MIR6766的抗百草枯功能及其分子機(jī)制初探

李娜，陳晨，董研博，王健，李山虎

軍事醫(yī)學(xué)研究院 生物工程研究所，北京 100850

百草枯（paraquat，PQ），化學(xué)名1-1-二甲基- 4-4-聯(lián)吡啶陽(yáng)離子鹽，在溶液中以PQ2+形式存在，它可以接受一個(gè)電子形成一種穩(wěn)定的紫色或藍(lán)色的百草枯自由基即PQ·+，因此最初用做氧化還原指示劑[1]。后發(fā)現(xiàn)PQ能快速殺死綠色植物，但在土壤中會(huì)被滅活，對(duì)植物根及宿根不發(fā)揮作用，而成為世界上最廣泛應(yīng)用的農(nóng)藥之一。

百草枯進(jìn)入體內(nèi)后，多數(shù)通過(guò)多胺攝取系統(tǒng)特異性地集中在肺里，尤其是肺泡Ⅰ、Ⅱ型及克拉克細(xì)胞，對(duì)肺泡細(xì)胞造成極大損傷。它的毒性極大地可能源于氧化應(yīng)激產(chǎn)生的活性氧類(lèi)物質(zhì)（reactive oxygen species，ROS）[2]。PQ2+可以通過(guò)細(xì)胞內(nèi)的氧化還原酶，如還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）氧化酶、細(xì)胞色素P450氧化還原酶（cytochrome P450 oxidoreductase，POR）、還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）泛醌/醌氧化還原酶、黃嘌呤氧化酶、一氧化氮合酶、硫氧還蛋白還原酶等[3-4]被還原為PQ·+，在有氧情況下PQ·+又重新被氧化為PQ2+，此過(guò)程可產(chǎn)生氧自由基（O·-）、過(guò)氧化氫（H2O2）、羥基自由基（OH·-）等一系列ROS，對(duì)細(xì)胞DNA、脂質(zhì)、蛋白質(zhì)、線(xiàn)粒體等造成傷害，引起細(xì)胞炎癥，進(jìn)而致細(xì)胞死亡。由于不當(dāng)使用，PQ會(huì)造成人的肺、腎等多器官衰竭及神經(jīng)退行性疾病，目前無(wú)特效解毒藥。

Reczek等使用約含3000個(gè)代謝基因的代謝組文庫(kù)通過(guò)CRISPR/Cas9技術(shù)進(jìn)行百草枯抗性的篩選，發(fā)現(xiàn)POR、ATP7A等一系列潛在的抗性基因，經(jīng)150 μmol/L PQ處理48 h后，敲除POR基因的細(xì)胞內(nèi)外的H2O2水平較對(duì)照細(xì)胞均顯著降低[5]，提示POR基因可能是產(chǎn)生ROS的主要原因。百草枯引起細(xì)胞死亡的分子機(jī)制復(fù)雜，氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)及自噬都參與其中[5-7]。為了篩選出更加有效和具潛力的百草枯抗性基因，可以使用全基因組文庫(kù)篩選抗性基因，以求能更清晰地闡述百草枯引起死亡的分子機(jī)制。

本研究中，我們使用CRISPR/Cas9全基因組敲除文庫(kù)對(duì)A549細(xì)胞進(jìn)行百草枯耐藥基因篩選，篩選出一系列單鏈向?qū)NA（small guide RNA，sgRNA）富集的抗性基因，其中包含MIRNA6766與POR等基因。細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)證實(shí)MIR6766敲除細(xì)胞表現(xiàn)出抗百草枯表型，其可能機(jī)制為間接降低了POR的表達(dá)水平，進(jìn)而減弱了百草枯對(duì)細(xì)胞的毒性作用，為進(jìn)一步研究MIR6766對(duì)百草枯抗性作用的分子機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

A549細(xì)胞、HEK293T細(xì)胞、大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α和DH10B為本實(shí)驗(yàn)室保存；PQ為毒物藥物研究所贈(zèng)送；胎牛血清（FBS）購(gòu)自杭州四季青公司；青霉素和鏈霉素購(gòu)自華北制藥有限公司；DMEM高糖培養(yǎng)基和含0.25% EDTA的胰蛋白酶購(gòu)自Gibco公司；PBS購(gòu)自索萊寶公司；嘌呤霉素購(gòu)自HyClone公司；Genome-scale CRISPR Knock-Out v2.0 pooled libraries（GeCKO v2 libraries）購(gòu)自 Addgene公司；LipofectAMINE 3000轉(zhuǎn)染試劑盒、BCA蛋白定量試劑盒購(gòu)自Thermo公司；質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自Axygen公司；miRcute增強(qiáng)型miRNA cDNA第一鏈合成試劑盒和miRcute增強(qiáng)型miRNA熒光定量檢測(cè)試劑盒購(gòu)自天根公司；Cell Counting Kit8（CCK8）試劑盒購(gòu)自東仁化學(xué)科技有限公司；POR抗體購(gòu)自Abcam公司；CO2恒溫培養(yǎng)箱和MULTISKAN FC酶標(biāo)儀購(gòu)自Thermo公司；Q-PCR儀器購(gòu)自伯樂(lè)公司。

1.2 GeCKO v2 libraries擴(kuò)增及慢病毒包裝

采用電擊轉(zhuǎn)化法將GeCKO v2 libraries A、B文庫(kù)各1 μL轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)菌，轉(zhuǎn)化后涂固體LB氨芐培養(yǎng)基，37℃溫箱培育14 h，刮取平板上的轉(zhuǎn)化子提取質(zhì)粒并測(cè)定濃度后保存于-20℃。用LipofectAMINE 3000、文庫(kù)質(zhì)粒與包裝質(zhì)粒共同感染HEK293T細(xì)胞，包裝出慢病毒，測(cè)定病毒滴度。

1.3 全基因組CRISPR/Cas9敲除文庫(kù)篩選百草枯抗性基因

根據(jù)測(cè)定的慢病毒的滴度，將含有sgRNA的文庫(kù)慢病毒感染A549細(xì)胞，使感染復(fù)數(shù)（multipilicity of infection，MOI）≤0.3，以保證每個(gè)細(xì)胞內(nèi)有且只有1個(gè)sgRNA。為保證MOI在符合范圍內(nèi)，當(dāng)細(xì)胞數(shù)達(dá)到3.6×108時(shí)，用175 cm2培養(yǎng)瓶接種初始細(xì)胞4×106/瓶。待嘌呤霉素篩選后將細(xì)胞平均分為3組，即0 d組（day0）、對(duì)照組（0 μmol/L百草枯）和藥物篩選組（12 μmol/L百草枯）。day0組在嘌呤篩選后即開(kāi)始藥物篩選時(shí)凍存6×107細(xì)胞。為保證sgRNA的穩(wěn)定富集，另2組分別以6×107細(xì)胞傳代，每組細(xì)胞數(shù)達(dá)到1.2×108時(shí)傳代，傳10代后分別取6×107細(xì)胞凍存，與day0組一起送上海尋百會(huì)公司進(jìn)行深度測(cè)序與生物信息分析，得到sgRNA穩(wěn)定富集的基因。

1.4 候選抗百草枯基因MIR6766/POR敲除質(zhì)粒構(gòu)建和細(xì)胞系建立

使用CRISPR-LentiV2質(zhì)粒作為構(gòu)建敲除細(xì)胞的慢病毒表達(dá)載體系統(tǒng)，靶向MIR6766、POR，對(duì)照基因的sgRNA上下游序列由博邁德公司合成。將sgRNA上下游引物按照梯度降溫的方法退火，將CRISPR-LentiV2質(zhì)粒用BsmBⅠ酶切后膠回收，二者產(chǎn)物通過(guò)T4DNA連接酶連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH10B后涂于氨芐LB固體培養(yǎng)基，挑取單克隆菌落培養(yǎng)500 μL菌液，用設(shè)計(jì)的鑒定引物菌液PCR擴(kuò)增目的條帶，鑒定正確后將菌液送博邁德生物公司測(cè)序，測(cè)序正確后提取目的質(zhì)粒，測(cè)定濃度后于-20℃保存。

將293T細(xì)胞以70%～80%的密度接種于100 mm皿中，24 h后進(jìn)行慢病毒包裝。按照慢病毒包裝質(zhì)粒pMD2G∶包裝質(zhì)粒pSPA×2∶目的質(zhì)粒為1∶3∶4的比例與PEI一起轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，12 h后換液，24、48 h后分別收取含有病毒顆粒的培養(yǎng)液即慢病毒，用0.45 μm的濾膜過(guò)濾分裝后于-80℃保存。將A549細(xì)胞以30%～40%的密度接種于100 mm皿中，24 h后進(jìn)行慢病毒的感染。以完全DMEM培養(yǎng)液∶慢病毒為1∶1的比例加于培養(yǎng)皿中，并添加終濃度為10 g/L的聚凝胺，12 h后更換新鮮培養(yǎng)液，更換培養(yǎng)液后24 h加入終濃度為1.5 μg/mL嘌呤霉素進(jìn)行抗性篩選48 h，存活的細(xì)胞即為感染目的質(zhì)粒成功的細(xì)胞。

1.5 Q-PCR驗(yàn)證對(duì)照與敲除細(xì)胞的相關(guān)基因表達(dá)

感染成功的細(xì)胞采用TRIzol法提取RNA，反轉(zhuǎn)錄出cDNA，進(jìn)行Q-PCR鑒定。

1.6 CCK8法檢測(cè)細(xì)胞存活率

對(duì)照細(xì)胞與敲除細(xì)胞以7×103/孔接種于96孔培養(yǎng)板，20 h后用于實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)設(shè)空白組、對(duì)照組（不加百草枯）、100 μmol/L百草枯組、150 μmol/L百草枯組，每組3個(gè)復(fù)孔。藥物作用72 h后棄去原有培養(yǎng)液。將CCK8液與培養(yǎng)液按1∶10的比例混勻后每孔加入100 μL，2 h后用酶標(biāo)儀測(cè)定D450nm值。細(xì)胞存活率（%）=（D藥物組-D空白組）/（D對(duì)照組-D空白組）。

1.7 Western印跡驗(yàn)證POR基因蛋白水平表達(dá)

將對(duì)照與敲除細(xì)胞接種于60 mm皿中，待細(xì)胞生長(zhǎng)至80%～90%時(shí)用PBS清洗2次，吸盡殘存的PBS后置于-80℃，次日取出后加入適量的細(xì)胞裂解液，冰上裂解30 min，吹打轉(zhuǎn)移至離心管，4℃、12 000 r/min離心 10 min，取上清，加入5×SDS上樣緩沖液，用10%分離膠進(jìn)行SDS-PAGE，電泳后轉(zhuǎn)膜。POR蛋白使用兔種屬一抗（1∶500），4℃孵育過(guò)夜；鼠抗兔二抗（1∶2000），室溫孵育1 h。GAPDH使用鼠種屬一抗（1∶10 000），4℃孵育過(guò)夜；羊抗鼠二抗（1∶20 000），室溫孵育30 min?；瘜W(xué)發(fā)光系統(tǒng)拍照。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

用GraphPad Prism 7軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析及制圖，連續(xù)型變量以x±s表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CRISPR-Cas9敲除文庫(kù)篩選出A549細(xì)胞耐百草枯基因MIR6766

如圖1A，用CRISPR-Cas9敲除文庫(kù)慢病毒感染A549細(xì)胞，經(jīng)嘌呤霉素篩選后，建立了全基因組敲除的A549細(xì)胞庫(kù)。將全部細(xì)胞分為day0組、對(duì)照組（0 μmol/L PQ）和實(shí)驗(yàn)組（12 μmol/L PQ），篩選細(xì)胞傳10代后提取基因組DNA，經(jīng)高通量測(cè)序和生物信息學(xué)分析，獲得了抗百草枯的候選基因（圖1B），為進(jìn)一步篩選百草枯的抗性基因提供依據(jù)。

圖1 利用CRISPR/Cas9文庫(kù)篩選出抗百草枯基因MIR6766與POR

2.2 構(gòu)建敲除MIR6766、POR的細(xì)胞系

使用對(duì)照和敲除MIR6766、POR表達(dá)的sgRNA慢病毒感染A549細(xì)胞（sgRNA上下游序列見(jiàn)表1），經(jīng)嘌呤霉素篩選后得到穩(wěn)定對(duì)照細(xì)胞系（sg-control）和MIR6766敲 除 細(xì) 胞 系（sg-MIR6766）、POR基因敲除細(xì)胞系（sg-POR）。提取sg-control、sg-MIR6766的細(xì)胞總 RNA，反轉(zhuǎn)錄出cDNA，實(shí)時(shí)熒光定量PCR定量分析（GAPDH和MIR6766熒光定量PCR引物見(jiàn)表2）。以sg-control為對(duì)照樣品，GAPDH表達(dá)量為對(duì)照表達(dá)量，熒光定量結(jié)果如圖2A，sg-MIR6766中MIR6766表達(dá)量相對(duì)于sg-control顯著降低（P＜0.05），表明構(gòu)建出敲除MIR6766的細(xì)胞系。Western印跡表明針對(duì)POR基因2個(gè)靶點(diǎn)均顯著抑制POR的表達(dá)（圖2B），從而構(gòu)建了敲除POR基因的A549細(xì)胞系。

圖2 構(gòu)建MIR6766與POR敲除細(xì)胞系

表1 CRISPR/Cas9 sgRNA序列

表2 熒光定量PCR引物序列

2.3 敲除MIR6766和POR細(xì)胞系表現(xiàn)出百草枯耐藥性

CCK8細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果（圖3A）表明，經(jīng)100、150 μmol/L百草枯處理3 d后，對(duì)照細(xì)胞存活率分別為21%、13%，敲除MIR6766細(xì)胞系存活率為62%、43%，具有顯著性差異（P＜0.05）。敲除POR細(xì)胞系表現(xiàn)出同樣的存活率差異（圖3B、C）。這表明敲除MIR6766或POR基因后，細(xì)胞表現(xiàn)出抗百草枯表型。

圖3 MIR6766與POR敲除細(xì)胞表現(xiàn)出百草枯抗性表型

2.4 sg-MIR6766的POR基因mRNA與蛋白表達(dá)水平降低

sg-MIR6766的POR基因mRNA表達(dá)水平顯著低于對(duì)照細(xì)胞（P＜0.01，圖4A）。經(jīng)不同濃度百草枯處理3 d后，sg-MIR6766的POR蛋白表達(dá)量顯著低于對(duì)照細(xì)胞（圖4B、C）。提示MIR6766可能參與調(diào)控POR基因的表達(dá)。

圖4 MIR6766敲除細(xì)胞系中POR基因mRNA和蛋白表達(dá)水平

3 討論

百草枯中毒解救方法是醫(yī)學(xué)上的難題，臨床常應(yīng)用血液灌流法救治病人[8]。體外和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明，伏立諾他通過(guò)阻止Smad7在大鼠體內(nèi)去乙?；?，可在一定程度上減輕百草枯誘導(dǎo)的肺纖維化[9]；強(qiáng)力霉素通過(guò)抑制中性粒細(xì)胞來(lái)源的基質(zhì)金屬蛋白酶9，減輕百草枯引起的急性肺損傷[10]；姜黃素在一定程度上對(duì)肺纖維化有改善作用[11]；蜂毒肽對(duì)百草枯誘導(dǎo)的小鼠肺損傷具有調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激和凋亡的作用[12]。但以上救治方案效果并不理想，不能明顯降低百草枯引起的毒性損傷。

本研究利用CRISPR/Cas9全基因組敲除文庫(kù)在人肺癌A549細(xì)胞中篩選對(duì)百草枯耐藥基因，發(fā)現(xiàn)在百草枯作用下A549細(xì)胞中MIR6766基因的sgRNA得到富集，提示MIR6766基因可能參與百草枯耐藥表型的發(fā)生。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，敲除MIR6766細(xì)胞系對(duì)于百草枯引起的細(xì)胞死亡具有一定的抵抗作用，較對(duì)照細(xì)胞具有更高的存活率，表現(xiàn)出抗百草枯表型，提示MIR6766在百草枯引起的細(xì)胞死亡中發(fā)揮重要作用。

CRISPR/Cas9是一種古細(xì)菌防御系統(tǒng)，是由RNA引導(dǎo)的 CRISPR（clustered regularly interspaced short palindromic repeats，規(guī)律成簇間隔短回文重復(fù)）相關(guān)核酸酶Cas9切割DNA，導(dǎo)致在基因組的特定位點(diǎn)引入靶向功能突變?nèi)笔13]。人工合成的sgRNA可以引導(dǎo)Cas9在特定的基因組位點(diǎn)使DNA雙鏈斷裂[13]，產(chǎn)生移碼突變等導(dǎo)致基因功能缺失。大量sgRNA的集合可形成一個(gè)sgRNA文庫(kù)，從而可以編碼不同細(xì)胞的不同基因[14]。隨著CRISPR/Cas9高通量篩選系統(tǒng)的不斷發(fā)展和完善，已經(jīng)篩選獲得了一系列藥物治療耐藥基因或毒物抗性基因[15-17]。

POR基因編碼的細(xì)胞色素P450氧化還原酶位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜，對(duì)細(xì)胞色素P450催化的類(lèi)固醇激素、藥物代謝反應(yīng)等至關(guān)重要。它具有黃素腺嘌呤二核苷酸（FAD）結(jié)合結(jié)構(gòu)域和黃素類(lèi)毒素樣結(jié)構(gòu)域，可以結(jié)合2個(gè)輔助因子FAD和黃素單核苷酸（FMN），能給所有微粒體P450酶提供電子。Reczek等使用約含3000個(gè)代謝基因的sgRNA代謝組文庫(kù)進(jìn)行百草枯抗性篩選，發(fā)現(xiàn)降低POR基因表達(dá)可以降低百草枯引起的ROS水平，在百草枯引起的死亡中發(fā)揮了重要作用。本研究通過(guò)全基因組文庫(kù)也篩選出POR基因，敲除POR基因細(xì)胞也出現(xiàn)了抗百草枯表型。

MIR6766功能尚不明確。本研究表明MIR6766敲除細(xì)胞系中POR基因的mRNA與蛋白表達(dá)量顯著降低，而敲除POR基因的細(xì)胞也表現(xiàn)出抗百草枯表型，初步提示MIR6766可能通過(guò)影響POR基因表達(dá)量而發(fā)揮抗百草枯作用。但是兩者的相互作用機(jī)制，以及與百草枯耐藥的相關(guān)機(jī)制仍須深入探討。