著-聚賴氨酸/淀粉抑菌膜的制備及性能檢測(cè)

邱肖華，吳依莎，朱政澤，張泛舟，陳銀瀅，余作龍，活潑

（浙江樹(shù)人大學(xué)生物與環(huán)境工程學(xué)院，浙江杭州310015）

隨著人們對(duì)食品包裝材料造成的食品安全和環(huán)境承受能力等問(wèn)題關(guān)注，使安全、環(huán)保的食品包裝膜成為研究熱點(diǎn)，尤其是近年對(duì)可食性包裝膜研究較多。可食性包裝膜分為蛋白質(zhì)類、多糖類、類脂類以及復(fù)合膜[1-3]，采用天然多功能活性成分取代人工合成及傳統(tǒng)的單功能食品添加劑已成為國(guó)內(nèi)外食品科學(xué)研究的新熱點(diǎn)[4-5]。其中淀粉基可食膜是以淀粉（starch film，St）（主要是直鏈淀粉）為基質(zhì)，以多元醇（如甘油、山梨醇、聚乙二醇等）及類脂物質(zhì)（如脂肪酸、單甘油脂、表面活性劑等）為增塑劑，少量動(dòng)植物膠（如褐藻膠、瓊脂等）為增強(qiáng)劑制作而成[6]。淀粉基膜具有綠色環(huán)保、安全無(wú)毒、可生物降解等特點(diǎn)，是當(dāng)今最具發(fā)展前景的材料之一。

著-聚賴氨酸（epsilon-poly lysine，PL）作為一種微生物源的天然防腐劑，可由微生物菌株Streptomyces albulus No.346 發(fā)酵制得[7]，具有安全、高效、水溶性好、抗菌譜廣等優(yōu)點(diǎn)[8]。PL 對(duì)革蘭氏陰性菌、革蘭氏陽(yáng)性菌、酵母和霉菌都有抑制作用[9]，是一種天然的抑菌劑[10]。

通過(guò)PL 對(duì)大腸桿菌、枯草芽孢桿菌和酵母菌的抑菌試驗(yàn)，得出PL 對(duì)3 種菌的最小抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC），并參考獲得的MIC，制備不同濃度的PL/St 抑菌膜，以前期獲得的St膜配方為參考制膜，并進(jìn)行抑菌性試驗(yàn)，篩選出最佳的抑菌膜。對(duì)篩選出的抑菌膜進(jìn)行性能檢測(cè)，并與St膜進(jìn)行比較，為PL/St 抑菌膜在功能性包裝膜的應(yīng)用領(lǐng)域提供參考。

1 材料和方法

以大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、酵母菌等，3 種菌為研究對(duì)象，采用打孔法，以抑菌圈為指標(biāo)，對(duì)PL 的抑菌性能進(jìn)行研究。

1.1 材料和設(shè)備

1.1.1 試驗(yàn)菌種

大腸桿菌（Escherichia coli）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）和酵母菌（Yeast）。試驗(yàn)菌種由浙江樹(shù)人大學(xué)微生物實(shí)驗(yàn)室提供。

1.1.2 培養(yǎng)基

牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基：牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，氯化鈉 5 g，瓊脂粉 20 g，水 1 000 mL，pH 7.0～7.2。

細(xì)菌基礎(chǔ)培養(yǎng)基（luria-Bertani，LB）：蛋白胨 10 g，酵母膏 5 g，氯化鈉 10 g，瓊脂粉 20 g，水 1 000 mL，pH 7.0～7.4。

酵母膏胨葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（yeast extract peptone dextrose medium，YPD）：葡萄糖 20 g，酵母提取物 10 g，蛋白胨 20 g，瓊脂粉 20 g，水 1 000 mL，pH 5.0。

1.1.3 材料和試劑

豌豆淀粉（食品級(jí)）：煙臺(tái)東方蛋白科技有限公司；甘油（食品級(jí)）：浙江杭州雙林化工試劑廠；海藻酸鈉（食品級(jí)）：山東精協(xié)海洋科技發(fā)展有限公司；著-聚賴氨酸（食品級(jí)）：南京軒凱生物科技有限公司；牛肉膏、酵母膏：北京雙旋微生物培養(yǎng)基制品廠；蛋白胨：南京茂捷生物科技有限公司；酵母提取物：合肥強(qiáng)盛生物科技有限公司；葡萄糖：廣東光華科技股份有限公司；氯化鈉：上海試四赫維化工有限公司；瓊脂粉：杭州木木生物科技有限公司，以上均為分析純。

1.1.4 儀器和設(shè)備

SW-CJ 超凈工作臺(tái)：蘇州凈化設(shè)備有限公司；GI54DW 高壓蒸汽滅菌鍋：美國(guó)Zealway Instrument Inc（致微）儀器有限公司；SPX-250B-Z 生化培養(yǎng)箱、BGZ-140 烘箱：上海博迅實(shí)業(yè)有限公司；PL303 電子分析天平：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；QYC-2102C/KYC-1102C 搖床：上海?，斣O(shè)備有限公司；BCD-186KB 冰箱：青島海爾股份有限公司；TA.XT plus物性儀：北京微訊超技儀器技術(shù)有限公司；07HWS-2數(shù)顯恒溫磁力攪拌器、JHS-2/90 恒速數(shù)顯攪拌機(jī)：杭州儀表電機(jī)有限公司；MB45 鹵素水分儀：奧豪斯儀器（上海）有限公司；MCR102 流變儀：奧地利安東帕（中國(guó)）有限公司；BRUKER 紅外光譜儀：德國(guó)布魯克光譜儀器公司；JC2000D3 接觸角測(cè)量?jī)x：上海中晨數(shù)字技術(shù)設(shè)備有限公司。

1.2 方法

1.2.1 菌懸液的制備

用接種環(huán)挑取2～3 環(huán)已活化培養(yǎng)24 h 的大腸桿菌、枯草芽孢桿菌和培養(yǎng)48 h 的酵母菌分別于無(wú)菌生理鹽水中制成菌體濃度為107cfu/mL～108cfu/mL 的菌懸液。

1.2.2 PL 溶液的配制

精確稱取 PL，分配配制成濃度為 0、0.25、0.5、0.75、1、2、4、8、16、32、64 mg/mL 的 PL 溶液，待用。

1.2.3 含菌平板的制作

分別配制牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基、LB 培養(yǎng)基、YPD培養(yǎng)基和素瓊脂。待所需物品及培養(yǎng)基滅菌后，在超凈工作臺(tái)中，先倒一層素瓊脂，大約5 mL。待其凝固后，放上牛津杯（牛津杯需在酒精燈火焰上快速過(guò)一下）。待培養(yǎng)基的溫度適宜后，倒入平板，用移液槍分別移取各上述菌懸液100 μL 加入其對(duì)應(yīng)的培養(yǎng)基中，快速搖勻，制成混菌平板，并做好標(biāo)記。靜置待培養(yǎng)基凝固后，小心拔出牛津杯，待用。

1.2.4 PL 的 MIC 測(cè)定

采用平板打孔法[11-13]。將配制好的PL 溶液，用移液槍移取不同濃度的PL 溶液100 μL 于平板的孔內(nèi)（每個(gè)平板3 個(gè)孔，每個(gè)濃度兩個(gè)平行），每種培養(yǎng)基增加一組無(wú)菌生理鹽水為空白對(duì)照。將平板放入恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，大腸桿菌與枯草芽孢桿菌置于37 ℃，酵母菌置于30 ℃，培養(yǎng)24 h～48 h 后，觀察試驗(yàn)結(jié)果。

1.2.5 PL/St 抑菌膜的制備

100 mL 水溶液中添加 11 g 豌豆淀粉、1.2 mL 甘油0.4 g 海藻酸鈉，在 95 ℃下，300 r/min 攪拌 30 min[14]，待淀粉糊化后，加入抑菌劑PL，攪拌10 min，經(jīng)真空脫氣工藝脫氣后，流延鋪膜于鋼板上，并在50 ℃烘干，揭膜，儲(chǔ)存待用。

1.2.6 PL/St 膜抑菌性研究

分別配制3 種培養(yǎng)基，加熱融化并分裝入三角瓶中，將培養(yǎng)皿、涂布棒等物品包好后一起滅菌，然后在超凈工作臺(tái)中倒平板并做標(biāo)記，冷卻。用移液槍分別移取各上述菌懸液10 μL 加入對(duì)應(yīng)的培養(yǎng)基中，涂布均勻，靜置使其滲入。用打孔器將制備的不同濃度的抑菌膜打成小圓片（大約3 mm），小心放置于涂有菌的平板上，在恒溫培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)24 h～48 h，觀察平板抑菌圈的大小，衡量膜的抑菌性[15]。

1.2.7 膜厚度測(cè)定

選擇平整、均勻、無(wú)孔洞、無(wú)皺褶的膜，用螺旋測(cè)微器（精度0.01 mm）測(cè)樣品的4 個(gè)頂點(diǎn)和中心點(diǎn)上的厚度，然后取5 個(gè)值的平均值，即為膜的厚度，單位為mm[16]。

1.2.8 抗張強(qiáng)度與斷裂延伸率測(cè)定

按照GB/T 1040.3-2006《塑料拉伸性能的測(cè)定第3 部分：薄塑和薄片的試驗(yàn)條件》[17]，將樣品裁成長(zhǎng)10 cm，寬0.5 cm 的長(zhǎng)條，用物性儀測(cè)定膜的拉伸強(qiáng)度（TS）和斷裂延伸率（E），每組測(cè)垂直方向橫縱各3 條，共6 個(gè)平行樣，計(jì)算平均TS與E。標(biāo)距為50 mm，試樣速度為100 mm/min。

式中：TS為抗拉強(qiáng)度，MPa；F 為膜所受拉力，N；S為膜的橫截面積，m2。

式中：E 為斷裂延伸率，%；L0為試樣原始標(biāo)準(zhǔn)距離，mm；L 為試樣斷裂時(shí)標(biāo)準(zhǔn)距離，mm。

1.2.9 傅立葉紅外光譜分析（fourier transform infrared spectroscopy，F(xiàn)TIR）

剪一小片制得的抑菌膜樣品，然后進(jìn)行紅外光譜掃描，考察膜的組分對(duì)膜結(jié)構(gòu)的影響。采集條件為：25 ℃下，以 4 cm-1分辨率，在 500 cm-1～4 000 cm-1波數(shù)范圍內(nèi)，掃描32 次，得紅外光譜圖。

1.2.10 流變性能

將糊化后的膜液倒入流變儀中，在流變儀上裝cp轉(zhuǎn)子，設(shè)定測(cè)得溫度為80 ℃，按設(shè)定程序進(jìn)行操作，測(cè)得流變曲線。其中，黏度曲線模型為：

式中：η 為黏度，Pa·s；γ 為剪切速率，s-1；k 為稠度系數(shù)，與黏度相關(guān)的常數(shù)；n 為流動(dòng)指數(shù)。

1.2.11 水蒸氣透過(guò)系數(shù)的測(cè)定

透濕率即在規(guī)定的溫度、相對(duì)濕度環(huán)境中，在單位壓差下、單位時(shí)間內(nèi)透過(guò)單位面積和一定厚度膜的水蒸汽量。根據(jù)塑料薄膜及片材透水蒸汽試驗(yàn)方法的原理和步驟，采用GB1037-1988《塑料薄膜和片材透水蒸氣性試驗(yàn)方法杯式法》[18]擬杯子法，具體方法為：在25 ℃條件下，于稱量瓶中放入無(wú)水氯化鈣，氯化鈣使用前應(yīng)粉碎，使其粒度為2 mm，并在200 ℃條件干燥2 h，冷卻，然后稱取一定量的氯化鈣于稱量瓶中。選平整、均勻、無(wú)孔洞、無(wú)皺褶的膜，測(cè)量其厚度后，用熔化的石蠟將其封于口上，然后放入相對(duì)濕度為100%的干燥器中，測(cè)量溫度為25 ℃，每隔24 h 后取出稱重，連續(xù)測(cè)量一周。每一組做至少3 個(gè)平行試驗(yàn)，結(jié)果以每組的算術(shù)平均值表示。

式中：WVP（water vapor permeability）為透水系數(shù)，g·mm/m2·d·KPa；Δm 為穩(wěn)定的質(zhì)量增量，g；d 為膜的厚度，mm；A 為有效測(cè)定面積，m2；t 為測(cè)量時(shí)間間隔，d；ΔP 為試樣兩側(cè)的水蒸汽壓差，KPa。

1.2.12 透油性研究

取約5 mL 色拉油置于試管中，以待測(cè)膜封口，倒置于濾紙上，放置一周，每天稱量濾紙質(zhì)量的變化，按下式計(jì)算透油系數(shù)（Poil）[19]：

式中：Poil 為透油系數(shù)，g·m/m2·d；Δm 為濾紙質(zhì)量的變化，g；d 為膜厚，mm；A 為膜的面積，m2；T 為放置時(shí)間，d。

1.2.13 接觸角

假定不同的界面間力可用作用在界面方向的界面張力來(lái)表示，則當(dāng)液滴在固體平面上處于平衡位置時(shí)，這些界面張力在水平方向上的分力之和應(yīng)等于零，即：

式中：γS/A 為固-氣界面張力，N；γL/A 為液-氣界面張力，N；γS/L 為固-液界面張力，N；θ 為液體與固體間的界面和液體表面的切線所夾（包含液體）的角度，°。

液體與固體間的界面和液體表面的切線所夾（包含液體）的角度，稱為接觸角。接觸角是反應(yīng)物質(zhì)與液體潤(rùn)濕性關(guān)系的重要尺度，當(dāng)θ=0，完全潤(rùn)濕；當(dāng)θ＜90°，部分潤(rùn)濕或潤(rùn)濕；當(dāng) θ=90°，是潤(rùn)濕與否的分界線；當(dāng) θ＞90°，不潤(rùn)濕；當(dāng) θ=180°，完全不潤(rùn)濕。

2 結(jié)果與分析

2.1 PL的MIC

著-聚賴氨酸對(duì)3 種菌的最低抑菌濃度見(jiàn)圖1。

圖1 ε-聚賴氨酸對(duì)3 種菌的最低抑菌濃度Fig.1 MIC of PL solution for different microorganisms

圖1 試驗(yàn)結(jié)果表明，PL 對(duì)3 種菌都有明顯的抑菌作用，但對(duì) 3 種菌的 MIC 不同。PL 濃度為 1 μg/mL 時(shí)，對(duì)大腸桿菌表現(xiàn)出抑菌作用；PL 濃度為2 μg/mL 時(shí)，對(duì)枯草芽孢桿菌和酵母菌表現(xiàn)出抑菌作用。

PL 對(duì)大腸桿菌、枯草芽孢桿菌和酵母菌均有良好的抑菌效果。不同著-聚賴氨酸濃度的膜對(duì)3 種菌的抑菌圈直徑見(jiàn)圖2。

圖2 不同ε-聚賴氨酸濃度的膜對(duì)3 種菌的抑菌圈直徑Fig.2 The inhibition zone diameter of films with different concentrations of PL to different microorganisms

根據(jù)圖2 可得，對(duì)大腸桿菌的抑菌效果最佳，枯草芽孢桿菌和酵母菌其次。PL 的抑菌機(jī)理在于破壞微生物的細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，造成細(xì)胞壁與細(xì)胞質(zhì)分離，菌體塌陷，細(xì)胞質(zhì)溢出等現(xiàn)象，破壞菌體正常生理代謝，引起細(xì)胞的物質(zhì)、能量和信息傳遞中斷，與細(xì)胞內(nèi)部物質(zhì)發(fā)生作用，破壞細(xì)胞核心，造成紫外吸收物溢出，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡[20]。在3 種菌中，產(chǎn)生差異主要原因是細(xì)胞壁的不同厚度和組分造成。

2.2 PL/St膜的抑菌性

含著-聚賴氨酸的St 膜最低抑菌濃度見(jiàn)圖3。

圖3 含ε-聚賴氨酸的St 膜最低抑菌濃度Fig.3 MIC of St films with different concentrations of PL to different microorganisms

從圖3 抑菌性結(jié)果來(lái)看，濃度為32 mg/g 的PL 抑菌膜對(duì)3 種菌有微弱的抑菌性。濃度為64 mg/g 的PL抑菌膜對(duì)3 種菌都有著明顯的抑菌性，抑菌圈的環(huán)形區(qū)域較大，說(shuō)明該濃度抑菌膜具有良好的抑菌效果。單一的St 膜并不具備抑菌效果，而在淀粉糊化后，加入PL 作為抑菌劑，能對(duì)St 膜的抑菌效果得到改善，使其具有抑菌性。PL/St 抑菌膜的抑菌效果，隨著PL 的濃度增大而增強(qiáng)。

PL/St 膜的濃度為64 mg/g 時(shí)，對(duì)大腸桿菌、枯草芽孢桿菌和酵母菌都有明顯的抑菌效果，且抑菌性較強(qiáng)，但和PL 的抑菌性相比，其抑菌膜的濃度提高較大，原因是PL 溶液能較好地與培養(yǎng)基接觸并滲透到培養(yǎng)基中，而膜只有表面和邊緣接觸，導(dǎo)致MIC 提高較大。選用濃度64 mg/g 的抑菌膜來(lái)進(jìn)行性能檢測(cè)，并與St 膜進(jìn)行對(duì)比。

2.3 膜性能檢測(cè)

2.3.1 抗拉強(qiáng)度和斷裂延伸率

抗拉強(qiáng)度和斷裂延伸率見(jiàn)圖4。

圖4 抗拉強(qiáng)度和斷裂延伸率Fig.4 Tensile strength and elongation

如圖4 結(jié)果表明，兩種膜相比，St 膜的抗拉強(qiáng)度（Ts）較好，PL/St 膜的斷裂延伸率（E）有所提高。原因在于所用著-聚賴氨酸的分子量只有5 000 Da，而淀粉的分子量達(dá)到了幾百萬(wàn)，在攪拌的過(guò)程中，PL 能呈現(xiàn)分子狀態(tài)[21]，能較好的進(jìn)入淀粉分子的間隙之中，降低產(chǎn)品的剛性，增加其的柔韌性，起到松弛大分子的作用，從而使Ts 降低、E 增加。

2.3.2 水蒸氣透過(guò)率

水分透水速率和水分透過(guò)系數(shù)見(jiàn)圖5。

圖5 水分透水速率和水分透過(guò)系數(shù)Fig.5 Water vapor transmission rate and water vapor permeability

如圖5 研究結(jié)果表明，St 膜和PL/St 抑菌膜的水蒸氣透過(guò)率和水蒸氣透過(guò)系數(shù)都較大，說(shuō)明St 膜和PL/St 抑菌膜的阻濕性能較差，PL/St 抑菌膜的透水速率與透水系數(shù)均比淀粉膜的要大，原因是由于PL 是親水性的陽(yáng)離子多聚物，還有大量的極性氨基酸，具有較強(qiáng)親水性，著-聚賴氨酸分子分散在淀粉分子中間，增強(qiáng)了水分的滲透作用，故PL/St 抑菌膜的阻濕性要比淀粉膜差。

2.3.3 透油性

試驗(yàn)過(guò)程中，通過(guò)稱量濾紙片的質(zhì)量來(lái)判斷透油性。膜的透油性見(jiàn)圖6。

圖6 兩種膜的透油性Fig.6 Oil permeability of two different films

St 膜和PL/St 抑菌膜第2 天濾紙片的重量與第1天相比，都稍有下降，原因可能是濾紙本身水分含量會(huì)因?yàn)榄h(huán)境中水分濕度的改變而改變，之后幾天濾紙片的重量沒(méi)有太大的的變化?？梢哉J(rèn)為St 膜和PL/St抑菌膜的透油性為0。試驗(yàn)結(jié)果表明，St 膜和PL/St 抑菌膜都有著非常好的阻油性。

2.3.4 FTIR 分析

膜的紅外光譜分析見(jiàn)圖7。

圖7 膜的紅外光譜分析Fig.7 FTIR spectra of different films

從文獻(xiàn)[22]可知，淀粉在 3 360、2 928、1 646 、1 021 cm-1處有特征吸收峰。PL 在 3 382、3 362、3 081、1 633、1 535 cm-1處有特征吸收峰[23]。3 460 cm-1處為-OH 的振動(dòng)吸收峰，2 938 cm-1處為C-H 鍵的伸縮振動(dòng)峰，1 210 cm-1處為C-O 伸縮振動(dòng)吸收峰。1 100 cm-1處為C-O-C 的伸縮振動(dòng)吸收峰。由于添加抑菌劑等小分子質(zhì)量分?jǐn)?shù)較小，對(duì)質(zhì)量比較高的大分子淀粉分子的作用力影響較小，紅外光譜分析分子間較弱的相互作用力的表現(xiàn)較弱。

2.3.5 流變性能

膜的流變性能檢測(cè)見(jiàn)圖8。

圖8 膜的流變性能檢測(cè)Fig.8 Rheological curve of different film fluids

如圖8，當(dāng)樣品膜液糊化完成后，隨著剪切速率的增大，膜液的粘度經(jīng)過(guò)先平穩(wěn)后急劇下降再緩慢下降等過(guò)程，說(shuō)明在0.3 s-1時(shí)，膜液發(fā)生剪切變稀現(xiàn)象，具有非牛頓流體特性。由于抑菌劑的添加量較少，與淀粉膜液相比，流變性有一定差異，但總體流變性基本一致。

2.3.6 接觸角

St 膜液和PL/St 膜液的接觸角見(jiàn)圖9。

圖9 兩種膜液的接觸角Fig.9 Contact angle of two different film fluids

如圖9 所示，經(jīng)過(guò)接觸角測(cè)量?jī)x的測(cè)量，得出的數(shù)據(jù)結(jié)果為：淀粉膜液的接觸角為123.19°，PL/St 膜液的接觸角為125.61°。從試驗(yàn)結(jié)果可以得出，St 膜液和PL/St 膜液的接觸角都較大，揭膜的難易程度相差較小，都比較容易揭膜。

3 結(jié)論

本文研究PL 的抑菌性并借鑒前期的制膜方法對(duì)PL 加入到St 膜中的各種性能進(jìn)行研究，結(jié)果表明：PL對(duì)大腸桿菌、枯草芽孢桿菌和酵母菌的MIC 分別為1、2、2 μg/mL；St 膜中加入抑菌劑 PL 對(duì) St 抑菌膜的抑菌性有著較好效果，濃度為64 mg/g 的PL/St 膜對(duì)大腸桿菌、枯草芽孢桿菌和酵母菌有著明顯的抑菌作用；PL/St 抑菌膜與St 膜相比，抗拉強(qiáng)度下降，但斷裂延伸率有所提升。PL/St 膜與St 膜的阻濕性均較差，均有較好的阻油性；力學(xué)性能測(cè)試、紅外表征、流變性和接觸角檢測(cè)表明添加少量的PL 對(duì)St 膜性能影響較小。