利用丙氨酸掃描突變探究crotalphine結(jié)構(gòu)與鎮(zhèn)痛活性的關(guān)系

李夢，劉艷麗，王真，宋云揚(yáng)，蔣輝

國民核生化災(zāi)害防護(hù)國家重點實驗室，北京 102205

已往的研究[1-4]表明，南美洲響尾蛇恐怖亞科蛇的蛇毒（venom of crotalus durissus terrificus，VCDT）具有鎮(zhèn)痛作用。2008年，Konno等證實這種響尾蛇毒素中發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用的是一條由14個氨基酸殘基（＜EFSPENC QGESQPC，＜E代表焦谷氨酸，含有一對二硫鍵C7-C14）構(gòu)成的多肽，命名為crotalphine（CRP）[5-6]。Konno等在熱板實驗、炎癥模型等多種疼痛模型上，證實CRP注射給藥和口服鎮(zhèn)痛均具有良好的鎮(zhèn)痛活性[5-12]，因而CRP可以作為新型鎮(zhèn)痛藥物先導(dǎo)物，具有非常好的開發(fā)前景。然而，迄今有關(guān)CRP的結(jié)構(gòu)與其鎮(zhèn)痛活性關(guān)系的研究報道并不多，需要進(jìn)一步闡明。

丙氨酸掃描即是將蛋白的某段目標(biāo)序列或多肽中重要的氨基酸殘基替換成無特殊側(cè)鏈、中性的丙氨酸，研究突變前后目標(biāo)多肽的特定屬性的變化，從而確定關(guān)鍵的氨基酸位點，為氨基酸定點突變提供指導(dǎo)。為進(jìn)一步研究CRP結(jié)構(gòu)與其鎮(zhèn)痛活性之間的關(guān)系，我們采用丙氨酸掃描策略將CRP中所有非丙氨酸殘基位點進(jìn)行突變，共設(shè)計合成14個突變體（結(jié)構(gòu)見表1）。采用化學(xué)致痛的醋酸扭體實驗?zāi)Ｐ蛯RP突變體進(jìn)行鎮(zhèn)痛活性評價，研究CRP結(jié)構(gòu)中關(guān)鍵的氨基酸位點，為后續(xù)CRP的結(jié)構(gòu)改造研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

ICR 小鼠，3～4周齡，體重 20±2 g，購于北京華阜康生物責(zé)任有限公司。

CRP的丙氨酸突變體多肽由南京金斯瑞責(zé)任有限公司合成（純度＞98%）；冰醋酸（北京北化精細(xì)化學(xué)品有限責(zé)任公司，分析純）；生理鹽水（0.9%氯化鈉注射液，石家莊四藥有限公司）。

1.2 多肽合成

采用丙氨酸掃描策略將CRP中所有非丙氨酸殘基位點進(jìn)行突變，編號、相對分子質(zhì)量及對應(yīng)關(guān)系見表1。

表1 CRP突變體的氨基酸序列

1.3 CRP的時間-鎮(zhèn)痛效應(yīng)關(guān)系研究

健康ICR小鼠，雌雄各半，隨機(jī)分為生理鹽水對照組（0.9%氯化鈉溶液）和CRP給藥組（100 μg/kg），均灌胃給藥。小鼠于實驗前禁食12 h，給藥后 1、2、3、4、5、6 h腹腔注射 2%醋酸（現(xiàn)配）。觀察并記錄注射醋酸后15 min內(nèi)小鼠扭體次數(shù)，扭體反應(yīng)抑制率（%）=［（生理鹽水對照組平均扭體次數(shù)-給藥組平均扭體次數(shù)）/生理鹽水對照組平均扭體次數(shù)］×100%。數(shù)據(jù)以x±s表示，采用GraphPad Prism 6.0進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，采用獨立樣本t檢驗確定各指標(biāo)組間差異是否具有統(tǒng)計學(xué)意義，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

1.4 CRP的劑量-鎮(zhèn)痛效應(yīng)關(guān)系研究

根據(jù)CRP的時間-鎮(zhèn)痛效應(yīng)關(guān)系研究結(jié)果，選擇給藥后2 h，腹腔注射2%醋酸，設(shè)計以25、50、100、200、400、800、1600 μg/kg的劑量研究CRP的劑量-鎮(zhèn)痛效應(yīng)關(guān)系，方法參照1.3。

1.5 丙氨酸掃描的突變體活性評價

根據(jù)CRP的時間-鎮(zhèn)痛效應(yīng)關(guān)系和劑量-鎮(zhèn)痛效應(yīng)關(guān)系研究結(jié)果，CRP突變體的給藥劑量選擇100 μg/kg，給藥后2 h腹腔注射2%醋酸，對CRP突變體進(jìn)行鎮(zhèn)痛活性評價，方法參照1.3。

2 結(jié)果

2.1 CRP的時間-鎮(zhèn)痛效應(yīng)關(guān)系研究

100 μg/kg CRP抑制醋酸引起小鼠的扭體反應(yīng)隨時間的變化關(guān)系見圖1。隨著給藥時間的變化，CRP抑制醋酸引起小鼠的扭體反應(yīng)也相應(yīng)發(fā)生改變，其中，給藥后2～3 h，CRP對醋酸引起小鼠扭體反應(yīng)的抑制作用達(dá)到最強(qiáng)，與生理鹽水對照組相比，抑制率為44%（P＜0.01）。因此，對于突變體的活性評價選擇給藥后2 h進(jìn)行。

圖1 CRP的時間-鎮(zhèn)痛效應(yīng)關(guān)系

2.2 CRP的劑量-鎮(zhèn)痛效應(yīng)研究

在醋酸扭體模型中對CRP的劑量-鎮(zhèn)痛效應(yīng)進(jìn)行研究，結(jié)果見圖2。給藥后2 h，CRP對由醋酸引起小鼠扭體反應(yīng)的抑制作用呈一定的劑量效應(yīng)關(guān)系，在25～1600 μg/kg劑量范圍，隨著給藥劑量的增加，抑制作用也逐漸增強(qiáng)。

圖2 CRP的劑量-鎮(zhèn)痛效應(yīng)關(guān)系

2.3 CRP-丙氨酸掃描突變體的活性評價

CRP-丙氨酸掃描突變體鎮(zhèn)痛活性評價結(jié)果見圖3。丙氨酸掃描并合成14個CRP突變體。在醋酸扭體實驗?zāi)Ｐ椭?，與生理鹽水對照組相比，突變體CRP-F2A、CRP-S3A、CRP-P4A、CRPE5A、CRP-N6A、CRP-C7A、CRP-Q8A、CRP-G9A、CRP-E10A、CRP-S11A、CRP-Q12A、CRP-P13A和CRP-C7S均有鎮(zhèn)痛作用，具有顯著性差異（P＜0.05）。與CRP相比，突變體CRP-Q12A的鎮(zhèn)痛作用無顯著變化，突變體CRP-Q8A鎮(zhèn)痛活性下降約17%（P＜0.05）。與CRP相比，突變體CRP-C14A鎮(zhèn)痛活性下降約30%（P＜0.01），突變體CRP-E5A鎮(zhèn)痛活性明顯增強(qiáng)約20%（P＜0.05）。其他位點的突變未能產(chǎn)生顯著的鎮(zhèn)痛活性變化。由此可見，CRP的第5位谷氨酸、第8位谷氨酰胺、第14位半胱氨酸是CRP的關(guān)鍵氨基酸位點。

圖3 丙氨酸掃描策略的CRP突變體的鎮(zhèn)痛活性評價

3 討論

本研究通過醋酸扭體實驗?zāi)Ｐ蛯RP及丙氨酸掃描的突變體進(jìn)行活性評價。結(jié)果顯示，與生理鹽水對照組相比，除CRP-C14A外，均有鎮(zhèn)痛作用。其中，與CRP相比，突變體CRP-E5A鎮(zhèn)痛活性增加約20%，推測該位點極性（或電荷）的改變對于鎮(zhèn)痛活性是有增強(qiáng)作用的。與CRP相比，突變體CRP-Q8A鎮(zhèn)痛活性下降約17%，但突變體CRP-Q12A的鎮(zhèn)痛活性變化不大。Konno[6]和Oliveira[13]等先后對這2個位點分別進(jìn)行突變，生成突變體Q8K和Q12K、Q12R，結(jié)果表明CRP的12位谷氨酰胺突變不會對CRP的鎮(zhèn)痛活性產(chǎn)生影響，CRP的第8位谷氨酰胺突變對CRP的活性影響較大。本研究結(jié)果與Konno等一致，第8位谷氨酰胺是CRP發(fā)揮鎮(zhèn)痛活性的的關(guān)鍵氨基酸位點，而第12位谷氨酰胺不是CRP發(fā)揮鎮(zhèn)痛活性的關(guān)鍵氨基酸位點。

另外，本研究發(fā)現(xiàn)第7位半胱氨酸的突變對CRP的鎮(zhèn)痛活性影響不明顯，說明第7位半胱氨酸并非CRP的關(guān)鍵氨基酸位點，而第14位（C端）半胱氨酸突變（C14A）導(dǎo)致CRP的鎮(zhèn)痛活性下降約30%，推測C端半胱氨酸是CRP與靶點結(jié)合的關(guān)鍵氨基酸位點。

南美洲響尾蛇毒素CRP是一類由14個氨基酸殘基構(gòu)成的小肽，經(jīng)口服就可以發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用，是難得的鎮(zhèn)痛藥物先導(dǎo)物，具有潛在應(yīng)用前景。本研究初步探討了CRP的一級結(jié)構(gòu)與其鎮(zhèn)痛活性的關(guān)系，確定其重要的氨基酸位點，為該肽進(jìn)行構(gòu)性優(yōu)化提供了理論依據(jù)。