油/水界面法制備硫化銅微粒及其抗菌性能研究

齊嘉欣，溫金熙，汪沁，周興平

（東華大學(xué)化學(xué)化工與生物工程學(xué)院，上海201620）

微生物感染是現(xiàn)代醫(yī)學(xué)所面臨的極其嚴(yán)峻的問題之一[1]，在人體生物材料植入、醫(yī)用材料使用等環(huán)節(jié)都有因細(xì)菌感染而產(chǎn)生嚴(yán)重后果的案例[2-5]，因此研發(fā)具有良好抗菌性的生物醫(yī)用材料能夠在一定程度上解決因細(xì)菌感染所帶來的醫(yī)學(xué)問題[6]。

金、銀、鋅和銅等金屬粒子廣泛應(yīng)用于醫(yī)療器械、農(nóng)業(yè)、診斷等領(lǐng)域[7-8]，其抗菌廣譜、毒性小且抗菌性能持久[9]，在抗菌材料的制備中具有重要的應(yīng)用價(jià)值。在常用的抗菌性金屬粒子中，銅的抗菌性相較金、銀略差且極易被氧化[10]，但是銅價(jià)格便宜且易制成含銅化合物。同時(shí)硫元素也能夠?qū)?xì)菌表現(xiàn)出良好的抗菌性，因此制備CuS作為抗菌材料受到了研究者們的極大關(guān)注[9]。

目前各種方法所制備的CuS微粒均為六方晶型，對于其他晶型CuS的制備及其抗菌效果的研究較少，因此探究不同晶型CuS的抗菌性能具有重要意義。

本研究采用油/水界面法合成CuS微粒，通過改變反應(yīng)條件，得到不同晶型的CuS微粒，并測試其對金黃色葡萄球菌（S.aureus）和大腸桿菌（E.coli）的抗菌活性，期望能夠擴(kuò)大其在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

試劑：氯化銅（CuCl2·2H2O，99.0%，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑公司）、油酸鈉（99.0%，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑公司）、硫化鈉（Na2S·9H2O，99.0%，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑公司）、甲苯（99.0%，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑公司）、無水乙醇（99.7%，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑公司）；超純水和去離子水為自制。

儀器：Hitachi S-4800型掃描電子顯微鏡（SEM，日 本 日 立 HITACHI），Rigaku D/max-2500型 X 射線衍射儀（XRD，日本Rigaku），力辰DF-101S型磁力攪拌器(力辰儀器科技有限公司)，Centrifuge5810型高速離心機(jī)（德國艾本德股份有限公司），YXQLS-S型全自動高壓蒸汽滅菌鍋（上海博迅生物儀器股份有限公司），SW-CJ-2FD型雙人超凈工作臺（聚創(chuàng)環(huán)保設(shè)備有限公司），HYG-B型全溫控制搖瓶柜（蘇州培英實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司），9080型隔水式恒溫培養(yǎng)箱（華城敏科實(shí)驗(yàn)儀器廠）。

1.2 樣品的制備

油 酸 銅 的 合 成：將 0.02 mol CuCl2·2H2O 和0.04 mol油酸鈉溶于正己烷、無水乙醇、超純水體積比為3∶4∶7的混合溶劑中，70℃下回流反應(yīng)4 h，反應(yīng)結(jié)束后置于冰浴中冷至0℃，分離析出物，去離子水與無水乙醇交替洗滌，真空干燥，得到綠色的油酸銅產(chǎn)物。

CuS微粒的合成：將0.004 mol油酸銅溶入100 mL甲苯中，0.004 mol Na2S·9H2O 置于 100 mL 去離子水中溶解并逐滴加入到上述含有油酸銅的甲苯溶液中，置于反應(yīng)釜中分別在120℃和180℃下反應(yīng)5 h，待反應(yīng)結(jié)束后，分離、洗滌、60℃真空干燥，分別得到六方相和正交相的球狀CuS微粒。

1.3 樣品的抗菌性測試

實(shí)驗(yàn)選擇兩種菌種，革蘭氏陽性菌S.aureus和革蘭氏陰性菌E.coli。

（1）菌懸液制備：用接種環(huán)挑取一個(gè)菌落，置于裝有液體培養(yǎng)基的錐形瓶中充分涮洗，錐形瓶封口后置于37℃搖床中培養(yǎng)12 h，稀釋適當(dāng)倍數(shù)。

（2）試樣制備：分別稱取0.01 g不同晶型的CuS粉末于各樣品瓶中，向其中加入4.9 mL的PBS和100 μL的預(yù)制菌液。對照組為空白對照，即只加入4.9 mL的PBS和100 μL的預(yù)制菌液。將樣品瓶固定在恒溫振蕩培養(yǎng)箱的搖床上，37℃培養(yǎng)12 h。

（3）活菌計(jì)數(shù)培養(yǎng)：試樣和對照試樣振蕩培養(yǎng)后，適當(dāng)稀釋，分別取10 μL樣液在3個(gè)滅菌平皿中平行接種，待凝固后將上述平板置于恒溫培養(yǎng)基中培養(yǎng)10 h后進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)，并計(jì)算抑菌率C。

式中C為抑菌率，a為對照試樣的平均活菌數(shù)，z為待測試樣的平均活菌數(shù)。

2 結(jié)果與討論

2.1 CuS微粒的XRD表征

圖1為油/水界面法分別在120℃和180℃下反應(yīng)5 h所制備的CuS微粒的XRD圖譜。從圖中可以看出，在120℃下反應(yīng)5 h所制備的CuS微粒的衍射峰對應(yīng)PDF標(biāo)準(zhǔn)卡片06-0464，即在此條件下反應(yīng)得到的產(chǎn)物是六方相CuS；在180℃下反應(yīng)5 h所得到的CuS微粒為正交相CuS，其衍射峰則對應(yīng)正交相CuS的標(biāo)準(zhǔn)PDF卡片65-7111。

圖1 CuS微粒的XRD圖

2.2 CuS微粒的SEM表征

圖2是在120℃和180℃下分別制備的六方相和正交相CuS微粒的SEM圖。由圖可以看出，所制備的六方相CuS為極細(xì)的納米片組裝而成的微球顆粒，平均粒徑為1.25 μm，納米片厚度約70 nm，微球表面粗糙、大小均勻；正交相CuS顆粒也是由納米片組裝成的微球顆粒，平均粒徑為1.24 μm，納米片較六方相CuS微球的納米片厚，約130 nm。

2.3 CuS微粒的抗菌性

樣品對S.aureus和E.coli的抗菌試驗(yàn)結(jié)果如圖3、圖4所示。

圖2 六方相CuS微粒（a）和正交相CuS微粒（b）的SEM圖

圖3是S.aureus分別與正交相、六方相CuS微粒接觸10 h后的菌落照片。由圖可以看出，10 h接觸過后，菌落數(shù)相較于空白對照組明顯減少，可以說明兩種晶型的CuS微粒對于金黃色葡萄球菌均表現(xiàn)出較好的抗菌性能。

圖3 S.aureus與CuS微粒接觸10 h后的菌落照片

圖4是E.coli分別與正交相、六方相CuS微粒接觸10 h后的菌落照片，從中可以看到，經(jīng)過10 h接觸，試驗(yàn)組的菌落數(shù)同樣明顯少于空白組，說明兩種晶型的CuS微粒對于E.coli也表現(xiàn)出優(yōu)異的抗菌性能，尤其是正交相CuS微粒對于E.coli的抗菌效果非常明顯。

圖4 E.coli與CuS微粒接觸10 h后的菌落照片

對樣品抗菌性能定量分析的抑菌率結(jié)果統(tǒng)計(jì)如圖5所示。從圖5可以看出，油水界面法制備的正交相CuS微粒對S.aureus和E.coli的抑菌率分別為99.6%±1.5%、100%；六方相CuS微粒對S.aureus和E.coli的抑菌率分別為97.4%±4.7%、85.9%±11.1%。

3 結(jié)論

本文通過油/水界面法分別在120℃和180℃下成功制備出了結(jié)晶性良好的六方相和正交相CuS微粒，均為納米片堆疊而成的微球結(jié)構(gòu)。六方相和正交相CuS微粒對E.coli和S.aureus均具有非常優(yōu)異的抗菌性能，對于抗菌材料的探索具有一定的意義。

圖5 E.coli和S.aureus與試樣接觸培養(yǎng)10 h后的抑菌率統(tǒng)計(jì)