FSCN1、eIF-4A、hMOF在卵巢癌中的表達(dá)及意義

丁轉(zhuǎn)南，黃麗珊，黃素然，羅沛芬，曾帶娣，李仲均

卵巢癌是女性最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，其發(fā)病隱匿，惡性程度高，發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移較早，相當(dāng)一部分患者就診時(shí)已經(jīng)存在局部浸潤(rùn)或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，屬于中晚期[1]。因此，尋找有效的生物學(xué)診斷指標(biāo)對(duì)卵巢癌作出早期診斷和預(yù)后評(píng)估非常重要。越來(lái)越多的研究證實(shí)，非編碼RNA調(diào)控、組蛋白修飾、染色體重構(gòu)等表觀遺傳學(xué)改變介導(dǎo)的基因沉默事件在腫瘤惡性進(jìn)展的早期，通過(guò)激活或干擾關(guān)鍵的信號(hào)通路，從而促進(jìn)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。Fascin-1(FSCN1)是一種細(xì)胞骨架蛋白，與細(xì)胞膜絲狀偽足、片狀偽足、微棘的形成有密切關(guān)系，參與腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移[3]。hMOF是組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶MYST家族成員之一[4]。目前針對(duì)FSCN1、真核起始因子4A(eIF-4A)、hMOF在卵巢癌中表達(dá)情況及其作用的研究鮮有報(bào)道。本研究通過(guò)顯色原位雜交和免疫組化染色方法檢測(cè)卵巢癌中FSCN1、eIF-4A、hMOF的表達(dá)情況，并分析其與臨床病理參數(shù)的相關(guān)性，為卵巢癌的早期診斷和預(yù)后評(píng)估提供試驗(yàn)依據(jù)，報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2006年1月—2012年1月南方醫(yī)科大學(xué)附屬東莞人民醫(yī)院婦產(chǎn)科手術(shù)切除的卵巢癌組85例、卵巢交界性腫瘤組25例、卵巢良性腫瘤組25例、正常卵巢組織(因其他良性疾病進(jìn)行手術(shù)切除者)25例(對(duì)照組)患者作為研究對(duì)象。入選標(biāo)準(zhǔn)：(1)病理診斷明確；(2)術(shù)前未行放、化療或免疫治療；(3)隨訪資料完整。卵巢癌組年齡31～75(53.25±7.61)歲，臨床分期Ⅰ～Ⅱ期53例，Ⅲ～Ⅳ期32例；卵巢交界性腫瘤組年齡28～71(52.53±6.72)歲，均為臨床分期Ⅰ～Ⅱ期；卵巢良性腫瘤組年齡32～69(55.13±9.22)歲；對(duì)照組年齡30～75(54.51±7.75)歲。4組患者年齡比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。

1.2 觀測(cè)指標(biāo)與方法

1.2.1 FSCN1、eIF-4A、hMOF檢測(cè)：4組受試者在外科手術(shù)過(guò)程中切除獲得卵巢組織樣本，采用免疫組化鏈霉菌抗生物素蛋白—過(guò)氧化物酶(SP)兩步法檢測(cè)。樣本先經(jīng)磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗，再用福爾馬林固定，常規(guī)石蠟包埋，酒精脫水，切片厚度4 μm，再脫蠟水化，用枸櫞酸液高溫高壓修復(fù)抗原。每張切片滴加過(guò)氧化酶后于37℃孵育10 min，后滴加山羊血清封閉；然后滴加一抗，4℃孵育過(guò)夜，PBS沖洗后滴加二抗，37℃ 孵育30 min，PBS沖洗后加入生物素—過(guò)氧化物酶溶液37℃孵育20 min，用鮮二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色，蘇木精復(fù)染，最后用中性樹(shù)膠封片，熒光顯微鏡(日本Nikon公司，型號(hào)E800)下觀察。用PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。鼠抗人FSCN1單克隆抗體、羊抗人eIF-4A多克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司，兔抗人hMOF單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)OriGen公司。SP免疫組織化學(xué)試劑盒及雙花扁豆凝集素(DBA)顯色試劑盒均購(gòu)自上?；蛟噭┕?。鼠抗人FSCN1抗體稀釋度為1∶100，羊抗人eIF-4A抗體稀釋度為1∶50，兔抗人hMOF抗體稀釋度為1∶250。

1.2.2 結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)：采用半定量評(píng)分方法，以陽(yáng)性細(xì)胞比例(<5%=0，6%～25%=1，26%～50%=2，51%～75%=3，>75%=4)和染色強(qiáng)弱(無(wú)=0，弱=1，中=2，強(qiáng)=3)的乘積進(jìn)行評(píng)分。按照乘積評(píng)分的分值分為陰性(0分)，低表達(dá)(1～4分)，中表達(dá)(5～8分)和高表達(dá)(9～12分)。

1.3 隨訪 所有患者均進(jìn)行5年隨訪，統(tǒng)計(jì)5年總體生存率、5年無(wú)瘤生存率及中位無(wú)瘤生存期(DFS)，以及FSCN1陽(yáng)性、eIF-4A陽(yáng)性、hMOF陽(yáng)性、FSCN1陰性、eIF-4A陰性、hMOF陰性表達(dá)者的中位無(wú)瘤生存期。

2 結(jié) 果

2.1 各組FSCN1、eIF-4A、hMOF表達(dá)比較 與對(duì)照組、卵巢良性腫瘤組、卵巢交界性腫瘤組比較，卵巢癌組FSCN1和eIF-4A 陽(yáng)性表達(dá)率升高，而hMOF陽(yáng)性表達(dá)率則降低(P均<0.05)，見(jiàn)表1、圖1。

表1 4組受試者FSCN1、eIF-4A、hMOF陽(yáng)性表達(dá)率比較 [例(%)]

注：與對(duì)照組比較，aP<0.05；與卵巢良性腫瘤組比較，bP<0.05；與卵巢交界性腫瘤組比較，cP<0.05

2.2 卵巢癌組患者FSCN1、eIF-4A、hMOF表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系 在卵巢癌組患者中，F(xiàn)SCN1和eIF-4A的表達(dá)與組織學(xué)分級(jí)、FIGO分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(P<0.05)；而hMOF的表達(dá)與FIGO分期有關(guān)(P<0.05)；余指標(biāo)均不相關(guān)(P> 0.05)，見(jiàn)表2。

2.3 卵巢癌患者FSCN1與eIF-4A、hMOF表達(dá)的相關(guān)性分析 Pearson相關(guān)性分析顯示，卵巢癌組織中FSCN1表達(dá)與eIF-4A與呈正相關(guān)(r=0.251，P=0.021)，與hMOF呈負(fù)相關(guān)(r=-0.277，P= 0.010)。

表2卵巢癌組患者FSCN1、eIF-4A、hMOF陽(yáng)性表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系 [例(%)]

項(xiàng) 目例數(shù)FSCN1χ2/P值eIF-4Aχ2/P值hMOFχ2/P值年齡(歲)<605042(84.0)4.126/0.05038(76.0)0.362/0.1918(16.0)0.186/0.889≥603523(65.7)22(62.9)6(17.1)腫瘤直徑(cm)<52722(81.5)0.115/0.97619(70.4)0.114/0.9734(14.8)0.275/0.779≥55843(74.1)41(70.7)10(17.2)組織學(xué)分級(jí)G1103(30.0)4.371/0.033 2(20.0)4.399/0.0312(20.0)0.126/0.309G23423(67.6)20(58.8)6(17.6)G34139(95.1)38(92.7)6(14.6)FIGO分期Ⅰ～Ⅱ5336(67.9)5.673/0.017 32(60.4)6.582/0.00812(22.6)4.302/0.038 Ⅲ～Ⅳ3229(90.6)28(87.5) 2(6.3)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無(wú)6546(70.8)6.377/0.025 42(64.6)6.352/0.02111(16.9)0.136/0.839有2019(95.0)18(90.0) 3(15.0)

2.4 卵巢癌患者FSCN1、eIF-4A、hMOF表達(dá)與預(yù)后的相關(guān)性 所有患者均進(jìn)行隨訪，5年總體生存率48.2%，5年無(wú)瘤生存率為45.9%，中位生存期為52.3個(gè)月(95%CI44.3～60.4)；FSCN1陽(yáng)性、eIF-4A陽(yáng)性、hMOF陰性表達(dá)者中位無(wú)瘤生存時(shí)間均顯著低于FSCN1陰性、eIF-4A陰性、hMOF陽(yáng)性表達(dá)者(P<0.01)，見(jiàn)表3。

表3 卵巢癌組織中FSCN1、eIF-4A、hMOF表達(dá)的中位無(wú)瘤生存期比較

2.5 卵巢癌患者FSCN1、eIF-4A、hMOF表達(dá)與預(yù)后的Logistic回歸分析 經(jīng)過(guò)Logistic多因素回歸分析，F(xiàn)SCN1陽(yáng)性、eIF-4A陽(yáng)性、hMOF陰性、組織學(xué)分級(jí)高、FIGO分期晚、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是卵巢癌患者中位無(wú)瘤生存期的危險(xiǎn)因素，見(jiàn)表4。

3 討 論

卵巢癌是危害女性健康最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一。根據(jù)世界衛(wèi)生組織GLOBOCAN 2012項(xiàng)目的統(tǒng)計(jì)，在全球范圍內(nèi)卵巢癌每年新發(fā)病例約為22萬(wàn)，其中超過(guò)14萬(wàn)病例因此而死亡[5]。卵巢癌發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，涉及遺傳、免疫和環(huán)境等眾多因素的相互作用。既往對(duì)卵巢癌的遺傳學(xué)研究主要集中在遺傳易感性方面，近年來(lái)隨著分子生物學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展，非編碼RNA調(diào)控、DNA甲基化、組蛋白修飾等表觀遺傳學(xué)異常改變?cè)诼殉舶┲械淖饔檬艿皆絹?lái)越多的關(guān)注[6]。

FSCN1作為一種細(xì)胞骨架蛋白，可與F-肌動(dòng)蛋白交聯(lián)，調(diào)節(jié)細(xì)胞膜表面絲狀偽足、片狀偽足和微棘的形成，而這些都與細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)、腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[7-8]。有研究表明，F(xiàn)SCN1在乳腺癌、胃癌、非小細(xì)胞肺癌、宮頸癌等多種腫瘤細(xì)胞中表達(dá)明顯提高[9-10]。黃必飛等[11]研究表明，在宮頸癌中EGFR 和FSCN1均呈高表達(dá)，EGFR可能參與正性調(diào)控FSCN1表達(dá)。eIF-4A在肝癌、乳腺癌、淋巴瘤等多種腫瘤中均有過(guò)度表達(dá)[12]。已有文獻(xiàn)報(bào)道[13]，在卵巢上皮癌組織中，eIF-4A陽(yáng)性表達(dá)率顯著提高，且與FIGO手術(shù)病理分期、組織學(xué)分級(jí)及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均有顯著相關(guān)性，eIF-4A可能參與卵巢上皮癌的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程。eIF-4A在DEAD-box家族蛋白ATP依賴的RNA解旋酶中含量最多，調(diào)控蛋白合成的起始過(guò)程。作為一種翻譯起始復(fù)合因子，eIF4F表達(dá)失控導(dǎo)致蛋白異常合成可導(dǎo)致人類(lèi)惡性腫瘤的發(fā)生。乙?；竓MOF可通過(guò)對(duì)組蛋白3、組蛋白4賴氨酸氨基端作用，參與核苷酸的復(fù)制、修復(fù)、轉(zhuǎn)錄及染色體重構(gòu)，由此而參與腫瘤的發(fā)生過(guò)程[14]。hMOF是參與組蛋白乙?；^(guò)程的重要成員，當(dāng)hMOF表達(dá)異常時(shí)引起蛋白乙?；Ш?，進(jìn)而引發(fā)腫瘤。Cai等[15]研究表明，相比于正常卵巢組織，hMOF mRNA和蛋白的表達(dá)在卵巢上皮癌組織中明顯降低，且hMOF蛋白表達(dá)與卵巢癌分期有密切關(guān)系。

本研究結(jié)果表明，相比于對(duì)照組、卵巢良性腫瘤組及卵巢交界性腫瘤組，卵巢癌組FSCN1和eIF-4A陽(yáng)性表達(dá)率顯著增高，hMOF陽(yáng)性表達(dá)率顯著降低(P<0.05)。此外，卵巢癌中FSCN1和eIF-4A的表達(dá)與組織學(xué)分級(jí)高、FIGO分期晚、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(P<0.05)；hMOF的表達(dá)與FIGO分期有關(guān)(P<0.05)。Pearson相關(guān)性分析顯示，卵巢癌中FSCN1表達(dá)與eIF-4A呈正相關(guān)，與hMOF呈負(fù)相關(guān)。提示在卵巢癌患者中FSCN1與eIF-4A、hMOF有一定相關(guān)性。另外，F(xiàn)SCN1陽(yáng)性、eIF-4A陽(yáng)性、hMOF陰性表達(dá)者中位無(wú)瘤生存時(shí)間均顯著低于FSCN1陰性、eIF-4A陰性、hMOF陽(yáng)性表達(dá)者(P<0.05)。經(jīng)過(guò)Logistic多因素回歸分析，F(xiàn)SCN1陽(yáng)性、eIF-4A陽(yáng)性、hMOF陰性、組織學(xué)分級(jí)高、FIGO分期晚、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是卵巢癌患者DFS的危險(xiǎn)因素。提示三者在卵巢癌患者中存在一定相關(guān)性，可能共同參與卵巢癌的發(fā)生、發(fā)展、浸潤(rùn)及轉(zhuǎn)移過(guò)程。進(jìn)一步分析其原因，由于eIF-4A翻譯起始復(fù)合因子，當(dāng)其表達(dá)異常時(shí)，可導(dǎo)致蛋白合成失控，引起卵巢上皮細(xì)胞增殖失控和惡性轉(zhuǎn)化，進(jìn)而引發(fā)卵巢癌。hMOF可作為催化亞基，特異性乙?；M蛋白H4K16，使染色質(zhì)的基因暴露，有利于轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合，啟動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄過(guò)程。而在卵巢癌中hMOF表達(dá)下降，導(dǎo)致乙酰化H4K16水平降低，進(jìn)而引起基因組不穩(wěn)定、核異常、染色體畸變?cè)黾?、DNA修復(fù)功能降低或某些抑癌基因表達(dá)異常等，導(dǎo)致癌癥的發(fā)生。FSCN1可能參與EGFR相關(guān)的腫瘤發(fā)生及轉(zhuǎn)移過(guò)程。FSCN1、eIF-4A可能參與卵巢組織的惡性轉(zhuǎn)化過(guò)程，且與其惡性程度和生物學(xué)行為相關(guān)，因此，F(xiàn)SCN1、eIF-4A、hMOF可能成為卵巢癌早期篩選的生物標(biāo)志物，有望用于早期診斷和指導(dǎo)預(yù)后。

表4 FSCN1、eIF-4A、hMOF表達(dá)與預(yù)后的Logistic回歸分析

綜上所述，F(xiàn)SCN1、eIF-4A、hMOF在卵巢癌中存在異常表達(dá)，可能與腫瘤的惡性演進(jìn)密切相關(guān)，其具體的作用機(jī)制有待深入研究。

利益沖突：所有作者聲明無(wú)利益沖突

作者貢獻(xiàn)聲明

丁轉(zhuǎn)南、黃麗珊：設(shè)計(jì)研究方案，實(shí)施研究過(guò)程，論文撰寫(xiě)；黃素然、羅沛芬：提出研究思路，分析試驗(yàn)數(shù)據(jù)，論文審核;曾帶娣：資料搜集整理，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析;李仲均：課題設(shè)計(jì)，論文修改