，骨骼干細胞都會提供新鮮的具有生物活性的骨細胞，保持骨骼的強度和功能。

在不同的胚胎期骨形成生理解剖位置，研究者發(fā)現(xiàn)顱頜面骨處的骨骼干細胞來源于神經(jīng)嵴細胞（neural crest cell）；軀干骨處的骨骼干細胞來源于近軸中胚層（paraxial mesoderm）；四肢骨處的骨骼干細胞來源于側(cè)板中胚層（lateral plate mesoderm）。根據(jù)骨骼發(fā)育方式，骨形成可分為膜內(nèi)成骨（intramembranous ossification）和軟骨內(nèi)骨化（endochondral ossification）[2]。在傳統(tǒng)意義上，膜內(nèi)成骨是指骨骼干細胞聚集并直接形成骨細胞的過程，主要是顱頜面骨以及鎖骨的形成方式；軟骨內(nèi)骨化是指骨骼干細胞聚集形成軟骨組織和包圍在其外的軟骨膜細胞，軟骨細胞增殖進而肥大，激活重要的分化信號通路[例如Indian Hedgehog（IHH）等]，隨后促進軟骨膜細胞逐漸形成骨細胞，主要發(fā)生在四肢骨以及軀干骨部位[2]。在骨發(fā)育過程中，眾多轉(zhuǎn)錄因子發(fā)揮關(guān)鍵作用，比如軟骨形成過程中的Sox9基因，骨細胞早期的關(guān)鍵分子Osx、ATF4以及Runx2等。干細胞成骨分化過程又受到局部信號分子Wnt、Notch、骨形態(tài)發(fā)生蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）以及Hedgehog通路調(diào)節(jié)；同時全身系統(tǒng)性的調(diào)控（如PTH、Fgf23等）也可以促進骨-牙等硬組織形成[1]。

2 骨骼干細胞的傳統(tǒng)鑒定方式

基于恢復(fù)人體骨組織功能的再生醫(yī)學(xué)及組織工程學(xué)的發(fā)展大大地推動了對于骨骼干細胞的研究。近年來，對于骨骼干細胞的認(rèn)識來源于人類和嚙齒類動物骨髓細胞的實驗?！凹毎捏w外培養(yǎng)鑒定”以及“細胞異體移植至裸鼠體內(nèi)進行檢測”已經(jīng)作為鑒定骨髓來源干細胞的金標(biāo)準(zhǔn)。體外鑒定主要指研究細胞是否具有多向分化潛能以及克隆形成能力；異體移植檢測主要觀察細胞移植至裸鼠體內(nèi)后可否形成骨組織[3]。

發(fā)現(xiàn)骨髓中存在具成骨能力干細胞的實驗要追溯到20世紀(jì)60年代。這項實驗中，F(xiàn)riedenstein等[4]發(fā)現(xiàn)將人類骨髓細胞皮下移植到免疫缺陷小鼠體內(nèi)時，這些細胞最終形成了包含微血管的小骨組織。隨后發(fā)現(xiàn)一種具有單克隆形成能力的成纖維樣細胞，命名為克隆形成單位-成纖維細胞（colony-forming unit fibroblast，CFU-F），其具有成骨向分化能力，也是異體移植后形成小骨組織的細胞來源[5]。與此類似，來自嚙齒動物的骨髓細胞同樣具有相似的特性。當(dāng)時，學(xué)者們認(rèn)為存在于人和嚙齒動物骨髓中的CFU-F是骨骼干細胞。盡管CFU-F在體外培養(yǎng)條件下普遍具有相似的克隆形成能力，但在基因表達和功能上具有高度異質(zhì)性。實際上，只有一部分CFU-F具有自我更新和多向分化能力，可以在體外多向分化為成骨細胞、軟骨細胞和脂肪細胞，或形成異體移植后的小骨組織[6]。根據(jù)目前的定義，骨骼干細胞其實僅僅是CFU-F的一個子集[7]。更為重要的是，單一克隆的CFU-F在移植到裸鼠體內(nèi)后，小骨形成的效率大大降低[6]，這表明不同的CFU-F之間可以相互依存，功能上可以相互補充，更有利于體內(nèi)重建造血微環(huán)境和骨組織，這是單一CFU-F無法實現(xiàn)的。

在供體體內(nèi)，無法直接區(qū)分CFU-F與骨骼干細胞，只能利用體外培養(yǎng)再通過異體移植實驗進行清楚的鑒別，因此干細胞表面分子標(biāo)志物的引入為骨骼干細胞的鑒定提供了重要的研究手段。

3 骨骼干細胞表面分子標(biāo)志物

長期以來，單克隆抗體和流式細胞分選技術(shù)一直用于鑒定非培養(yǎng)狀態(tài)下的間充質(zhì)干細胞。在人類細胞中，細胞表面分子CD271被證明可以標(biāo)記所有3個胚層的細胞，包括非神經(jīng)細胞類型[8]。隨后，研究者[9]發(fā)現(xiàn)，CD271甚至在造血活動出現(xiàn)之前就標(biāo)記了成人和胎兒骨髓中的基質(zhì)細胞。在人類骨髓細胞中，CD271可以單獨或與其他細胞表面標(biāo)志物一起富集CFU-F[10-12]。

STRO-1抗體被發(fā)現(xiàn)可以鑒定和富集人源骨髓間充質(zhì)細胞[13]。

在Bianco團隊[6]的一項重要研究中，細胞表面分子CD146被證明可以標(biāo)記處于骨髓中竇狀血管外膜上的網(wǎng)狀細胞（reticular cell），這些CD146陽性細胞中富含CFU-F，并能夠在移植到裸鼠體內(nèi)后形成有血管存在的異位骨。更為重要的是，將這個異位骨組織進行酶解、消化后，收集到的細胞可在體外培養(yǎng)并形成單克隆集落，從而證明了CD146陽性細胞在體內(nèi)的自我更新能力[6]。進一步的研究[14]表明，CD51、血小板衍生生長因子受體α（platelet-derived growth factor receptor α，PDGFRα）雙陽性細胞只是CD146陽性細胞中的一小部分，其具有更強的克隆形成能力。PDGFRα、干細胞抗原-1（stem cell antigen-1，Sca-1）雙陽性非造血細胞（PαS細胞）在體內(nèi)位于血管周圍空間，同時在體外可以形成單克隆[15]。如果將這些細胞在非培養(yǎng)狀態(tài)下與造血干細胞共移植到受輻射照射的受體小鼠體內(nèi)，可以分化為成骨細胞、基質(zhì)細胞、脂肪細胞；更重要的是這群細胞同樣高表達PDGFRα與Sca-1。這些結(jié)果表明PαS細胞在體內(nèi)具有自我更新的能力，是一群骨骼干細胞。

隨后的研究[16]表明，在人類骨髓中，CD271高表達的具有克隆形成能力的細胞在體外展現(xiàn)出多向分化潛能，并且在體內(nèi)可以分化為骨小梁區(qū)域的骨細胞。CD271、CD146雙陽性細胞群體具有異體移植后成骨的特征。

其他實驗[17]表明，CD271、Thy1（CD90）和VCAM-1（CD106）組合可富集CFU-F。此外，將未培養(yǎng)的CD271、Thy1雙陽性細胞移植到裸鼠體內(nèi)后，可以在其骨髓中檢測到這群細胞的存在，說明了這群細胞屬于骨骼干細胞。

此外，將骨小梁周圍結(jié)締組織生長因子（connective tissue growth factor，CTGF）陽性間充質(zhì)干細胞分化形成的間充質(zhì)細胞移植到體內(nèi)，同樣具備干細胞特性[18]。最新的研究成果[19]顯示，在小鼠腿骨中，應(yīng)用CD51（αV integrin）、CD90（Thy）、CD105（endoglin）以及CD200（OX2）可以分離骨骼干細胞。在人體骨骼中發(fā)現(xiàn)的PDPN（Podoplanin）陽性、CD146陰性、CD73陽性、CD146陽性的細胞為人源骨骼干細胞[20]。類似的，許多其他標(biāo)志物可以作為骨骼干細胞的細胞表面標(biāo)志分子，例如Sca-1以及α-平滑肌肌動蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）。因此，將干細胞表面標(biāo)志物、細胞體外鑒定以及細胞異體移植實驗相結(jié)合的研究手段對骨骼干細胞的鑒定提供了更為全面的信息。

4 利用轉(zhuǎn)基因小鼠鑒定骨骼干細胞

研究者也應(yīng)用遺傳學(xué)手段將特定的標(biāo)記分子（例如可表達特異顏色熒光蛋白的基因或編碼β-半乳糖苷酶的lacZ等）克隆到特異基因位點的3"端，并構(gòu)成新型轉(zhuǎn)基因小鼠。在這種轉(zhuǎn)基因小鼠體內(nèi)，當(dāng)某種細胞表達特異基因時，該基因所連結(jié)的標(biāo)記分子也隨之表達，因而達到標(biāo)記這群細胞的目的。

使用綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）標(biāo)記的Nestin-GFP轉(zhuǎn)基因小鼠是首先被用于研究骨髓多能間充質(zhì)干細胞的小鼠模型。在該模型內(nèi)，GFP的表達受到Nestin基因表達的調(diào)控[21]。Nestin是一種中間絲蛋白，是神經(jīng)干細胞的標(biāo)志物。Nestin-GFP在圍繞骨髓小動脈的細胞中高表達，而骨髓中的Nestin-GFP陽性細胞具有克隆形成能力，可形成具有自我復(fù)制能力的“間充質(zhì)球”，并具有多次異體移植能力[22]。Nestin-GFP陽性細胞中的CD51、PDGFRα雙陽性亞群具有更強的克隆形成能力[23]。隨后，在Nestin-GFP標(biāo)記的細胞群體內(nèi)發(fā)現(xiàn)2個不同的亞群，Nestin-GFP高表達的細胞亞群比較罕見，僅位于小動脈周圍，具有更強的克隆形成能力且常常處于靜止?fàn)顟B(tài)；Nestin-GFP低表達的細胞亞群數(shù)量較多，呈網(wǎng)狀，主要分布在動脈竇小血管附近，表達高豐度的瘦素受體（leptin receptor，LepR）[14]。

趨化因子（CXC基序）配體[chemokine （CX-C motif ）ligand，CXCL]12是趨化因子（CXC基序）受體[chemokine（C-X-C motif）receptor，CXCR]4的配體，在造血階段的初期和中期發(fā)揮重要作用[24-26]。在CXCL12-GFP轉(zhuǎn)基因小鼠體內(nèi)發(fā)現(xiàn)，骨小梁上網(wǎng)狀細胞高表達GFP（代表高表達CXCL12），因此將該細胞群命名為CXCL12豐富網(wǎng)狀（CXCL12 abundant reticular，CAR）細胞；而在內(nèi)皮細胞和成骨細胞中，GFP表達水平很低甚至檢測不到（代表CXCL12低表達）[25]。對CAR細胞的深層次研究[27]表明，該細胞群除表達常規(guī)骨骼干細胞的細胞表面分子（例如VCAM1、CD44、CD51、PDGFRα和PDGFRβ）外，還是干細胞因子（stem cell factor，SCF）的主要分泌來源。基因表達分析表明，該群細胞在體外和體內(nèi)均表現(xiàn)出成骨向和成脂肪分化的能力。

圖1中,設(shè)定輸入光場為Ein,輸出光場為Eout,諧振腔內(nèi)耦合區(qū)域前后的光場分別為E1和E2,耦合區(qū)域的耦合系數(shù)和透射系數(shù)分別為k和t。k與t滿足k2+t2=1。輸出端的光功率為Iout=|Eout|2,輸出端的光功率為Iin=|Ein|2。φ代表諧振器的往返相位,L是諧振器周長,β是傳播常數(shù),φ=βL。那么反射式光波導(dǎo)諧振腔的傳遞函數(shù)表示為

5 利用體內(nèi)譜系追蹤方式鑒定骨骼干細胞

目前，研究特定細胞在體內(nèi)生理情況下的分化及維持的金標(biāo)準(zhǔn)是使用轉(zhuǎn)基因小鼠的譜系追蹤（lineage tracing）實驗。使用該方法在體內(nèi)研究細胞譜系時，對機體不會產(chǎn)生任何損傷，因此非常適合研究發(fā)育過程。

通常，譜系追蹤實驗通過Cre-LoxP技術(shù)用生物系統(tǒng)永久性標(biāo)記感興趣的細胞。 Cre重組酶在第一個轉(zhuǎn)基因中以啟動子/增強子特異性方式表達，并在第二個轉(zhuǎn)基因中作用于處于Rosa26基因座的報告基因位點。在該基因座中，包含polyA序列在內(nèi)的多個序列以及翻譯終止密碼子（“STOP”序列），阻止了報告基因的繼續(xù)轉(zhuǎn)錄和翻譯。這些“STOP”序列的兩側(cè)是loxP位點，當(dāng)Cre重組酶作用于Rosa26基因座并除去“STOP”序列時，報告基因在特異性啟動子的指導(dǎo)下表達，因此可以將表達特異性啟動子/增強子的細胞進行標(biāo)記。

改良的譜系追蹤版本利用遺傳學(xué)手段將報告基因與Cre-ERT轉(zhuǎn)基因放在同一個實驗小鼠體內(nèi)，這樣既可以保證報告基因在特定細胞內(nèi)表達（何處表達），又可以通過外源藥物控制基因在特定時間表達（何時表達）。Cre-ERT小鼠是一類可表達雌激素受體的配體結(jié)合區(qū)突變體（ERT）與Cre重組酶的融合蛋白的小鼠。在未受他莫昔芬（tamoxifen）誘導(dǎo)的情況下，Cre-ERT在細胞質(zhì)內(nèi)處于無活性狀態(tài)；當(dāng)轉(zhuǎn)基因小鼠受他莫昔芬誘導(dǎo)后，他莫昔芬的代謝產(chǎn)物4-羥基他莫昔芬（雌激素類似物）與ERT結(jié)合，可使Cre-ERT進入細胞核，發(fā)揮Cre重組酶活性。在體內(nèi)，他莫昔芬的有效時間有限，一般在24～48 h內(nèi)可以暫時激活CreloxP重組系統(tǒng)，然后逐漸被細胞清除。因為在報告基因位點發(fā)生的重組是不可逆的，即使驅(qū)動Cre重組酶表達的啟動子不再具有活性，只要表達Cre的細胞存活下來，報告基因就會在靶細胞及其后代中持續(xù)表達。這就是小鼠體內(nèi)譜系追蹤的簡要工作原理。

目前，對于標(biāo)記分子已開發(fā)出了幾種版本、經(jīng)修飾的Rosa26報告基因等位基因，包括R26R-lacZ（編碼β-半乳糖苷酶）、R26R-YFP[編碼黃色熒光蛋白（yellow fluorescent protein，YFP）]、R26R-tdTomato（編碼紅色熒光蛋白的串聯(lián)二聚體，DsRed）和R26R-Confetti。最后一個等位基因編碼4種不同的熒光蛋白，即核GFP、YFP、tdTomato和藍綠色熒光蛋白（blue-green fluorescent protein，CFP）。 應(yīng)該注意的是，每個版本都有其自身的優(yōu)點和缺點。例如，盡管R26R-Confetti等位基因提供了4種可能對體內(nèi)克隆分析有用的顏色，但是轉(zhuǎn)基因設(shè)計的復(fù)雜性要求loxP切除和倒置，該等位基因?qū)re-loxP重組相對不敏感。

雖然利用體內(nèi)譜系追蹤技術(shù)研究干細胞還處在初期階段，但是越來越明顯的是，骨髓并不是骨骼干細胞所處的唯一環(huán)境，胚胎期也不是干細胞存在的唯一時期。在骨骼中的其他重要位置（例如骨膜和生長板），在發(fā)育的不同時間段甚至是成體中，也存在著具有不同功能的骨骼干細胞亞群。

5.1 機體發(fā)育早期階段的骨骼干細胞鑒定

在發(fā)育的早期階段，局部的干細胞出現(xiàn)并分化成間充質(zhì)干細胞，隨后發(fā)生聚集和進一步分化。在四肢發(fā)育過程中，骨骼細胞來源于側(cè)板中胚層。因為轉(zhuǎn)錄因子Prrx1在這些中胚層細胞中表達，對這一時期的研究多應(yīng)用Prrx1-Cre轉(zhuǎn)基因小鼠。其中Cre重組酶在2.4 kb的Prrx1啟動子調(diào)控下表達，基本上標(biāo)記了后期所有肢體間充質(zhì)細胞（包括軟骨細胞、軟骨膜細胞、成骨細胞和基質(zhì)細胞），但不標(biāo)記肌肉細胞[28]。Sox9基因在間充質(zhì)細胞聚集期表達，并刺激Ⅱ型膠原（collagen 2，Col2）的產(chǎn)生。Sox9-Cre和Col2-Cre都以與Prrx1-Cre類似的方式標(biāo)記幾乎所有的軟骨細胞、軟骨膜細胞和成骨細胞[29]。

Osx（Sp7）是骨骼形成的重要調(diào)控因子，用成骨特異的Cre敲除Osx基因，會導(dǎo)致骨骼形成缺陷。在胚胎期標(biāo)記Osx陽性細胞，其子代細胞可以在新生期階段分化為骨細胞以及間充質(zhì)細胞，但隨著機體的成長，這群細胞最終消失，不能繼續(xù)形成骨骼系統(tǒng)[32]。

5.2 新生兒階段的骨骼干細胞鑒定

與胚胎期時標(biāo)記的Osx陽性細胞不同，在小鼠出生后第5 d標(biāo)記的Osx陽性細胞可以在小鼠一生中持續(xù)分化為骨細胞、間充質(zhì)細胞以及骨髓脂肪細胞。這說明，在機體內(nèi)Osx基因呈現(xiàn)多次高表達，而每次表達標(biāo)記的細胞種類并不相同。

Gremlin 1（Grem1）是一種BMP拮抗劑，在血管周圍的骨髓基質(zhì)細胞中表達[33]。使用Grem1-CreERt進行的譜系追蹤實驗表明，這些細胞可以分化為成骨細胞、軟骨細胞和網(wǎng)狀基質(zhì)細胞，但不能分化為骨髓脂肪細胞，因此被命名為“骨-軟骨-網(wǎng)狀細胞共同的干細胞（osteo-chondro-reticular，OCR）”[34]。Sox9-CreERt2、Col2-Cre-ERt2以及Aggrecan-CreERt2陽性細胞在新生兒期被標(biāo)記后，與Osx陽性細胞具有相似的分化能力[35]。但值得注意的是，傳統(tǒng)意義上軟骨細胞的特異標(biāo)志基因Sox9、Col2以及Aggrecan所標(biāo)記的干細胞具有成骨向分化能力，在一定程度上揭示了干細胞的來源不僅僅局限在骨髓腔內(nèi)。

5.3 機體成年階段的骨骼干細胞鑒定

在成年期Nestin-CreERt2轉(zhuǎn)基因小鼠，可以標(biāo)記到一類隨后可分化為骨細胞、脂肪細胞以及骨髓基質(zhì)細胞的骨骼干細胞；此外，還可以標(biāo)記內(nèi)皮細胞，這一特性不利于后期實驗中對于特定表型的分析與解釋。

LepR由動脈竇血管和小動脈周圍的骨髓基質(zhì)細胞表達。使用LepR-Cre轉(zhuǎn)基因小鼠進行基因體內(nèi)追蹤實驗，結(jié)果表明這些LepR陽性細胞可以分化為成年小鼠（尤其是年齡大于2個月的成年小鼠）骨骼中的大部分具有克隆形成能力的細胞，其中包括成骨細胞和骨髓脂肪細胞等[36]。與胚胎期相似，成年小鼠中的Gli1-CreERt2陽性細胞可以分化為成骨細胞、脂肪細胞以及LepR陽性的間充質(zhì)細胞[30]。但是，成年期Osx陽性細胞的成骨向分化能力有限[32]。

小鼠骨髓Mx-1陽性細胞具有體外多向分化能力，但是在體內(nèi)的分化潛力有限，僅標(biāo)記了不到5%的骨髓脂肪細胞。同樣的，在骨折損傷修復(fù)過程中，新形成的軟骨組織中并未檢測到Mx-1陽性細胞。這些結(jié)果證明，Mx-1陽性細胞是具有有限分化能力的前體細胞，能夠在體外持續(xù)分化為成骨細胞，但無法滿足骨骼干細胞的全部特性[37]。

5.4 其他部位骨骼干細胞鑒定

除骨髓腔之外，外骨膜、軟骨膜以及生長板處也存在骨骼干細胞。軟骨膜處骨骼干細胞同樣具備CFU-F特性，有克隆形成能力，同時具有高度的再生能力。體內(nèi)譜系追蹤實驗[38-39]表明，以Prrx1-CreERt和αSMA-CreERt標(biāo)記的軟骨膜細胞可以參與骨折損傷后的修復(fù)，并快速生成軟骨細胞和成骨細胞。顱面骨的骨縫與軟骨膜有些相似，被認(rèn)為是適合骨骼干細胞存在的微環(huán)境。譜系追蹤實驗[40-41]表明，以Gli1-CreERt2和Prrx1-CreERt標(biāo)記的骨縫間充質(zhì)細胞、切牙干細胞等可以促進硬組織的正常更新和再生。Greenblatt團隊新近研究[42]證實，大量骨骼干細胞（Cathepsin K陽性細胞）存在于外骨膜處，不僅可形成成骨細胞，而且在骨折后對愈傷組織的形成起重要作用，但這群細胞并不支持造血功能。在生長板頂部存在著一群緩慢分裂的細胞，通常被稱為靜止區(qū)細胞，其高表達甲狀旁腺激素相關(guān)蛋白（parathyroid hormone-related peptide，PTHrP）。有研究者[43]推測靜息區(qū)存在干細胞，可以形成增殖的軟骨細胞克隆，并平行于長骨形成方向分泌促分化的細胞因子，這部分假設(shè)由在兔體內(nèi)進行的自體移植組織實驗所證實。最近，研究者[44]使用PTHrP-CreERt2譜系追蹤實驗證實了這一發(fā)現(xiàn)，PTHrP陽性軟骨細胞長期持續(xù)形成柱狀軟骨細胞，經(jīng)歷肥大過程并成為生長板下方的成骨細胞和骨髓基質(zhì)細胞。

6 總結(jié)

骨骼干細胞成骨向分化是機體骨骼-牙齒等硬組織形成的關(guān)鍵步驟。在生命進程的早期，發(fā)育相對活躍；而在成年期，骨骼必須保持多種細胞結(jié)構(gòu)以應(yīng)對機體變化，從骨小梁的快速更迭到骨皮質(zhì)的緩慢重建，并在出現(xiàn)裂縫或骨折時進行硬組織修復(fù)。因此，在胚胎期的骨髓和軟骨膜、新生期的生長板靜止區(qū)、成年期的骨髓腔和骨膜中都存在多種局部的骨骼干細胞，這些骨骼干細胞具有獨特的生物學(xué)性質(zhì)和功能，受局部因素和激素的調(diào)節(jié)。

本文淺談了利用目前已知的干細胞表面標(biāo)志分子和體內(nèi)譜系追蹤等方法來鑒定骨骼干細胞的科研進展。盡管越來越多的研究者關(guān)注這一領(lǐng)域，但對于不同骨骼干細胞之間的關(guān)系仍了解甚少。值得注意的是，目前了解的骨骼干細胞主要是通過表達一種特異基因的啟動子的方式來鑒定的，在體內(nèi)鑒定出的大多數(shù)干細胞群異質(zhì)性非常大。 因此，今后需要尋找更為準(zhǔn)確的在體內(nèi)鑒定骨骼干細胞的實驗方式，并有效地與已闡明的骨骼干細胞標(biāo)志物相結(jié)合，可以為硬組織再生醫(yī)學(xué)以及損傷修復(fù)的組織工程應(yīng)用帶來巨大的幫助。