王偉科，宋吉玲，陸 娜，袁衛(wèi)東，閆 靜，陳觀平

(1.杭州市農業(yè)科學研究院，浙江 杭州 310024； 2.浙江省中醫(yī)藥研究院，浙江 杭州 310012)

食用菌從營養(yǎng)生長轉變?yōu)樯成L需經歷菌絲萌發(fā)到原基扭結再分化成子實體這一形態(tài)上的巨大變化，其中原基扭結形成是菌絲體向子實體轉變的一個重要節(jié)點。但食用菌原基形成分化機制目前尚不明確，因此開展與食用菌結實相關基因的研究對于了解食用菌子實體生長發(fā)育機理、選育品種及控制出菇環(huán)境均具有重要意義。

分子生物學和生物信息學的快速發(fā)展，為食用菌子實體發(fā)生的分子機理研究提供了新思路和新方法，使子實體發(fā)生的遺傳機制研究取得了重要進展[1]。馬愛民等[2]采用RAP-PCR差異顯示技術對平菇菌絲體及原基、菇蕾和成熟子實體進行研究，獲得了在原基階段差異表達的3條cDNA片段POD1、POD2與POD3，其中POD3片段為HSP70基因片段，說明熱激蛋白在原基形成期起到重要作用。Yamada等[3]利用熒光差異顯示技術在金針菇(Flammulina.velutipes)中發(fā)現(xiàn)了Fv-hyd1基因(編碼疏水蛋白)，Northern雜交結果表明，該基因在菌絲生長期不表達，但在原基形成期間表達量顯著升高，同時在子實體成熟期表達水平也較高，從而推測其對金針菇結實具有調控作用。韓星、仝宗軍等[4-5]基于金針菇轉錄組數(shù)據(jù)對轉運蛋白基因fvopt1、fvopt2以及fv-mfs1開展序列和表達分析，發(fā)現(xiàn)上述基因在金針菇原基和子實體發(fā)育過程中發(fā)揮作用。周爍紅等[6]從構建的肺形側耳變溫結實相關消減雜交文庫中篩選到一個代表csl基因部分序列的EST，并通過TAIL PCR技術克隆了Pp-csl1基因，熒光定量檢測結果表明，該基因在菌絲經過5 ℃ 12 h冷處理之后的表達量最高，說明其有可能被冷刺激誘導表達并在子實體形成過程中起重要作用。上述研究均為揭示子實體發(fā)生的遺傳機制奠定了基礎。

本實驗前期研究中對秀珍菇低溫誘導后樣本及恢復到室溫后原基形成前期樣本進行轉錄組測序，并對其中的差異表達基因進行分析，發(fā)現(xiàn)基因ID為Cluster-6377.64510的基因(命名為PpFBD1)在原基形成前期的樣本中高度表達，經基因注釋及Swissprot描述，推測其很可能在原基形成中起重要作用。同時，利用生物信息學技術獲得該基因的序列全長，并設計合成了相關引物，利用逆轉錄PCR技術首次克隆了該基因，并對基因序列、表達和功能進行了初步分析，為進一步深入研究該基因及其可能參與的原基形成調節(jié)功能提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與處理

秀珍菇菌株臺秀5766由浙江臨安鼎新生物科技有限公司提供。母種采用PDA培養(yǎng)基。菌包培養(yǎng)基配方為雜木屑400 g·kg-1、棉籽殼400 g·kg-1、麩皮180 g·kg-1、石膏10 g·kg-1、石灰10 g·kg-1。菌包接種后于26～28 ℃條件下避光培養(yǎng)，待菌絲長滿菌包后(40～45 d)，選取生長良好、狀態(tài)一致的菌包開展試驗。取樣分4組，每組10包，分別記為S0、S1、S2、S3。

S0，菌絲滿袋后，挑取發(fā)菌良好的菌包料面菌絲體10 g，立即置于-80 ℃超低溫冰箱保存；S1，菌絲滿袋后，發(fā)菌良好的菌包置于10 ℃條件下12 h，按S0方法取樣保存；S2，菌絲滿袋后，發(fā)菌良好的菌包置于10 ℃ 條件下12 h，再待其恢復到室溫狀態(tài)后，按S0方法取樣保存；S3，經S0、S1、S2階段后，原基形成期取原基10 g，立即置于-80 ℃超低溫冰箱保存。

1.2 試驗方法

1.2.1 總RNA的提取

采用Trizol法進行樣本總RNA的提取[7]，樣本經液氮研磨后Trizol裂解，離心棄沉淀，上清加入氯仿/異戊醇，振蕩混勻，離心。上清加入1∶1的異丙醇，沉淀RNA。離心棄上清，沉淀經75%乙醇洗滌后溶于50 μL DEPC水中。

1.2.2 cDNA的合成

總RNA經1.2%瓊脂糖凝膠電泳及核酸分析儀檢測純度和濃度后，按照Bio-Rad公司的iScript cDNA Synthesis Kit合成cDNA。

1.2.3 基因克隆

根據(jù)RNA-seq測序結果，選取PpFBD1基因序列。并運用引物設計軟件Primer Premier 5.0設計相關引物如下：上游引物為5＇-ATGTTCTCCATCCGCATCTCC-3＇，下游引物為5＇-CGCCCATCAAACTCCTCTAA-3＇。

以反轉錄后獲得的cDNA為模板進行PCR擴增，以Thermo Fisher的AccuPrimePfxDNA Polymerase為擴增酶，建立25 μL反應體系：10×Pfx緩沖液2.5 μL，50 mmol·L-1MgSO40.5 μL，25 mmol·L-1dNTP 1.0 μL，10 mmol·L-1引物各1.0 μL，cDNA模板5.0 μL，PfxDNA Polymerase 0.5 μL，ddH2O 13.5 μL。

反應條件為：93 ℃預變性3 min；93 ℃ 30 s，53 ℃ 30 s，72 ℃延伸30 s，30個循環(huán)；72 ℃延伸7 min。擴增產物經1.2 %瓊脂糖電泳后，用DNA膠回收試劑盒純化回收。連入T載體(PMD18-T，TaKaRa)，轉化大腸埃希菌菌株JM109，藍白斑篩選，提取質粒DNA進行酶切鑒定，陽性克隆送北京擎科生物技術有限公司測序。

1.2.4 基因的生物信息學分析

主要采用http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast、http://www.bio-soft.net/sms/index.html、http://amigo.geneontology.org/、http://www.uniprot.org 等網上軟件包進行生物信息學分析。使用Vector NTI軟件對序列進行多重比對，并用MEGA 5.0軟件構建進化樹。

1.2.5 基因表達分析

試劑盒提取秀珍菇S0、S1、S2、S3四個階段總RNA，并按照iScript cDNA Synthesis Kit合成cDNA，根據(jù)PpFBD1基因序列設計出特異性qRT-PCR引物(表1)，以Actin作為內參基因，用qRT-PCR的方法檢測PpFBD1基因在秀珍菇不同采樣階段的相對表達量[8]。PpFBD1和Actin的退火溫度均為53 ℃，每個樣品設3重復。按2-ΔΔCt法計算基因相對表達量。

2 結果與分析

2.1 PpFBD1序列的獲得及序列分析

表1 qRT-PCR反應引物序列Table 1 Primer sequence of qRT-PCR

利用RT-PCR技術從秀珍菇中得到350 bp左右的DNA片段，克隆至PMD18-T載體后測序，將測序結果與GenBank中登錄基因進行同源性比較分析，獲得342 bp全長序列，命名為PpFBD1。BLAST顯示其與糙皮側耳hydrophobin1基因(GenBank：Y14656.1)100%相似。

通過ORF Finder尋找PpFBD1的開放讀碼框，顯示其包含1個342 bp的ORF框，推斷其為編碼113個氨基酸的功能蛋白。由Vector NTI軟件推算該編碼蛋白的相對分子質量約為11 ku。SMART工具預測顯示該蛋白質C端含有一個由77個氨基酸組成的保守區(qū)域(HYDRO)，說明所獲基因屬于疏水蛋白家族。

2.2 PpFBD1基因編碼蛋白系統(tǒng)進化分析

利用MEGA5.0 軟件對秀珍菇PpFBD1基因編碼氨基酸序列開展進化樹分析，顯示秀珍菇PpFBD1編碼的蛋白與糙皮側耳同源蛋白親緣關系最近，與其他真菌同源蛋白的親緣關系較遠(圖1)

2.3 PpFBD1的GO功能分析

GO功能分析顯示，PpFBD1編碼蛋白為細胞壁的結構成分(圖2)，其主要參與了真菌類細胞壁的合成。

2.4 不同生長階段秀珍菇PpFBD1的表達情況

在秀珍菇生長發(fā)育過程中的4個不同階段PpFBD1均有表達。其中，S1階段(低溫刺激階段)PpFBD1的表達量要高于S0階段，說明低溫刺激對PpFBD1的表達起一定程度的誘導作用；而S2階段(原基形成前期)PpFBD1的表達量明顯要高于S0及S1階段，說明PpFBD1雖然受一定程度的低溫誘導，但更有可能是原基形成的小分子誘導蛋白；S3(原基形成期)階段其表達量又有所下降，進一步說明其可能在促使原基扭結形成這一過程中發(fā)揮重要作用。

圖1 秀珍菇PpFBD1基因編碼氨基酸系統(tǒng)進化樹Fig.1 Phylogenetic tree of the amino acid encoded by PpFBD1 of Pleurotus pulmonarius

圖2 PpFBD1蛋白的亞細胞定位Fig.2 Subcellular location of protein encoded by PpFBD1 of Pleurotus pulmonarius

圖3 PpFBD1在秀珍菇不同生長階段表達量Fig.3 Relative expression of PpFBD1 gene in different growth stages

3 討論

秀珍菇作為一種具有重要經濟價值、食用價值和營養(yǎng)價值的食用菌類，其子實體發(fā)育分子機制的研究及發(fā)育相關功能基因的鑒定分析一直是一項復雜且具有重要理論和實際意義的工作[9-11]。

本研究基于秀珍菇轉錄組測序結果，發(fā)現(xiàn)PpFBD1在原基形成前期的樣本中高度表達。利用RT-PCR技術從秀珍菇中克隆了該基因，測序獲得核酸序列并推測了其蛋白序列。比對發(fā)現(xiàn)該基因序列與糙皮側耳hydrophobin1基因一樣。蛋白質序列包括一個HYDRO疏水保守區(qū)域，說明該基因編碼的蛋白為疏水蛋白。

研究表明，疏水蛋白具有誘導形態(tài)發(fā)育等相關功能，疏水蛋白作為天然表面活性劑，可降低水表面張力，從而使真菌菌絲突破水-空氣界面，進而誘導產生氣生菌絲結構[12-13]。Ohm等[14]通過裂褶菌(Schizophyllumcommune)的基因組和表達譜分析發(fā)現(xiàn)，在裂褶菌子實體生長發(fā)育過程菌絲扭結階段，與疏水蛋白相關的基因表達均出現(xiàn)不同程度的升高，這表明疏水蛋白在子實體生長發(fā)育過程中直接或間接起著重要作用。陳仁良等[15]通過分析金針菇不同生長發(fā)育階段的表達譜，發(fā)現(xiàn)疏水蛋白Fv-Hyd1的表達在菌絲扭結階段和原基期均升高，且遠高于其他時期，這與本次我們在秀珍菇中的研究結果相似。

本研究中發(fā)現(xiàn)的PpFBD1編碼的蛋白為小分子疏水蛋白，在秀珍菇營養(yǎng)生長到生殖生長的不同階段表達量存在明顯差異，低溫處理后原基形成前期表達量明顯要高于其他3個時期，這說明其可能與原基形成和分化有關，具體功能有待深入研究。