羅來(lái)福 鄭淑欣 劉為民 趙海全 張 暉 葉亞瓊

（佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院，生命科學(xué)與工程學(xué)院，佛山 528231）

大量文獻(xiàn)報(bào)道，畜禽胚胎發(fā)育的早期已經(jīng)有生殖腺的原基，稱為生殖嵴，它的發(fā)育與胚胎期的臨時(shí)泌尿器官—中腎密切相關(guān)。生殖腺原基在中腎內(nèi)緣處形成，以后該處體腔上皮逐漸增厚變?yōu)閳A柱形的生殖上皮，形成了隆起的生殖嵴，之后有原始生殖細(xì)胞主動(dòng)遷移進(jìn)入，然后經(jīng)歷髓質(zhì)發(fā)育而演變?yōu)椴G丸或者髓質(zhì)發(fā)育后退化萎縮，再經(jīng)歷皮質(zhì)發(fā)育而形成卵巢[1]。母雞的生殖系統(tǒng)由卵巢和輸卵管組成。在胚胎早期，左、右各有1 個(gè)卵巢和1 條輸卵管，在發(fā)育的過(guò)程中右側(cè)的退化，只有左側(cè)的卵巢和輸卵管發(fā)育成熟[2]。關(guān)于雞胚胎期以及出生后卵巢的發(fā)育變化，已有豐富的文獻(xiàn)報(bào)道，但針對(duì)廣東特產(chǎn)的優(yōu)良地方品種陽(yáng)山雞卻缺乏實(shí)際觀察資料，特別是雛雞出生后1 周內(nèi)卵巢的連續(xù)組織學(xué)觀察。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)廣東著名地方優(yōu)良品種陽(yáng)山雞出生后卵巢組織結(jié)構(gòu)的發(fā)育觀察，為陽(yáng)山雞的繁殖、生產(chǎn)性能等研究提供科學(xué)的理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 動(dòng)物來(lái)源

從本校動(dòng)物房飼養(yǎng)的陽(yáng)山雞經(jīng)人工授精產(chǎn)得的85 枚受精蛋，并在本校的科研禽場(chǎng)進(jìn)行孵化，最終孵化出65 羽小雞。剛出生的小雞及時(shí)進(jìn)行性別辨別。雌雄分開(kāi)常規(guī)飼養(yǎng)，各日齡雛雞均生長(zhǎng)發(fā)育良好。

1.2 解剖與取材

從孵出開(kāi)始，隔天宰殺小雞直至7 d 齡，即1、3、5 d 和7 d，平均每個(gè)時(shí)間組含4 只雛雞。將出生后不超過(guò)24 h 的小雞定為1 d 齡。通過(guò)頸靜脈放血致死雛雞，用剪刀將股內(nèi)連接腹側(cè)的皮膚剪開(kāi)，將小雞以背臥位平放于手術(shù)盤，暴露腹腔、胸腔，輕輕將整個(gè)腹腔內(nèi)器官向前牽拉，直至完全暴露腹腔背側(cè)部，卵巢由結(jié)締組織系于腹頂壁下方，接近中線。用剪從卵巢的底部連帶背部結(jié)締組織以及部分腎和腎上腺一起剪取而使卵巢脫離腹腔，再用剪和刀片輕輕去掉多余的結(jié)締組織，于PBS 中漂洗掉殘余的血跡，取得的卵巢組織放入10%甲醛溶液固定。

1.3 制石蠟組織切片

組織塊固定至少48 h 以上。于通風(fēng)柜廚內(nèi)修整組織塊，放入脫水框內(nèi)流水沖洗組織塊3 h，經(jīng)脫水、透明、石蠟包埋，切4～6 μm 厚的石蠟切片，62℃烤片6 h，H-E 染色，光學(xué)樹(shù)脂封片。

1.4 組織切片觀察

使用顯微鏡進(jìn)行高、低倍對(duì)照觀察，并把觀察結(jié)果以照片形式拍下。

2 結(jié)果

2.1 解剖觀察

雛雞右側(cè)卵巢大約于5 d 齡開(kāi)始退化，而左側(cè)卵巢繼續(xù)發(fā)育成為功能性卵巢。卵巢形狀為扁橢圓形，分為兩葉，顏色為灰白色。

2.2 卵巢的組織結(jié)構(gòu)

剛出生的小雞卵巢主要分為皮質(zhì)、外髓質(zhì)和內(nèi)髓質(zhì)，呈扁片狀覆蓋在腎和腎上腺表面（圖1）。皮質(zhì)與髓質(zhì)被結(jié)締組織分隔開(kāi)，此結(jié)締組織隔膜即為初級(jí)白膜。皮質(zhì)層和髓質(zhì)層分界明顯。

皮質(zhì)位于髓質(zhì)的淺面，因其染色淺且細(xì)胞質(zhì)略呈弱嗜堿性，極易與髓質(zhì)區(qū)分。出生1 d 齡時(shí)，皮質(zhì)主要由10 余層多邊形球狀生殖細(xì)胞構(gòu)成，細(xì)胞體積較大。在皮質(zhì)層的淺面，即卵巢的表面有1～2層小而呈柱狀或梭狀的生殖上皮細(xì)胞被覆（圖2）。整個(gè)皮質(zhì)從橫切面觀呈厚薄均勻的帶狀，生殖上皮延伸向下，成為小葉間小梁，不完全地分隔皮質(zhì)帶為長(zhǎng)方形小葉（圖1），小葉間小梁向深面抵達(dá)髓質(zhì)；每個(gè)小葉里包含許多大而圓的生殖細(xì)胞，胞液清亮，胞核大而且染色深，核膜不明顯，染色質(zhì)呈粗纖維狀或組成網(wǎng)狀，未見(jiàn)核仁（圖2、3）。

髓質(zhì)較厚，細(xì)胞排列密集，細(xì)胞小而染色深，常可見(jiàn)在髓質(zhì)內(nèi)有上皮細(xì)胞索，稱為髓質(zhì)索，索細(xì)胞也稱間質(zhì)細(xì)胞。它們較皮質(zhì)的生殖細(xì)胞小，成群圍成腺葉狀，但不形成腺腔，細(xì)胞核小而圓，居中，核膜清晰，細(xì)胞質(zhì)豐富，淡染。髓質(zhì)內(nèi)還出現(xiàn)大量不規(guī)則的裂隙，狀如血管斷面，但仔細(xì)觀察則無(wú)典型的內(nèi)皮細(xì)胞，這便是腔隙道[3]。根據(jù)腔隙道的有無(wú)，髓質(zhì)分為外髓質(zhì)和內(nèi)髓質(zhì)，外髓質(zhì)細(xì)胞排列密集并含有多種細(xì)胞，內(nèi)髓質(zhì)上皮細(xì)胞索較少，含有豐富的腔隙道、脈管和神經(jīng)。在外髓質(zhì)中，可以區(qū)分出索內(nèi)間質(zhì)細(xì)胞、間充質(zhì)細(xì)胞、索外間質(zhì)細(xì)胞。根據(jù)González-Morán[3]報(bào)道，觀察到索外間質(zhì)細(xì)胞體積稍大，核大而圓，核膜清晰，核仁清晰，異染色質(zhì)呈小塊狀分布，常染色質(zhì)豐富，細(xì)胞界限模糊。間充質(zhì)細(xì)胞細(xì)胞界限模糊，核較小，形狀不規(guī)則，核膜及核仁均模糊，異染色質(zhì)少。腔隙道的結(jié)構(gòu)與靜脈明顯不同，即圍成腔隙道的扁平上皮細(xì)胞數(shù)量較多，形態(tài)類似于腎小管髓袢細(xì)段，但管腔大而不規(guī)則。

2.3 出生后1 周左側(cè)卵巢的組織學(xué)變化

2.3.1 皮質(zhì)的變化 從3 d齡開(kāi)始，皮質(zhì)細(xì)胞開(kāi)始發(fā)生變性、空泡化等退行性變化，短期內(nèi)細(xì)胞大量消失，到5 d齡時(shí)皮質(zhì)在生殖上皮下方出現(xiàn)大片細(xì)胞間的空白區(qū)（圖4），細(xì)胞排列松散，主要剩下一類多突起星形細(xì)胞，核模糊，胞質(zhì)少而嗜酸性增強(qiáng)（圖5）?？瞻讌^(qū)之間從髓質(zhì)伸向表面的小隔愈顯突出。至7 d齡時(shí)，外髓質(zhì)已經(jīng)出現(xiàn)了明顯的卵泡，此時(shí)皮質(zhì)幾乎蛻落殆盡，僅存少量生殖上皮層（圖6）。

2.3.2 外髓質(zhì)的變化 隨天齡增加，外髓質(zhì)的細(xì)胞逐漸增多，約在5 d 齡時(shí)，外髓質(zhì)初步出現(xiàn)卵泡（圖4）。卵泡細(xì)胞顯現(xiàn)，為單層柱狀細(xì)胞，胞質(zhì)嗜酸性增強(qiáng)，開(kāi)始整齊排列為1 層，其內(nèi)隱約可見(jiàn)卵母細(xì)胞，為不規(guī)則形，初在卵泡細(xì)胞之間，其后轉(zhuǎn)移到卵泡中央，核膜核仁均模糊不清（圖4）。在卵泡形成的同時(shí)，卵泡顆粒層外出現(xiàn)1～2 層長(zhǎng)梭狀細(xì)胞，為卵泡膜，核染色較深，而髓質(zhì)索的外圍則沒(méi)有這種細(xì)胞。7 d 齡時(shí)，可見(jiàn)清晰明顯的卵泡，卵母細(xì)胞快速變大，直徑可達(dá)40 μm，核體積變大，核膜及核仁均清晰（圖6）。隨著皮質(zhì)的退化，外髓質(zhì)最終成為真正的皮質(zhì)部。

值得注意的是在大量的生殖細(xì)胞消失的同時(shí)，皮質(zhì)與髓質(zhì)之間的界線顯得極不整齊，似乎在界面上出現(xiàn)許多裂隙（圖4）。

2.3.3 內(nèi)髓質(zhì)的變化 內(nèi)髓質(zhì)的腔隙道隨日齡的增加而變得豐富。皮質(zhì)與髓質(zhì)之間的界線也越來(lái)越模糊，最終界線消失。初級(jí)白膜成為位于生殖上皮下的真正的白膜。

圖1 1d齡雛雞左側(cè)卵巢，示皮質(zhì)、外髓質(zhì)、內(nèi)髓質(zhì)，標(biāo)尺=100 μm，H-E 染色。C：皮質(zhì)；OM：外皮質(zhì)；IM：內(nèi)皮質(zhì)，LC：腔隙道.Fig 1 The left ovary from 1-day-old chick showing the cortex，out medulla and inner medulla，bar=100 μm，H-E staining.C：Cortex；OM：Out medulla；IM：Inner medulla；LC：Lacunar channel.

圖2 3d齡皮質(zhì)與髓質(zhì)，標(biāo)尺=20 μm；H-E 染色。C：皮質(zhì)；OM：外皮質(zhì)；↑示生殖上皮.Fig 2 The cortex and medulla of the left ovary from 3-day-old chick，bar=20 μm，H-E staining.C：Cortex；OM：Out medulla；↑ indicated the germinal epithelium.

圖3 3d齡皮質(zhì)，額切（水平切），標(biāo)尺=20μm；H-E 染色.Fig 3 The cortex from 3-day-old chick，frontal section，bar=20 μm，H-E staining.

圖4 5d齡左側(cè)卵巢，正處于崩解的皮質(zhì)，標(biāo)尺=20 μm，H-E 染色。C：皮質(zhì)；OM：外皮質(zhì)；F：正在生成的卵泡，其與髓質(zhì)索的區(qū)別在于細(xì)胞團(tuán)外圍有2 層長(zhǎng)梭狀細(xì)胞包圍，↑示1 個(gè)異嗜性粒細(xì)胞.Fig 4 The left ovary from 5-day-old chick showing the degenering cortex，bar=20 μm，H-E staining.C：Cortex；OM：Out medulla；F：Newborn follicles showing the two layers of narrowed fusiform cells around the follicles，wich were the difference between the follicle and the primary sex cord.↑showed a heterophil leucocytes.

圖5 崩解處皮質(zhì)高倍觀，細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，胞質(zhì)嗜酸性增強(qiáng)，許多細(xì)胞僅剩核和周邊少量胞質(zhì)；細(xì)胞間出現(xiàn)大片空白，標(biāo)尺=10 μm，H-E染色.Fig 5 Higher magnification of the degenering cortex composed of loose arranged，irregular and enhanced acidophile cells，many of them consisted of nuclei and thin plasma around the nuclei，bar=10 μm，H-E staining.

圖6 7d齡左側(cè)卵巢，外髓質(zhì)出現(xiàn)一層生長(zhǎng)卵泡（↑），皮質(zhì)幾乎消失殆盡，標(biāo)尺=20 μm，H-E 染色。C：皮質(zhì)；OM：外髓質(zhì)；D：原皮質(zhì)小葉間隔，與髓質(zhì)相連。此時(shí)卵母細(xì)胞直徑大約40 μm，核清晰可辨，核仁明顯，核膜不明顯.Fig 6 The left ovary from 7-day-old chick showing a layer of growing follicles in the out medulla，noting that the primary cortex had losed nearly at all.The diameter of the oocytes in the follicles were about 40 μm，they had clear nuclei，obvious nucleoli and some obscure karyotheca，bar=20 μm，H-E staining.C：Cortex；OM：Out medulla；D：The diaghragm between primary cortex lobes，which merged into the out medulla.

3 討論

前人研究表明[4]，母雞只有左側(cè)卵巢是正常發(fā)揮功能的。母雞出生后的右側(cè)卵巢逐漸萎縮變小；或者母雞一生中的右側(cè)卵巢以1個(gè)不起眼的遺跡存在，只有很少的母雞的右側(cè)卵巢會(huì)以1個(gè)完整的和有功能的卵巢存在。當(dāng)人工地以外科手術(shù)摘除左側(cè)卵巢后，右側(cè)卵巢可以發(fā)育為有功能的卵巢，所以許多研究者推測(cè)左側(cè)卵巢對(duì)右側(cè)卵巢有抑制作用[5-7]。

禽類卵巢的被膜由生殖上皮和白膜組成。生殖上皮是由單層上皮細(xì)胞構(gòu)成，通常上皮細(xì)胞是立方形的，核為泡狀圓核。生殖上皮下是1 層白膜，由較致密的結(jié)締組織構(gòu)成。本實(shí)驗(yàn)觀察到，陽(yáng)山雞在出生后的5 d 齡皮質(zhì)層發(fā)生退化崩解，位于皮質(zhì)下的初級(jí)白膜逐漸暴露，形成了卵巢真正的白膜。原有的生殖上皮層去向如何，是散落消失還是沉積在初級(jí)白膜表面，由于本實(shí)驗(yàn)是隔天取材觀察，對(duì)此疑問(wèn)尚難給出確切答案，需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)觀察。

關(guān)于皮質(zhì)的發(fā)育變化，本觀察在1～3 d 齡時(shí)，可見(jiàn)明顯的皮質(zhì)層，其內(nèi)充滿了大而飽滿的生殖細(xì)胞，它們的核在1～3 d 齡發(fā)生了急劇的變化，在1 d 齡時(shí)，核膜完整，核仁清晰，胞質(zhì)清亮，及至3 d 齡時(shí)，核膜消失，核質(zhì)呈粗纖維狀伸展，核仁不顯，整個(gè)核呈染色質(zhì)凝縮散開(kāi)的狀態(tài)，全層生殖細(xì)胞變化相當(dāng)同步，但不同區(qū)域之間的生殖細(xì)胞則可處于不同的減數(shù)分裂階段。到5 d 齡時(shí)這些細(xì)胞幾乎全部消失不見(jiàn)，僅剩下大量的空隙和散在網(wǎng)狀排列的未知類型的細(xì)胞。后者有進(jìn)一步聚集成層，進(jìn)而形成或加強(qiáng)初級(jí)白膜的作用。上述觀察與González-Morán（2011）[3]在1 d 齡白來(lái)亨雞觀察結(jié)果相同，該作者在1 d 齡雛雞也觀察到完整飽滿的皮質(zhì)層。按照該作者的觀點(diǎn)，雛雞卵巢的生殖細(xì)胞既分布于皮質(zhì)，也分布于髓質(zhì)，它們屬于卵原細(xì)胞或卵母細(xì)胞，在皮質(zhì)成群分布。González-Morán 認(rèn)為皮質(zhì)的生殖細(xì)胞可能通過(guò)向髓質(zhì)移行而參與卵泡的形成，但在本研究中僅僅在卵巢的內(nèi)外兩端很小的區(qū)域觀察到了分布于髓質(zhì)的泡狀的卵母細(xì)胞，其他大部區(qū)域的髓質(zhì)根本看不到這類胞質(zhì)豐富的卵母細(xì)胞，因此筆者尚不能同意González-Morán 關(guān)于皮質(zhì)卵母細(xì)胞向髓質(zhì)移動(dòng)的觀點(diǎn)。此外，本實(shí)驗(yàn)在皮質(zhì)可見(jiàn)的卵母細(xì)胞均呈現(xiàn)出整齊同步的形態(tài)特點(diǎn)，均處于卵母細(xì)胞的細(xì)線-粗線期，如此大量的細(xì)胞如果全部轉(zhuǎn)化為卵泡的卵母細(xì)胞，則整個(gè)卵巢的卵泡數(shù)量將十分驚人，因此必定有相當(dāng)數(shù)量的卵母細(xì)胞將發(fā)生閉鎖。關(guān)于卵母細(xì)胞的閉鎖問(wèn)題，Greenfield[8]通過(guò)電鏡觀察到雞卵母細(xì)胞在生后的發(fā)育過(guò)程中很少發(fā)生閉鎖，這與本實(shí)驗(yàn)觀察到的卵母細(xì)胞在3～5d 齡大量消失的結(jié)果不相符。卵巢的生殖細(xì)胞是由來(lái)源于胚胎孵化第2～3 天的卵黃囊壁的原始生殖細(xì)胞演化而來(lái)[9]。早在20 世紀(jì)30年代，一些作者就發(fā)現(xiàn)，給予遺傳上是雄性的雞胚在6 胚齡之前注射一劑微量的雌激素可以誘導(dǎo)出左側(cè)性腺卵巢化，即生出明顯的皮質(zhì)，這種皮質(zhì)在孵化后第3 天開(kāi)始發(fā)生崩解，然后該性腺發(fā)育形成睪丸[10]。這說(shuō)明在性分化的關(guān)鍵時(shí)期（孵化的5～7 d），左側(cè)性腺生殖上皮表達(dá)雌激素受體以及性腺髓質(zhì)分泌雌激素是性腺性別分化的關(guān)鍵事件。因此筆者推測(cè)，左側(cè)原皮質(zhì)從形成到退化大約經(jīng)歷16～21 d 的存續(xù)時(shí)間，然后完成其歷史使命而退化。那么這種“歷史使命”是什么？很少有文獻(xiàn)關(guān)注。本實(shí)驗(yàn)在5～7d 齡觀察到卵泡的形成是在非常接近皮質(zhì)的髓質(zhì)內(nèi)形成的，此時(shí)的皮質(zhì)幾乎消失殆盡，則皮質(zhì)在卵泡形成過(guò)程中沒(méi)有起到實(shí)質(zhì)性的作用，其真正的作用仍然是一個(gè)迷。

關(guān)于前卵泡細(xì)胞，本實(shí)驗(yàn)也存在著同樣的疑問(wèn)。前卵泡細(xì)胞是指形成卵泡顆粒層的前體細(xì)胞，處于皮質(zhì)內(nèi)，González[3]在白來(lái)亨雞卵巢能清楚地觀察到這類細(xì)胞，但本研究則未能觀察到這類細(xì)胞，直到其在卵泡形成時(shí)才可區(qū)分出來(lái)，它們是從皮質(zhì)移入的還是就在髓質(zhì)內(nèi)存在的？尚不明確。綜上所述，本實(shí)驗(yàn)由于僅在1、3、5、7 d 間隔觀察，觀察結(jié)果是初步的，許多細(xì)節(jié)仍待進(jìn)一步觀察考證。