正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)在茶葉鐵、鋅、銅含量測定中的應(yīng)用

鄧波，王莎，吳漢奇

（1.川北醫(yī)學(xué)院預(yù)防醫(yī)學(xué)系，四川南充637000；2.岳池縣人民醫(yī)院，四川岳池638300）

茶葉在我國具有悠久的歷史，是國人喜愛的天然飲品之一。近年來，隨著人們生活水平和認(rèn)知水平的提高，人們也日益關(guān)注茶葉的質(zhì)量，茶葉的營養(yǎng)與安全問題已成為目前老百姓關(guān)注的熱點(diǎn)之一。

鐵、鋅、銅均是人體必不可缺的微量元素，是人體的重要組成成分，對人體的健康起著不可忽視的重要作用。但是當(dāng)其的攝入過低或過量的時候，就會對人體健康造成一定的不良影響，對人體產(chǎn)生傷害。所以，對茶葉中的鋅、鐵、銅元素的檢測可以了解茶葉中相關(guān)金屬元素的含量，對人們的健康具有現(xiàn)實(shí)意義。根據(jù)國家標(biāo)準(zhǔn)GB 5009.90-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中鐵的測定》[1]、GB 5009.14-2017《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中鋅的測定》[2]，和GB 5009.13-2017《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中銅的測定》[3]，對食品中鐵、鋅、銅的測定方法主要有：電感耦合等離子體質(zhì)譜法、火焰原子吸收光譜法、電感耦合等離子體發(fā)射光譜法。采用火焰原子吸收光譜法測定鐵、鋅、銅含量，具有靈敏度高、準(zhǔn)確性好、方法簡單、結(jié)果精確等優(yōu)點(diǎn)[4-5]。同時，微波消解技術(shù)是最近幾年新興的一種高效的樣品前處理技術(shù)，是目前應(yīng)用較多的一種方法。因其具有耗時短、消解徹底、能快速處理大量樣品、且準(zhǔn)確度高等優(yōu)點(diǎn)[6]，近年來被廣泛應(yīng)用。然而影響微波消解效果的因素很多，如樣品的種類、消解劑的種類及含量、消解壓力、爬坡時間、功率等。并且微波消解條件的設(shè)置是否合適，與樣品前處理的效果直接相關(guān)，且影響著樣品中金屬元素檢測結(jié)果的真實(shí)性和可靠性。正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)正是利用一套規(guī)格化的正交表安排試驗(yàn)，能在多試驗(yàn)條件中選出代表性強(qiáng)的少數(shù)試驗(yàn)方案，通過對這些少數(shù)試驗(yàn)方案結(jié)果的分析，從中找出最優(yōu)方案，此法已被廣泛應(yīng)用[7-11]。因此，本研究通過正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)對茶葉中鐵、鋅、銅含量測定的微波消解條件進(jìn)行優(yōu)化，建立火焰原子吸收光譜法準(zhǔn)確測定茶葉中鐵、鋅、銅含量的最佳前處理方法，為相關(guān)部門對茶葉中微量元素的檢測提供一定的參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

某品牌茶葉：市售；1 000 μg/mLFe 標(biāo)準(zhǔn)溶液、1 000 μg/mLZn 標(biāo)準(zhǔn)溶液、1 000 μg/mLCu 標(biāo)準(zhǔn)溶液：國家有色金屬及電子材料分析測試中心；硝酸（電子級）：蘇州晶瑞化學(xué)股份有限公司；過氧化氫（優(yōu)級純）：美國默克公司。

1.2 儀器及設(shè)備

VCD 酸蒸清洗儀：德國安東帕公司；Titan MPS 微波消解儀、PinAAcle 900T 原子吸收光譜儀：珀金埃爾默儀器有限公司；GHP400P 智能控溫電熱板：奧普勒公司；FA114 電子分析天平：上海豪晟科學(xué)儀器有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 試驗(yàn)前準(zhǔn)備

利用酸蒸清洗儀對試驗(yàn)所用的器材清洗干凈，備用；超市隨機(jī)購買某品牌茶葉，研磨備用。加標(biāo)液的制備：分別吸取1000μg/mL 鐵標(biāo)準(zhǔn)溶液10 mL，1 000 μg/mL的 Zn 標(biāo)準(zhǔn)溶液 3 mL，1 000 μg/mL 的 Cu 標(biāo)準(zhǔn)溶液4 mL 于100 mL 容量瓶中并用純凈水定容、搖勻，即得混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液，用于消解開始前對樣品進(jìn)行加標(biāo)。

1.3.2 單因素試驗(yàn)

參考已發(fā)表的有關(guān)茶葉中微量元素測定的文獻(xiàn)[12-14]，選取適宜的前處理?xiàng)l件進(jìn)行試驗(yàn)。試驗(yàn)針對微波消解中影響消解效果的關(guān)鍵步驟中的各條件進(jìn)行，分別稱取茶葉樣本0.3 g 左右，置于消化罐中，分別采用硝酸含量（2、4、6、8、10、12 mL）、溫度（140、150、160、170、180、190 ℃）、消解壓力（30、40、50、60、70、80 bar）和保持時間（10、15、20、25、30、35 min）對樣本進(jìn)行消解，通過對其中的Fe、Zn、Cu 進(jìn)行檢測，以加標(biāo)回收率來判斷硝酸消耗量、消解溫度、消解壓力和保持時間對消解效果的影響。

1.3.3 正交試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)的結(jié)果，確定樣品前處理中的硝酸含量、溫度、消解壓力、保持時間為4 個研究因素，根據(jù)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)中的L9（34）正交表設(shè)計(jì)試驗(yàn)，對樣品進(jìn)行微波消解，消解完成并進(jìn)行趕酸處理后應(yīng)用火焰原子吸收光譜儀測定消解液的分光光度值。通過鐵、鋅、銅的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，然后根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方程及所測得的消解液的分光光度值計(jì)算消解液中鐵、鋅、銅的含量。以加標(biāo)回收率為評價(jià)指標(biāo)，得出最佳前處理?xiàng)l件。正交試驗(yàn)因素水平表見表1。

表1 正交試驗(yàn)因素水平表Table 1 Levels of digestion

1.3.3.1 樣品前處理

取7 個微波消解罐分別編號0 號～6 號，其中0 號為空白對照，使用電子分析天平準(zhǔn)確稱取茶葉樣品0.3 g 左右，分別置于1 號～6 號微波消解罐中，按正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)所設(shè)計(jì)出的條件分批逐一消解樣品。量取一定體積的硝酸于7 個消解罐中，混勻，靜置5 min 左右使硝酸與樣品進(jìn)行初步反應(yīng)后，再向每個消解罐中加入 2 mL 過氧化氫，靜置 5 min，然后向 2、4、6 號 3 個消解罐中加入0.5 mL 上述混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液，蓋緊消解罐內(nèi)蓋置入微波消解儀中，按照設(shè)定程序進(jìn)行消解，其中消解共分為3 個步驟，本試驗(yàn)采取的方法為固定步驟1 和步驟3，對影響消解效果的關(guān)鍵步驟（步驟2）進(jìn)行試驗(yàn)條件的調(diào)整，表中步驟2 中待定程序按表1 設(shè)定。消解程序完成后，取出消解罐將消解液移入燒杯中，并用純凈水清洗消解罐內(nèi)蓋及消解罐3 次～4 次一并倒入燒杯中，趕酸后，將其多次洗滌并轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶中，并用純凈水定容，搖勻，即得樣本液，待測。微波消解的升溫程序見表2。

表2 微波消解升溫程序Table 2 The heating process of microwave digestion system

1.3.3.2 儀器工作條件

本次試驗(yàn)的原子吸收光譜工作條件見表3。

表3 儀器工作條件Table 3 Working coitions of atomic absorption spectrometry

1.3.3.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備

取鐵、鋅、銅的標(biāo)準(zhǔn)溶液配置一系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。取1 000 μg/mL 的鐵標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋至50 mg/L，分別取1、2、3、4、5 mL 于 100 mL 容量瓶中并用純凈水定容，得到鐵的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。取1 000 μg/mL Zn 標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋至 25 mg/L，分別取 0.6、1.2、1.8、2.4、3.0 mL 于 100 mL 容量瓶中并定容，得到鋅的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。取1 000 μg/mL的銅標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋至 25 mg/L，分別取 0.8、1.6、3.2、6.4、12.8 mL 于100 mL 容量瓶中并用純凈水定容，得到銅的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.3.3.4 測定元素含量

以純凈水作為試劑空白與標(biāo)準(zhǔn)空白，使用火焰原子吸收光譜儀測定上述系列標(biāo)準(zhǔn)溶液和待測樣液的吸光度值。根據(jù)所得的標(biāo)準(zhǔn)曲線及標(biāo)準(zhǔn)方程，求得待測樣液中鐵、鋅、銅的含量。

1.4 數(shù)據(jù)處理

本次試驗(yàn)數(shù)據(jù)錄入EXCEL13.0 中，運(yùn)用公式計(jì)算得出均數(shù)和極差。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)方程及相關(guān)系數(shù)

原子吸收光譜儀按照表3 條件下工作，測定標(biāo)準(zhǔn)溶液，最終測得Fe、Zn 和Cu 的標(biāo)準(zhǔn)方程分別為y=0.084 90x+0.000 65（r2=0.999 5）、y=0.685 89x+0.000 42（r2=0.999 8）和 y=0.198 5x+0.001 1（r2=0.999 8）。由此可知微量元素Fe、Zn、Cu 的線性關(guān)系及相關(guān)性較好。

2.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果

單因素試驗(yàn)結(jié)果表明，就硝酸的消耗量來看，F(xiàn)e，Zn 和Cu 的加標(biāo)回收率最好的硝酸消耗量分別是6、6、8 mL。就溫度的影響來看，F(xiàn)e，Zn 和 Cu 的加標(biāo)回收率分別在190、190、180 ℃為最高。就消解壓力的影響來看，F(xiàn)e，Zn 和 Cu 的加標(biāo)回收率分別在 50、60、60 bar時最高。就保持時間的影響來看，F(xiàn)e，Zn 和Cu 的加標(biāo)回收率均在20 min 時最高。

2.3 正交試驗(yàn)結(jié)果

以加標(biāo)回收率作為評價(jià)指標(biāo)，所得正交試驗(yàn)檢測結(jié)果見表4。

在表4 中，Ki代表任何一列水平號為 i（i=1，2，3）時所對應(yīng)的回收率均數(shù)之和，K1、K2、K3則表示任何一列水平號為i（i=1，2，3）時所對應(yīng)的平均回收率均數(shù)；極差R 表示任何一列中K1、K2、K3中的最大值和最小值的差值。因?yàn)闃O差R 的值越大，則對應(yīng)的因素影響力越大，通過極差分析結(jié)果可知：對于微量元素鐵而言，影響微波消解效果的因素依次為硝酸含量、消解壓力、保持時間和溫度；對于微量元素鋅來說，微波消解過程中保持時間是最重要的因素，其次為溫度，然后是硝酸含量，最后是消解壓力。Ki值的大小表示所選擇的每個因素的3 個不同水平對試驗(yàn)結(jié)果的影響力大小，其值越大，則影響力越大。因此，對于微量元素鐵，微波消解的最佳組合方案為A2B3C2D2，即硝酸含量6 mL、溫度 190 ℃、消解壓力 50 bar、保持時間 20 min；對于微量元素鋅，其最優(yōu)前處理?xiàng)l件為：A3B3C2D3，即為硝酸含量8 mL，溫度190 ℃，消解壓力50 bar，保持時間25 min。對于銅，影響微波消解效果的因素順序是溫度、保持時間、硝酸含量以及消解壓力，其微波消解優(yōu)化組合是A3B2C3D1，即：硝酸含量8 mL，溫度170 ℃，壓力60 bar，和保持時間15 min。

2.4 驗(yàn)證試驗(yàn)

準(zhǔn)確稱取茶葉樣本0.300 0 g，共6 份，在本試驗(yàn)所得的3 種元素的最佳前處理?xiàng)l件下進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，分別得到 Fe、Zn、Cu 的加標(biāo)回收率平均為 99.73 %，98.91%和100.02%，與趙永福[4]的結(jié)果比較，回收率和精密度均較優(yōu)，說明本文的結(jié)果方法可取。

2.5 精密度與檢出限測定

Fe、Zn、Cu 精密度測試時分別選擇濃度為 1.5、0.45、0.8 mg/L 的標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別連續(xù)測定7 次即可得出該元素的精密度。測試結(jié)果顯示：Fe、Zn、Cu 的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別時0.25%、0.11%和0.2%。檢出限測試時使用試劑空白連續(xù)測定11 次即得。結(jié)果顯示：Fe、Zn、Cu 的檢出限分別為0.014 1、0.001 3、0.0030 2 mg/L。3種元素的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差和檢出限均在儀器允許的誤差范圍之內(nèi)，說明火焰原子吸收光譜儀在該工作條件下，檢測的準(zhǔn)確可靠性高，重復(fù)性好，精密度也較高。

3 結(jié)論與討論

預(yù)試驗(yàn)階段，在樣本的前處理準(zhǔn)備時，消化液的加入量和加入速度需要特別注意。由于本次試驗(yàn)所用的樣本為茶葉，研磨后為一種輕質(zhì)粉末，在加入雙氧水和硝酸后，會因?yàn)榉磻?yīng)而產(chǎn)生類似沸騰的現(xiàn)象，樣本反應(yīng)太迅速，導(dǎo)致產(chǎn)生的氣體帶著樣本液體直接溢出消解罐，影響消解效果。此現(xiàn)象可以通過增加硝酸和雙氧水加入的時間間隔來解決，本次試驗(yàn)，我們使用的時間間隔為2 min，有效的避免了樣本損失。

陳文生等[15]在用正交試驗(yàn)法測定茶葉中的微量元素時得出結(jié)果表明：對于元素鈣，其影響因素依次為消解液的體積比（HNO3/H2O2）、消解時間、消解液的用量，最佳前處理方案是HNO3/H2O2的體積比為2 ∶1，消解時間為105 min，消解液用量10 mL。趙欣等[16]通過對陳醋中的幾種微量元素的同時進(jìn)行正交試驗(yàn)分析，以尋求最佳前處理方法。本試驗(yàn)通過正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，得到影響微量元素鐵的因素從高到低依次為硝酸含量、消解壓力、保持時間和溫度，其微波消解的最佳組合方案為硝酸含量6 mL，溫度190 ℃，消解壓力50 bar，保持時間20 min；對于微量元素鋅來說，微波消解過程中保持時間是最重要的因素，其次為溫度，然后是硝酸含量，最后是消解壓力，其最優(yōu)消解條件為硝酸含量8 mL、溫度 190 ℃、消解壓力 50 bar、保持時間 25 min；影響Cu 微波消解效果的因素順序是溫度、保持時間、硝酸含量以及消解壓力，最佳前處理?xiàng)l件組合是為硝酸含量8 mL，溫度170 ℃，消解壓力60 bar，和保持時間15 min。經(jīng)過優(yōu)化后的微波消解法較之傳統(tǒng)的試驗(yàn)條件的選擇和更換來說，具有消解迅速、徹底、準(zhǔn)確度高、精密度好高效、污染環(huán)境小等特點(diǎn)，適宜在試驗(yàn)條件的優(yōu)化中推廣應(yīng)用。

本試驗(yàn)通過使用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化后的前處理?xiàng)l件進(jìn)行微波消解，減少試驗(yàn)次數(shù)，提高試驗(yàn)效率，增加了試驗(yàn)準(zhǔn)確性，在今后的研究中，可考慮多種方法的聯(lián)合使用[17-18]，以增強(qiáng)試驗(yàn)的效率。本次試驗(yàn)所用的各種前處理方法條件，均能將樣本有效的消解，花費(fèi)時間短，消耗的試劑少，適用于所有茶葉中Fe、Zn、Cu含量的測定，所得出的結(jié)果可為有關(guān)檢測部門對茶葉的測定提供參考依據(jù)，具有比較重要的實(shí)踐意義。