不同黑脛病發(fā)病程度煙株生理特性的比較分析

史普酉，賈 孟，楊成翠，楊 祥，譚小兵，詹 淳，張金峰，王 戈*

(1.云南農(nóng)業(yè)大學 煙草學院，云南 昆明 650201；2.云南省保山市煙草公司 昌寧分公司，云南 保山 678100；3.云南省曲靖市煙草公司 羅平分公司，云南 曲靖 655800)

煙草黑脛病(Phytophoraparasiticavar.nicotiana)是煙草上普遍發(fā)生的土傳性真菌病害，可通過菌絲、孢子囊和游動孢子侵染煙株，導致煙葉自上而下變黃、凋萎、枯死等[1-2]。我國每年因煙草黑脛病造成的經(jīng)濟損失巨大，嚴重影響了烤煙生產(chǎn)質量。因此，在煙草植株田間不同發(fā)病條件下，探討不同發(fā)病程度植株光合特性及抗氧化酶活性的差異，有助于進一步豐富黑脛病抗性機理，為科學防治黑脛病提供理論依據(jù)。研究表明，病原菌侵染植株后會涉及病原菌和植株之間的復雜作用關系。病原菌入侵后，植物體內會形成一系列復雜防御機制抵御病原物的入侵和擴展，超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)、多酚氧化酶(PPO)等植物體內重要的保護酶會積極參與活性氧清除及酚類、木質素和植保素等抗病相關物質的合成，對抵御活性氧及氧自由基對細胞系統(tǒng)的傷害和增強植物抗病能力具有重要作用[3]。同時，病原菌的入侵，在煙株與病原物發(fā)生非親和作用時，寄主體內保護酶活性較低，導致O2-、H2O2大量積累，并逐漸導致細胞膜結構完整性喪失，引發(fā)體內一系列生理生化代謝失衡、光合能力降低等現(xiàn)象[4]。煙株感病后，生物因子和非生物因子等多種誘導因子可以誘導植物體內防御酶活性升高以及葉綠素含量等生理指標的改變，繼而引起植株體內代謝物質的改變，形成的代謝物本身具有抗病作用或者進一步轉化形成與抗病性有關的次級代謝物[5-6]。光照是植物進行光合作用的基礎，植物光合生產(chǎn)能力與光合色素、凈光合速率、氣孔導度、胞間CO2濃度等因素密切相關[7]。魏明月等[8]研究表明，光環(huán)境對煙草不同生育期光合作用、干物質積累有顯著影響，強光條件下未出現(xiàn)光抑制的現(xiàn)象更有利于煙草的生長發(fā)育。當植物遭受病害脅迫時，植物體內的一系列生理機制將形成一些適應方法，同時也形成多種防御機制，構成嚴密的防御系統(tǒng)。小麥感染白粉病菌后，相對葉綠素含量、光合速率及可溶性蛋白含量均不同程度地降低[9]。杜國棟等[10]在對蘋果褐斑病的研究中發(fā)現(xiàn)，蘋果褐斑病病菌侵染引起的光系統(tǒng)PSII反應中心、PSII受體側和供體側的傷害，導致葉肉細胞CO2同化能力下降，進而造成葉片凈光合速率不斷下降。同時，也有研究指出，番茄幼苗在受到脅迫的情況下葉片會變大、變薄以便于吸收更多光能用于光合作用[11]；棉花苗期受到脅迫后則通過抑制生長以降低能力消耗的方式抵御脅迫[12]。

煙草是以收獲葉片為主的經(jīng)濟作物，病原菌的侵入導致葉片產(chǎn)量、品質的下降，目前有關煙葉黑脛病害的研究大多圍繞品種抗性鑒定、病原菌分化和拮抗菌選育上，而有關病原菌侵入后導致光合特性改變的研究較少涉及[4,13]。從以往研究方法上來看，更多采用室內或田間等人為干擾形式探討病原菌侵染的影響[14]，這與病原菌田間實際侵染和植株響應存在一定的差距。在田間病原菌自然侵染并導致植株發(fā)生響應條件下，探討植株自然發(fā)病情況下植株的抗性響應相關研究較少涉及。本研究選擇云南煙區(qū)煙草黑脛病發(fā)病典型地區(qū)，在控制其他栽培條件基礎上，選擇同一地塊中不同自然發(fā)病程度煙株，比較不同發(fā)病程度煙株葉片抗氧化酶活性和光合特性的響應差異，探討不同發(fā)病程度與植株相關生理指標變化之間的相關性，以期進一步豐富煙株黑脛病感病機理，為今后科學防治黑脛病提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗概況

1.1.1 取樣煙田背景情況 選定煙草黑脛病危害較為嚴重的3個區(qū)域進行定點監(jiān)測(煙田種植情況如表1所示)，即云南省石林縣板橋鎮(zhèn)(北緯24°41′28″、東經(jīng)103°15′28″，海拔1670 m)、云南省昌寧縣珠街鎮(zhèn)(北緯25°8′7″、東經(jīng)99°53′42″，海拔1950 m)和云南省昌寧縣耇街鎮(zhèn)(北緯25°0′35″、東經(jīng)99°50′14″，海拔1690 m)。各區(qū)域定點一塊煙田進行跟蹤監(jiān)測，供試土壤均為紅壤，品種為紅花大金元，供試田塊施肥措施及田間管理一致。

表1 不同煙區(qū)黑脛病發(fā)病情況

1.1.2 取樣處理設置 參照煙草病蟲害分級及調查方法[15]對煙株進行黑脛病等級劃分并基于病情指數(shù)調查結果將煙株劃分為不同發(fā)病程度煙株(圖1)，即正常煙株：全株無?。惠p度發(fā)病煙株：莖部病斑不超過莖圍的1/2，或半數(shù)以下葉片出現(xiàn)輕度凋萎及下部少數(shù)葉片出現(xiàn)病斑；中度發(fā)病煙株：莖部病斑超過莖圍的1/2，或半數(shù)以上葉片出現(xiàn)輕度凋萎及少數(shù)葉片出現(xiàn)病斑；重度發(fā)病煙株：莖部病斑環(huán)繞莖圍，或2/3以上葉片出現(xiàn)凋萎。

1.2 抗氧化酶活性測定

在各定點煙田，參照上述不同發(fā)病程度劃分標準進行田間取樣和相關指標測定，具體方法為同一煙田同一發(fā)病程度選擇3株。將葉片去除葉脈后放入液氮罐保存，待測葉片酶活性，酶活性測定方法參照高俊鳳[16]的方法。

1.3 煙葉光合特性測定

于云南省昌寧縣耇街鎮(zhèn)監(jiān)測點，選擇同一發(fā)病程度最有代表性的3株烤煙，在其中部定點選取一片葉片，用軟毛刷刷去中部葉表面的灰塵，然后用LI-6400型便攜式光合儀(Li-COR lnc，美國)并應用Li-6400-02B藍紅光源探頭進行光合響應曲線的測定，取3株烤煙葉片平均值進行數(shù)據(jù)分析。

圖1 各發(fā)病程度煙株取樣情況

1.4 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)利用Microsoft Office 2016 初步處理和作圖，利用SPSS 22.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析；同時基于課題組前期光響應曲線擬合結果[17]，采用雙曲線修正模型[18]對烤煙光響應曲線進行擬合，得出相關光合特征參數(shù)，該模型的表達式為：

式中：β、γ為系數(shù)。參數(shù)初始值及限制設定范圍為：α=0.01，β=0.0001，γ=0.001，Rd=0.3 μmol/(m2·s)；α≤1，β≤1，γ≤1，Rd≤1.5 μmol/(m2·s)。

2 結果與分析

2.1 不同發(fā)病程度煙株煙葉抗氧化酶活性差異分析

不同發(fā)病程度煙株煙葉抗氧化酶活性存在較大差異，且不同取樣點趨勢基本一致(圖2)，即隨著煙株黑脛病病情加重，POD和SOD活性呈先增加后降低的趨勢，其中POD活性在中度發(fā)病時達到峰值，且中度發(fā)病煙株顯著高于正常煙株；SOD活性在輕度發(fā)病時達到峰值，并顯著高于正常煙株；PPO活性和MDA含量呈持續(xù)上升趨勢，重度發(fā)病煙株均顯著高于正常煙株。以上結果表明黑脛病菌侵染煙株會引發(fā)煙葉體內抗氧化系統(tǒng)發(fā)生較大變化，且不同發(fā)病程度煙葉間存在差異。

2.2 不同黑脛病發(fā)病程度煙株光合特性變化差異分析

2.2.1 不同黑脛病發(fā)病程度煙株凈光合速率的變化特征 從光合擬合曲線來看(圖3)，在弱光條件下，各處理的測量值和擬合值基本保持一致，在弱光階段PAR<500 μmol/(m2·s)時，各處理凈光合速率的表現(xiàn)為正常煙株>中度發(fā)病煙株>重度發(fā)病煙株>輕度發(fā)病煙株；當PAR>500 μmol/(m2·s)時，各處理的烤煙均達到光飽和點，且正常煙株的凈光合速率最大，重度發(fā)病煙株最小。

2.2.2 不同黑脛病發(fā)病程度烤煙氣孔導度的變化特征 不同發(fā)病程度煙株煙葉氣孔導度與凈光合速率的變化趨勢基本一致，即正常煙株>輕度發(fā)病煙株>中度發(fā)病煙株>重度發(fā)病煙株(圖4)。以上結果表明，隨著煙株黑脛病發(fā)病情況的加重，煙株氣孔導度減小。

2.2.3 不同黑脛病發(fā)病程度烤煙胞間CO2濃度和氣孔限制值的變化特征 隨著黑脛病發(fā)病情況加重，煙葉胞間CO2濃度下降，氣孔限制值升高，具體表現(xiàn)為正常煙株>輕度發(fā)病煙株>中度發(fā)病煙株>重度發(fā)病煙株(圖5)。當PAR小于500 μmol/(m2·s)時，各處理氣孔限制值升高，大小表現(xiàn)為重度發(fā)病煙株>中度發(fā)病煙株>輕度發(fā)病煙株>正常煙株，表明氣孔因素會影響烤煙的凈光合速率；當PAR大于750 μmol/(m2·s)時，各處理胞間CO2濃度開始升高，氣孔限制值開始降低，表明非氣孔因素會影響烤煙的凈光合速率，大小與PAR小于500 μmol/(m2·s)時一致。

圖2 不同發(fā)病程度煙株葉片酶活性差異

圖3 不同黑脛病發(fā)病程度煙株凈光合速率的變化特征

2.2.4 不同黑脛病發(fā)病程度烤煙表觀光能利用率的變化特征 隨著黑脛病發(fā)病情況加重，煙葉表觀光能利用率下降，具體表現(xiàn)為當PAR小于500 μmol/(m2·s)時，大小為正常煙株>中度發(fā)病煙株>重度發(fā)病煙株>輕度發(fā)病煙株；當PAR大于1000 μmol/(m2·s)時，大小為正常煙株>輕度發(fā)病煙株>中度發(fā)病煙株>重度發(fā)病煙株(圖6)。以上結果表明，隨著黑脛病發(fā)病程度的加重，煙株表觀光能利用率降低，從而導致煙株光合能力下降。

2.2.5 不同黑脛病發(fā)病程度烤煙表觀CO2利用效率的變化特征 隨著黑脛病發(fā)病情況的加重，烤煙表觀CO2利用效率下降，即在弱光階段PAR<500 μmol/(m2·s)時，各處理表觀CO2利用效率的趨勢為正常煙株>中度發(fā)病煙株>重度發(fā)病煙株>輕度發(fā)病煙株；當PAR>500 μmol/(m2·s)時，各處理的表觀CO2利用效率大小為正常煙株>輕度發(fā)病煙株>中度發(fā)病煙株>重度發(fā)病煙株(圖9)。以上結果表明，黑脛病的發(fā)生會導致烤煙表觀CO2利用效率降低，病情越嚴重，表觀CO2利用效率越低。

圖4 不同黑脛病發(fā)病程度烤煙氣孔導度的變化特征

圖5 不同黑脛病發(fā)病程度烤煙胞間CO2濃度和氣孔限制值變化特征

圖6 不同黑脛病發(fā)病程度烤煙表觀光能利用率的變化特征

3 討論

本研究在3個典型黑脛病危害煙區(qū)，參照黑脛病病害調查方法對田間自然發(fā)病煙株進行發(fā)病程度劃分，在田間自然發(fā)病條件下探討不同發(fā)病程度煙株抗氧化酶活性和光合特性的差異，旨在最大程度減少人為干擾，避免實驗室人工接種等方法對結果的影響，更真實呈現(xiàn)田間發(fā)病煙株狀況及不同程度發(fā)病煙株體內抗氧化酶活性和光合特性的差異，以期為豐富煙株抗病機理和今后防治黑脛病提供必要的理論支撐。

圖7 不同黑脛病發(fā)病程度烤煙表觀CO2利用效率變化特征

外界脅迫會誘發(fā)植株自身防御系統(tǒng)的積極響應，其中植株保護酶系統(tǒng)在其中扮演著重要角色[19]。當受到病原菌入侵時，煙株體內會產(chǎn)生大量的活性氧，造成膜系統(tǒng)的損傷，同時煙株也可以通過調動保護酶以抵御和清除活性氧，抵制膜脂過氧化，維持膜系統(tǒng)的穩(wěn)定[20-21]。SOD、POD和PPO是植物在逆境條件下酶促防御系統(tǒng)的關鍵酶，可作為表征植物抗逆性的指標[22-23]。MDA是植物在逆境環(huán)境下膜脂過氧化作用的最終產(chǎn)物，其含量是膜脂過氧化程度的重要標志[24-25]，與細胞膜的損害程度直接相關，其含量的多少可以反映出細胞受到脅迫程度的高低以及煙株抗逆能力的強弱[26]。因此，探討不同發(fā)病條件下植株抗氧化酶活性的差異具有重要意義。在對青枯菌與赤星病菌侵染煙草的研究中發(fā)現(xiàn)，受侵染植株葉片POD活性均高于正常植株[6，27]；王戈等[3]的試驗也表明，黑脛病病菌侵染烤煙品種紅花大金元后，POD活性先上升后降低，與本試驗研究結果相同，這可能是因為隨著黑脛病發(fā)病程度的加重，細胞中積累了大量的活性氧，紅花大金元為易感黑脛病品種，對黑脛病入侵表現(xiàn)出的敏感性較低，POD含量雖然隨之增加，但并未將其及時清理，最終導致細胞膜系統(tǒng)受到損害。對根黑腐病侵染辣椒的研究發(fā)現(xiàn)[28]，辣椒多酚氧化酶活性隨著病菌的入侵先上升再下降，與本試驗研究結果一致，這可能是在發(fā)病后期，植株根系多數(shù)死亡造成的。本試驗結果表明，SOD活性先上升再下降，在輕微發(fā)病時達到最高值，這與匡傳富[29]和房保海等[30]的研究結果一致，這可能是由于病菌的入侵造成了活性氧的積累，活性氧有利于激活和調控煙草體內各種防御相關基因的表達[31]，接種后紅花大金元SOD活性快速上升，這種高活性水平的SOD可以清除植物和病原物親和性互作產(chǎn)生的O2-，即紅花大金元受到病原物侵染后不發(fā)生過敏性反應，病原物可以在寄主內擴展，爾后隨著發(fā)病程度的加重，植株正常生理代謝受到影響，SOD活性降低。江彤等[4]通過對黑脛病菌侵染抗病煙草品種K326的研究表明，MDA含量會隨時間的延長而降低。但本試驗結果顯示，丙二醛含量呈現(xiàn)持續(xù)上升趨勢，原因是植株在受到黑脛病菌侵染后，寄主體內SOD、CAT活性較低，導致O2-、H2O2大量積累，進一步啟動膜脂過氧化作用，使得MDA含量上升，而品種K326對黑脛病抗病能力強，隨著時間的推移，入侵的黑脛病菌被植株免疫系統(tǒng)清除，MDA含量隨之下降，而本試驗選用的品種紅花大金元對黑脛病抗性低，植株無法清除入侵的黑脛病菌，MDA含量持續(xù)增高。本研究中，煙株感染黑脛病后，體內抗氧化酶活性發(fā)生明顯變化，說明在病原菌的誘導下，植株體內活性氧產(chǎn)生和消除機制遭到破壞，大量活性氧積累誘發(fā)了抗氧化酶活性激增以此提高抗氧化能力，這也與王戈[3]的研究結果一致。

光照是植物進行光合作用的基礎，影響著植物在光合作用過程中同化力形成所需的能量、光合作用關鍵酶的活化、氣孔的開放以及調節(jié)光合機構的發(fā)育[8]。通過光合儀進行光合響應曲線的測定對研究植物生長規(guī)律及光合效率特征具有重要作用[32]。常用的光響應曲線擬合的模型主要有直角雙曲線、非直角雙曲線、雙曲線修正與指數(shù)模型[33]，但前人研究結果表明，在烤煙[34]、小麥[35]、玉米[36]上雙曲線修正模型擬合效果最好，故本研究基于雙曲線修正模型研究了不同黑脛病發(fā)病程度烤煙光合特性差異。

一般認為，病害脅迫引起植物光合作用下降的影響因素主要包括兩類，由于氣孔的部分關閉導致的氣孔因素和葉肉細胞光合活性的下降導致的非氣孔限制因素。Farquhar認為，在氣孔導度下降，而胞間CO2濃度維持不變甚至上升的情況下，葉肉細胞同化能力降低等非氣孔因素是引起光合速率下降的主要原因[37]。本研究結果表明，隨著黑脛病發(fā)病程度的增加，植株氣孔導度和凈光合速率下降，胞間CO2濃度升高，說明隨著黑脛病發(fā)病程度的增加，凈光合速率的下降是由于非氣孔因素導致的，這與柯思佳的研究結果一致[7]。同時，本試驗研究發(fā)現(xiàn)，隨著黑脛病發(fā)病程度的增加，Rd值相應升高，這可能是由于煙草植株營養(yǎng)物質被病菌消耗，加劇了烤煙消耗自身物質，不利于干物質的積累。胞間CO2濃度與氣孔導度顯示，隨著烤煙黑脛病發(fā)病程度的逐步加重，胞間CO2濃度與氣孔導度均逐漸降低，氣孔限制值增加，這可能是因為黑脛病毒素為多元半乳糖醛酶，該酶能夠分解寄主細胞的中膠層和導管壁，產(chǎn)生果膠產(chǎn)物碎塊，從而阻塞煙株根部水分的上升[38]，從而使烤煙植株水分傳輸能力和水氣交換能力降低，對水分的利用能力降低，有機物合成減少[39]。烤煙的表觀光能利用率和表觀CO2與植株光合作用強度也有緊密的關系。表觀光能利用率與CO2利用率隨著黑脛病發(fā)病程度的加重而降低，這可能由于黑脛病發(fā)病時莖、葉上形成大量病斑，煙株下垂，甚至干枯壞死，導致植株利用光能和CO2能力降低。

綜合來看，前人[40-41]通過接種病菌的方式對煙草葉片酶活性及光合特性的變化進行了深入的研究，但均止步于接種實驗受酶活性及光合特性的影響，人工創(chuàng)傷接種時會損傷莖表皮，不利于烤煙抗病性的表現(xiàn)且并不能真實反映出病菌在自然條件下對烤煙生長發(fā)育的影響。本試驗在大田中對不同發(fā)病程度煙株進行取樣，更接近烤煙自然生長狀態(tài)，更能準確地反映不同發(fā)病狀態(tài)下烤煙生長狀態(tài)的差異。本文只研究了易感黑脛病烤煙品種紅花大金元葉片酶活性及光合特性對不同黑脛病發(fā)病程度的響應差異，但其他烤煙品種對不同黑脛病發(fā)病程度的響應可能不同，這也可能是不同品種抗黑脛病能力較強的原因，因此，品種間對不同黑脛病發(fā)病程度響應的差異有待進一步研究。

4 結論

試驗結果表明，不同發(fā)病程度煙株煙葉抗氧化酶活性存在較大差異，其中POD與SOD活性隨著黑脛病發(fā)病程度的加重表現(xiàn)為先增高后降低的趨勢，PPO活性與MAD含量均隨黑脛病發(fā)病程度的增加呈持續(xù)上升趨勢。黑脛病侵染烤煙植株顯著抑制了光合作用，降低了植株利用光能和CO2的能力。