梅花鹿鹿油的提取及成分檢測

楊富雅，趙麗華，孫堯，呂偲丞，高冷，*

（1.長春工業(yè)大學化學與生命科學學院，吉林長春130012；2.長春金荷藥業(yè)有限公司，吉林長春130012）

梅花鹿（Cervus nippon）是一種珍貴的、具有藥用價值的特種動物，隨著我國鹿業(yè)市場的逐步成熟，市場對鹿茸、鹿胎等產品需求量的增加[1]，特別是隨著市場對鹿產品需求量的提高，在生產過程中，產生了大量的與梅花鹿相關的生產廢物，其中主要為鹿脂肪中的油脂，也就是鹿油。經相關報道，鹿油易被皮膚吸收，不僅能夠保濕鎖水、滋養(yǎng)肌膚，還具有抗氧化的作用，可以延緩皮膚衰老、預防皮膚疾病，此外對動脈硬化及老年性肥胖癥的預防也是有幫助的，因此廣泛應用于食品[2]、保健品及化妝品[3]等領域。目前，我國對鹿油研究較少，對鹿油成分分析鮮有相關報道。

CO2是一種無毒、純度高、可再循環(huán)利用的溶劑，是超臨界流體提取技術最常用的溶劑[4-5]。與常見的有機溶劑提取法相比，超臨界流體提取物中沒有溶劑殘留，同時CO2的臨界壓力與臨界溫度較為溫和，提取過程可以在較低的壓力溫度下進行，不會對熱敏性物質產生影響，更不會引起部分物質的氧化[6]。作為一種環(huán)境友好型技術，超臨界流體提取被應用于各種科學和工業(yè)生產領域[7]。張承紅等[8]研究了超臨界二氧化碳萃取牛尾獨活揮發(fā)油的工藝條件，探究了不同提取條件對牛尾揮發(fā)油提取率的影響。由于氣相色譜-質譜法（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）聯(lián)用的靈敏度較高、抗干擾能力強，在化學、生物領域具有廣泛的應用。楊君[9]主要通過GC-MS 分析法檢測植物油中多環(huán)芳烴的含量，優(yōu)化了檢測的工藝條件。并且研究經過脫酸、脫色和脫臭加工工序后多環(huán)芳烴的含量變化情況。現階段，運用此方法檢測動物油脂主要成分的研究相對較少。

本研究考察了不同的提取因素對鹿油提取率的影響。以單因素試驗為基礎，進行正交試驗設計，研究各因素之間的交互作用，特別是提取溫度與提取壓力對超臨界流體溶解度和傳質系數的交互影響。此外對超臨界CO2提取鹿油進行極差分析，利用極差分析確定不同因素對鹿油提取率的影響強弱，對提取工藝進行優(yōu)化。通過GC-MS 對鹿油的成分進行檢測，鑒定其主要成分，為更好的開發(fā)并應用鹿油創(chuàng)造了條件。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 試驗材料

梅花鹿鹿肉脂肪：吉林省雙陽區(qū)鹿鄉(xiāng)鎮(zhèn)。

1.1.2 試驗試劑

CO2鋼瓶（40L）：沈陽鑫東基化工氣體有限公司；正己烷（分析純）：天津市富宇精細化工有限公司；氫氧化鈉、甲醇、乙醚、氫氧化鉀、氯化鈉（分析純）：北京化工廠。

1.1.3 試驗儀器設備

氣質聯(lián)用儀（SCION SQ）：上海冉超光電科技有限公司；超臨界CO2提取儀（HA221-50-06）：江蘇華安科技有限公司；真空干燥箱（DZ-2AII）：南京諾泰施格科學儀器有限公司；超聲波清洗器（SCIENTZ-HF2000）：寧波新芝生物科技股份有限公司；電子天平（HX2002T）：慈溪市天東衡器廠。

1.2 方法

1.2.1 原料預處理

將新鮮鹿脂肪除雜破碎放至超聲波清洗儀（40 kHz，30 ℃下超聲清洗30 min）中清洗，再進行真空干燥，相對真空度0.09 MPa，溫度90 ℃干燥至表面不含水分，放置備用。

1.2.2 工藝流程與操作流程

鹿脂肪→除雜破碎→超聲清洗→干燥脫水→裝料→超臨界CO2提取→鹿油

稱取500.00 g 經過預處理的鹿脂肪原料裝入萃取釜中，加蓋擰緊，裝入反應容器中，升溫，加壓，調節(jié)CO2流量，提取一定時間后收集鹿油。

鹿油提取率公式：

式中：X 為鹿油的提取率，%；m1為提取出鹿油的質量，g；m2為鹿脂肪的質量，g。

1.2.3 單因素試驗

提取溫度的優(yōu)化：稱取500.00 g 預處理過的鹿脂肪原料，以鹿油提取率為評價指標，控制提取時間120 min，提取壓力 40 MPa，CO2流量 12 L/h 恒定不變，改變提取溫度分別為 30、35、40、45、50、55 ℃和 60 ℃，采用超臨界CO2提取法提取鹿油，研究提取溫度對鹿油提取率的影響。

提取壓力的優(yōu)化：稱取500.00 g 預處理過的鹿脂肪原料，以鹿油提取率為評價指標，控制提取時間120 min，提取溫度 40 ℃，CO2流量 12 L/h 恒定不變，改變提取壓力分別為 25、30、35、40、45、50、55 MPa，采用超臨界CO2提取法提取鹿油，研究提取壓力對鹿油提取率的影響。

提取時間的優(yōu)化：稱取500.00 g 預處理過的鹿脂肪原料，以鹿油提取率為評價指標，控制提取溫度40 ℃，提取壓力 40 MPa，CO2流量 12 L/h 恒定不變，改變提取時間分別為 30、60、90、120、150、180、210 min，采用超臨界CO2提取法提取鹿油，研究提取時間對鹿油提取率的影響。

CO2流量的優(yōu)化：稱取500.00 g 預處理過的鹿脂肪原料，以鹿油提取率為評價指標，控制提取時間120 min，提取溫度40 ℃，提取壓力40 MPa，改變CO2流量分別為 8、10、12、14、16、18、20 L/h，采用超臨界CO2提取法提取鹿油，研究CO2流量對鹿油提取率的影響。

1.2.4 正交試驗

影響超臨界CO2提取的因素有很多，提取溫度、提取壓力、提取時間、CO2流量是影響超臨界CO2提取法提取率的重要因素。在單因素變量條件下篩選出提取溫度、提取壓力、提取時間、CO2流量對提取率的影響水平，進行L9（34）試驗設計，以提取率為檢驗指標，進行正交試驗，進料500.00 g，見表1。

表1 L9（34）正交試驗因素水平表Table 1 L9（34）orthogonal experiment factors and levels

1.3 試驗方案

1.3.1 鹿油樣品前處理

準確稱取提取后的鹿油0.200 0 g，加入正己烷使鹿油完全溶解并定容至10.00 mL 容量瓶中，搖勻后用移液槍移取 50 μL 于 10 mL 試管中，加入 0.4 mol/L 的氫氧化鈉-甲醇溶液2.00 mL 后，放置在漩渦振蕩器中，振蕩2 min，放置10 min 后再加入1.95 mL 正己烷于試管中，再將其放入旋渦振蕩器振蕩2 min，然后用質量分數為8.0 %的氯化鈉溶液稀釋至10 mL，以2 000 r/min 離心10 min 后吸出上清液于微量試管中，過0.45 μm 的微孔濾膜過濾后，再經過三氟化硼法進行脂肪酸的甲酯化處理[10]，最后取1 μL 樣品進行GCMS 分析。

1.3.2 色譜條件

DB-5MS 毛細管柱（30 mm×0.25 μm×0.25 nm），進樣口溫度 250 ℃；程序升溫：90 ℃持續(xù) 1 min，以 5 ℃/min至 140 ℃，再以 3 ℃/min 至 170 ℃，持續(xù) 1 min，最后以10 ℃/min 至 250 ℃，持續(xù) 5 min。載氣：高純氦氣；流量1 mL/min；分流比 40 ∶1。

1.3.3 質譜條件

EI+離子源，離子能量70 eV；燈絲流量0.2 mA；離子源溫度：230 ℃；接口溫度：250 ℃；掃描質量范圍：10 amu～550 amu。

1.3.4 圖譜分析

樣品經過GC-MS 分析后，以峰的保留時間及譜庫檢索進行定性分析，然后與相應標準峰面積進行比較完成定量分析得出鹿油主要的化學成份。

2 結果與分析

2.1 超臨界CO2提取條件單因素試驗

2.1.1 提取溫度對鹿油提取率的影響

溫度對鹿油提取率的影響見圖1。

圖1 溫度對鹿油提取率的影響Fig.1 Effect of temperature on extraction rate of deer oil

由圖1 可得，在提取時間120min，提取壓力40MPa，CO2流量12 L/h 恒定不變的條件下，隨著提取溫度的升高，鹿油的提取率上升趨勢顯著，當溫度為45 ℃時，提取率達到最高。隨著溫度高于45 ℃時，提取率開始緩慢下降。

由于溫度升高對對流傳質系數的影響大于對溶解度的影響，提取率不斷提升。而當溫度高于45 ℃時，溶解度對鹿油提取率的影響高于對流傳質系數的影響，提取率便開始下降。綜合考量得出，鹿油提取溫度以 40 ℃～50 ℃為最佳。

2.1.2 提取壓力對鹿油提取率的影響

提取壓力對鹿油提取率的影響見圖2。

圖2 壓力對鹿油提取率的影響Fig.2 Effect of pressure on extraction rate of deer oil

如圖2 可得，壓力變化對鹿油提取率的影響較為明顯。本試驗中，控制提取溫度為40 ℃，壓力從25 MPa上升至40 MPa，鹿油提取率顯著增加，當提取壓力超過40 MPa，鹿油的提取率上升緩慢，但仍具有持續(xù)上升的趨勢。

從量化生產的經濟方面考慮，當壓力高于40 MPa，提取系統(tǒng)需要經過特殊設計，會提高成本。從能源、經濟等綜合因素考量，鹿油提取壓力以35 MPa～45 MPa為最佳。

2.1.3 提取時間對鹿油提取率的影響

提取時間對鹿油提取率的影響見圖3。

圖3 時間對鹿油提取率的影響Fig.3 The effect of time on extraction rate of deer oil

如圖3 可得，提取時間對超臨界CO2提取鹿油有顯著影響。超臨界提取屬于擴散過程，需要一定時間才能提取充分。提取初期，由于溶劑的擴散速率緩慢，提取率較低，隨著時間的延長，溶劑擴散能力增強，提取率不斷增大。在控制提取溫度40 ℃、提取壓力40 MPa、CO2流量12 L/h 條件下，觀察圖3 可知，在30 min～150 min 時間內，提取時間越長鹿油提取率越高，鹿油提取率隨著提取時間的增加而顯著提高，但150 min后，隨著提取時間的增加鹿油提取率基本趨于平緩，由此得到鹿油提取時間以120 min～180 min 為最佳。

2.1.4 CO2流量對鹿油提取率影響

CO2流量對鹿油提取率的影響見圖4。

圖4 CO2 流量對鹿油提取率的影響Fig.4 Effect of CO2 flow on extraction rate of deer oil

本試驗中，各組試驗控制在提取時間120 min，提取溫度40 ℃，提取壓力40 MPa 下進行，增大CO2流量，意味著更多CO2參與提取過程。如圖4 可得，當CO2流量增大，萃取釜入口處的CO2流速增大，萃取釜中CO2的流動方向由于卷吸效應發(fā)生彎曲，CO2流量越大，卷吸效應越強，使得萃取釜中的原料與超臨界CO2充分反應，使提取速率不斷升高。綜合考量得出，鹿油提取中CO2流量以12 L/h～16 L/h 為最佳。

2.2 正交試驗結果

在單因素試驗的基礎上，采用四因素三水平的的正交設計方案，在9 種不同工藝條件下提取鹿油，分別測定其提取率，結果見表2。

表2 正交試驗結果Table 2 Orthogonal experiment results

表2 的極差分析結果表明，超臨界提取4 個因素對鹿油提取率的影響順序為：提取壓力＞提取時間＞CO2流量＞提取溫度，鹿油的最佳提取方案為A2B2C2D2，即最佳提取工藝條件組合為提取溫度45 ℃，提取時間150 min，CO2流量 14 L/h，提取壓力 40 MPa。

2.3 最佳提取條件驗證

在上述最佳條件下進行3 次重復試驗，其鹿油提取率分別為44.36%、45.21%和44.87%，得到平均提取率為44.81%，由提取率可看出，最佳提取工藝條件具有較好的重復性，鹿油提取率較高，說明該工藝條件是合理、可靠的。

2.4 鹿油成分分析

采用GC-MS 分析法對超臨界CO2提取法所得到的鹿油脂肪酸甲酯液進行分析，得鹿油脂肪酸甲酯色譜圖，如圖5 所示。

將質譜圖中的各色譜峰與譜圖庫標準譜圖進行對照，確定其化學成分，同時采用面積歸一化法定量分析計算出各成分的相對含量，結果見表3。

由表3 可知，鹿油中共鑒定出16 種脂肪酸，其飽和脂肪酸和不飽和脂肪酸相對含量分別為69.840 9%、30.159 1%，不飽和脂肪酸/飽和脂肪酸為0.431 8。

圖5 鹿油脂肪酸甲酯色譜圖Fig.5 Fatty acids methyl esters chromatogram of deer oil

表3 鹿油脂肪酸成分與含量Table 3 Compositions and contents of fatty acids in deer oil

其中主要脂肪酸為十六烷酸、十八烷酸、十八碳烯酸及十八碳二烯酸。十六烷酸又稱粽櫚酸，在飽和脂肪酸中含量最高，其質量分數為48.85%，穩(wěn)定性良好，是較好的食品強化劑和乳化劑，深受食品制造產業(yè)所喜愛，粽櫚酸在洗滌用品領域也有廣泛應用，主要用于制作肥皂和合成洗滌劑的原料；十八烷酸又稱硬脂酸，是飽和的高級脂肪酸中的一種，其質量分數為15.03%，具有很好的潤滑性和熱穩(wěn)定性，在食品工業(yè)中用作潤滑劑、消泡劑及食品添加劑，在護膚品中起乳化作用，是化妝品的主要原料；十八碳烯酸又稱油酸，在不飽和脂肪酸中含量最高，占總脂肪酸含量的13.83%，油酸的鈉鹽或鉀鹽是肥皂的主要成分之一。純的油酸鈉具有良好的去污能力，可用作乳化劑等表面活性劑，并可用于治療膽石癥等。此外十八碳烯酸還可用作抗靜電劑、柔軟潤滑劑及乳化劑等，因此在化妝品和毛紡等工業(yè)中有廣泛應用。根據GC-MS分析法檢測的鹿油脂肪酸成分中，十七碳烯酸是不飽和脂肪酸中含量較少的，其質量分數為0.633 4%，在總脂肪酸中含量極低，對皮膚的刺激作用也就越小。

3 結果與討論

采用超臨界二氧化碳提取法提取鹿油，通過單因素試驗得到最優(yōu)的提取工藝。提取工藝為提取溫度45 ℃、提取壓力 40 MPa，提取時間 150 min，CO2流量14 L/h。此時鹿油的提取率為44.81%。

采用GC-MS 分析法對鹿油脂肪酸甲酯液的成分進行檢測，確定其含有16 種脂肪酸，其中飽和脂肪酸和不飽和脂肪酸相對含量分別為69.840 9%、30.159 1%，主要脂肪酸有十六烷酸、十八烷酸、十八碳烯酸及十八碳二烯酸。與井銀成等[11]研究的豬油、雞油主要脂肪酸含量相比較由超臨界二氧化碳提取法對提取出的鹿油經甲酯化后，通過GC-MS 分析法檢測，得到鹿油較其它油脂中的十六烷酸、十八烷酸、十八碳烯酸含量較高，其中十六烷酸含量為48.85%，高于井銀成等[11]報道的從豬油中提取出的十六烷酸含量，其質量分數為28.81%，鹿油中十八烷酸為15.03%，高于豬油中的9.01%，同時十七碳烯酸含量較低僅為0.633 4%。鹿油通過超臨界CO2提取法提取出的鹿油具有明顯的熱穩(wěn)定性、潤滑性、乳化作用較其它同類動物油脂效果更好，對皮膚刺激性更小，更適用于日化領域的應用。