IL-6/STAT3報告基因系統(tǒng)的構建及抑制IL-6/STAT3信號通路的中藥單體的篩選及驗證

張露露，李晶哲，馬琰巖，尚騰飛，王子依，劉長振

·生物技術與方法·

IL-6/STAT3報告基因系統(tǒng)的構建及抑制IL-6/STAT3信號通路的中藥單體的篩選及驗證

張露露，李晶哲，馬琰巖，尚騰飛，王子依，劉長振

中國中醫(yī)科學院醫(yī)學實驗中心 中醫(yī)藥防治重大疾病北京市重點實驗室，北京 100700

尋找可抑制IL-6/STAT3信號通路的活化從而抑制腫瘤的生長和惡化的中藥單體化合物具有重要意義及發(fā)展前景。文中通過基因重組技術構建出一種含有STAT3增強子序列和 NanoLuc (NLuc) 報告基因序列的新表達載體，并進一步建立受STAT3調控并穩(wěn)定表達NLuc熒光素酶的細胞系，利用該細胞系定量檢測多種中藥單體化合物對IL-6/STAT3信號通路的調控作用，并對抑制IL-6/STAT3信號通路的中藥單體的效果進行驗證。酶切鑒定及測序結果表明報告基因表達載體pQCXIP-STAT3-NLuc構建成功。STAT3轉錄因子的刺激物白細胞介素-6 (IL-6) 作用于所構建的穩(wěn)定表達NLuc的細胞系后出現(xiàn)特異性熒光素酶反應，且作用效果呈良好的劑量依賴性，表明受STAT3調控穩(wěn)定表達NLuc熒光素酶的細胞系構建成功。Western blotting及Real-time PCR實驗結果表明所篩選的中藥單體化合物石斛堿及粉防己堿可抑制IL-6/STAT3信號通路并顯著下調其下游基因Bcl-2及Bcl-x的表達，且作用呈劑量依賴性。綜上所述，文中構建了可高效檢測STAT3轉錄活性的報告基因系統(tǒng)，并利用該系統(tǒng)成功地篩選出可抑制IL-6/STAT3信號通路的中藥單體化合物，具有一定的理論和應用價值。

IL-6/STAT3信號系統(tǒng)，NLuc熒光素酶，石斛堿，粉防己堿

信號轉導和轉錄激活因子3 (STAT3) 是STATs轉錄因子家族的一個重要成員。它將細胞因子和生長因子的多種信號從細胞膜傳遞到細胞核，在免疫、炎癥、細胞自噬以及腫瘤形成等多種生理病理過程中發(fā)揮重要的調控作用[1]。STAT3通過調控下游基因、表觀遺傳機制、影響線粒體功能及腫瘤細胞干性等途徑調節(jié)細胞增殖、細胞周期進程、細胞凋亡、血管生成、免疫逃逸等影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展[2-3]。白細胞介素-6 (IL-6) 是一種嗜神經(jīng)細胞因子，主要參與免疫和炎癥反應的調節(jié)。研究發(fā)現(xiàn)，IL-6廣泛表達于各種惡性腫瘤包括前列腺、乳腺、肺癌和膠質母細胞瘤等腫瘤細胞中，并被認為是調節(jié)腫瘤周圍炎癥微環(huán)境的關鍵細胞因子[4]。有研究表明，IL-6參與了多種生物過程，如增殖、凋亡、存活以及入侵等，促進腫瘤的惡性進展[5]。IL-6可激活STAT3[6]，IL-6的刺激促進STAT3的Tyr-705和Ser-727位點的磷酸化，從而促使STAT3形成同型或異型二聚體轉移到細胞核內(nèi)，并作為轉錄激活劑調節(jié)下游相關基因的表達，其中包含STAT3介導的許多與腫瘤細胞存活相關的基因如Bcl-2、Bcl-xl等的表 達[7-8]，促進腫瘤細胞的存活，同時可誘導腫瘤組織內(nèi)調節(jié)性T細胞中多種細胞因子、生長因子和血管生成因子的表達，進一步激活IL-6/STAT3通路，因此在腫瘤微環(huán)境中腫瘤細胞和免疫細胞之間建立了正反饋回路[9-10]。

現(xiàn)有研究表明，肺癌、乳腺癌、結腸癌、子宮內(nèi)膜癌等許多人類惡性腫瘤中存在STAT3的過度表達和/或組成型激活[11-12]。通過抑制IL-6/STAT3信號通路來抑制腫瘤的生長和惡化已成為有效的抗癌手段[13]。目前已有很多中藥單體通過抑制IL-6/STAT3信號通路發(fā)揮抗癌作用的相關報道：研究表明槲皮素是T98G和U87膠質母細胞瘤細胞中IL-6/STAT3信號通路的有效抑制劑[14]；馬錢子堿可通過調節(jié)IL-6/STAT3通路，使得結腸癌SW480細胞的STAT3磷酸化激活受到抑制，從而發(fā)揮抗腫瘤作用[15]；淫羊藿素主要通過抑制白細胞介素-6/JAK2/STAT3信號傳導來介導抗多發(fā)性骨髓瘤活性[16]；雷公藤內(nèi)酯醇可通過阻斷IL-6-JAK/STAT3途徑阻斷細胞增殖、減少炎癥及防止腫瘤的形成[17]；漢黃芩素可通過阻斷IL-6/STAT3信號抑制腫瘤細胞在炎癥微環(huán)境中的遷移[18]。因此，IL-6/STAT3在腫瘤防治方面有著重要的作用，是抗癌藥物發(fā)現(xiàn)的有力靶標。

報告基因 (Reporter gene) 是一種能夠編碼特定蛋白或酶的基因。該基因序列可以與基因表達調節(jié)序列相融合，或與其他目的基因序列相連接形成新的基因序列，進而通過檢測該報告基因產(chǎn)物的表達水平來定性或定量反映目的基因的表達情況。本實驗室通過前期研究，選定NanoLuc(NLuc) 作為報告基因并構建多種轉錄因子報告基因系統(tǒng)來開展轉錄因子活性檢測的研究工作[19]。NLuc是一種人工改造的熒光素酶，其酶活性強，分子量小 (19.1 kDa)，熱穩(wěn)定性高，發(fā)光持續(xù)時間長，沒有翻譯后修飾或二硫鍵；與螢火蟲熒光素酶 (Fluc) 或海腎螢光素酶 (Rluc) 等傳統(tǒng)熒光素酶相比，其發(fā)光強度強100倍，且不依賴ATP[20]。故以Nluc作為報告基因構建的轉錄因子活化狀態(tài)檢測體系具有靈敏度高、重復性好等特點。在本研究中，我們期望通過對現(xiàn)有逆轉錄病毒載體進行改造，構建一種含有STAT3增強子序列和NLuc報告基因序列的新表達載體，并進一步構建受IL-6/STAT3信號通路調控的穩(wěn)定表達NLuc熒光素酶的細胞系。該細胞系可用于STAT3活化狀態(tài)定量檢測和與IL-6/STAT3信號通路相關藥物的篩選。在此基礎上，我們開展了一系列中藥單體對IL-6/STAT3信號通路抑制作用的篩選和驗證工作，期望發(fā)掘出可抑制IL-6/STAT3信號通路的新中藥單體。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 菌株、細胞株及質粒

感受態(tài)大腸桿菌DH5α購自天根生化科技 (北京) 有限公司；小鼠單核巨噬細胞Raw264.7由本實驗室保存、人胚腎上皮包裝細胞 GP2-293；STAT3增強子序列由北京普爾普樂生物科技合成；Bcl-2引物序列、Bcl-x引物序列及GADPH引物序列 (表1) 由生工生物工程 (上海) 股份有限公司合成。

1.1.2 儀器

371型細胞恒溫培養(yǎng)箱 (Thermo Fisher)，IVIS-Lumina Ⅲ小動物活體成像系統(tǒng) (PerkinElmer)，酶標儀，電轉儀，Western blotting全套儀器 (Bio-Rad)，CFX Connect熒光定量PCR儀 (Bio-Rad)，Allegra X15R水平轉子離心機(Beckman)，QIAcube全自動核酸提取儀 (Qiagen)，ChemiDocTM化學發(fā)光成像系統(tǒng) (Bio-Rad)。

1.1.3 主要試劑

限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶 (Thermo)；白細胞介素-6 (IL-6) (Peprotech)；A1 (長春新堿，Vincristine)、A2 (長春花堿，Vinblastine)、B1 (白楊素，Chrysin)、B3 (桉脂素，Eudesmin)、B4 (白射干素、Dichotomitin)、B5 (白當歸素，Byakangelicin)、B6 (貝母甲素，Peimine)、T4 (石斛堿，Dendrobine)、T6 (粉防己堿，Tetrandrine)、T7 (川續(xù)斷皂苷乙，Dipsacoside B)、T8 (虎杖苷，Polydatin)、Y2 (薏苡素，Coixol)、Q2 (澳洲茄堿，Solasonine)、B7 (白藜蘆醇，Resveratrol)、A09-1 (大蒜素，Allicin)、E1 (兒茶素，Cianidanol)、A9 (木犀草素，Luteolin)、Y8 (楊梅素，Myricetin)、L1 (辣椒素，Nonivamide)、X5 (小檗堿，Berberine) 等中藥單體 (成都瑞芬思生物科技)；質粒小提試劑盒、Trizol RNA抽提試劑、RIPA強效裂解液 (碧云天生物科技)，反轉錄試劑盒 (Qiagen)；腔腸素 (Sigma)；αMEM 培養(yǎng)基、胰蛋白酶 (HyClone)、胎牛血清 (Gibco)，BCA 蛋白定量試劑盒 (Thermo)，瓊脂糖凝膠回收試劑盒 (天根生化科技 (北京) 有限公司)；免疫印跡顯影液 (Millipore)，STAT3單克隆抗體、P-STAT3單克隆抗體、Bcl-2單克隆抗體、Bcl-x單克隆抗體 (Abcam)；抗兔IgG二抗、兔源β-Actin單克隆抗體 (Cell Signaling Technology)。

表1 Real-time PCR引物序列

1.2 方法

1.2.1 逆轉錄病毒載體的構建及驗證

將合成的STAT3增強子序列 (5′-GTCGACAT TTCCCGTAAATCGTCGA-3′，10倍重復) 經(jīng)Ⅰ和Ⅰ雙酶切插入到pQCXIP-NF-κB-NLuc重組質粒中[19]，替代原有的NF-κB增強子序列，形成具有STAT3結合位點的重組逆轉錄病毒載體pQCXIP-STAT3-Nluc (圖1)。載體含有的NanoLuc (Nluc) 序列的N端部分含有分泌信號肽，可幫助蛋白分泌到細胞外的培養(yǎng)基中。去除了增強子序列，僅保留TATA box序列的質粒pQCXIP- TATA-NLuc作為對照載體。所構建質粒經(jīng)測序表明構建成功。

圖1 質粒pQCXIP-STAT3-NLuc的構建示意圖

1.2.2 質粒轉染與病毒制備

用DMEM+10% FBS培養(yǎng)基37 ℃、5% (/) CO2培養(yǎng)GP2-293，利用Lipofectamine 2000轉染試劑將pQCXIP-STAT3-NLuc質粒、對照質粒pQCXIP-TATA-NLuc與pVSV-G病毒包裝質粒共轉入GP2-293細胞。5 h后培養(yǎng)基更換為αMEM+ 10% FBS繼續(xù)培養(yǎng)，48 h后收集含病毒上清。

1.2.3 病毒侵染

Raw264.7接種于6孔板中，αMEM+10% FBS，37 ℃、5% (/) CO2過夜培養(yǎng)。將上述收集的含8 μg/mL 聚凝胺 (Polybrene) 的病毒上清加入細胞，并于水平轉子離心機中32 ℃、1 800×離心1.5 h，37 ℃靜置5 h后更換為新鮮αMEM+ 10% FBS培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2.4 穩(wěn)定表達單克隆細胞系的篩選

病毒侵染48 h后，2 μg/mL嘌呤霉素 (Puromycin) 加入Raw264.7細胞進行篩選。4 d后，將存活細胞按平均1個細胞/孔鋪板。兩周后，選取單克隆細胞株進行放大培養(yǎng)，將所獲得的細胞株記為Raw264.7-STAT3。

1.2.5 單克隆細胞系驗證

Raw264.7-STAT3單克隆細胞按2×104個/孔接種于96孔板中，24 h后加入IL-6 (終濃度設0、5、10、20 ng/mL)，24 h后，取培養(yǎng)基上清，加入底物腔腸素 (Coelenterazine，3 μmol/L)，使用小動物活體成像檢測發(fā)光值，實驗重復3次。

1.2.6 抑制IL-6/STAT3信號通路中藥單體的篩選

Raw264.7-STAT3單克隆細胞接種于96孔板 (2×104個/孔)。，將長春新堿、長春花堿、白楊素、桉脂素、白射干素、白當歸素、貝母甲素、石斛堿、粉防己堿、川續(xù)斷皂苷乙、虎杖苷、澳洲茄堿、白藜蘆醇、大蒜素、兒茶素、木犀草素、楊梅素、辣椒素、小檗堿等中藥單體分別按最大無毒藥物濃度加入細胞，設藥物組、空白組和IL-6陽性對照組，加藥后置于37 ℃、5% (/) CO2培養(yǎng)。12 h后更換未添加藥物的培養(yǎng)基，4 h后取各孔內(nèi)培養(yǎng)基20 μL，與100 μL底物腔腸素 (3 μmol/L)混合，使用小動物活體成像系統(tǒng)測定發(fā)光值。同時，使用CCK8法測定細胞成活率，實驗重復3次。

1.2.7 Western blotting分析

Raw264.7細胞與T4 (石斛堿)、T6 (粉防己堿)共培養(yǎng)，16 h后收集細胞，用RIPA細胞裂解液提取蛋白，用BCA 蛋白定量試劑盒進行蛋白濃度測定，并按常規(guī)操作進行Western blotting分析，實驗重復3次。

1.2.8 Real-time PCR分析

Raw264.7細胞與T4 (石斛堿)、T6 (粉防己堿)共培養(yǎng)，16 h后收集細胞，用Trizol提取試劑盒提取總RNA，以β-actin為對照，Bcl-2、Bcl-x為檢測目的物，用CFX Connect熒光定量PCR儀按常規(guī)操作進行Real-time PCR分析，實驗重復 3次。其中涉及引物見表1。

2 結果與分析

2.1 pQCXIP-STAT3-NLuc報告基因的構建

前期通過去除CMV啟動子、插入NF-κB增強子/TATA box序列以及插入Nluc熒光素酶基因序列對逆轉錄病毒載體pQCXIP進行重組改造，獲得重組質粒pQCXIP-NFKB-Nluc，研究結果表明以此設計的報告基因系統(tǒng)是一個高效、靈敏和便捷的藥物篩選檢測工具[19]。在此基礎上，將STAT3增強子序列通過Ⅰ和Ⅰ雙酶切替換NF-κB增強子序列。新構建的質粒經(jīng)雙酶切獲得的條帶 (圖2，STAT3泳道) 與理論上插入條帶長度 (260 bp) 相符，且明顯不同于原載體上的酶切條帶 (圖2，NF-κB泳道)，結果表明新的重組質粒pQCXIP-STAT3-Nluc構建成功。

2.2 STAT3-NLuc穩(wěn)定表達細胞系的構建及驗證

構建成功的pQCXIP-STAT3-NLuc質粒、pVSV-G病毒包裝質粒共轉染GP2-293細胞，通過逆轉錄病毒上清侵染Raw264.7-STAT3細胞、嘌呤霉素篩選及單克隆分離，成功獲得穩(wěn)定表達STAT3-NLuc的單克隆細胞系。IL-6加入STAT3- NLuc細胞系及NF-κB-NLuc刺激24 h后進行NLuc酶活性檢測。結果表明 (圖3)，在IL-6作用下，STAT3-NLuc細胞上清中的酶活性上升，且作用呈明顯的濃度依賴性。10 ng/mL及20 ng/mL組酶活性可達0 ng/mL組酶活性的18和23倍，差異極具有統(tǒng)計學意義 (***<0.001)。結果表明STAT3- NLuc穩(wěn)定細胞系構建成功。而在IL-6作用下，NF-κB-NLuc酶活性幾乎沒有變化，說明構建該系統(tǒng)的特異性。

圖2 pQCXIP-STAT3-NLuc重組質粒的構建及鑒定

圖3 STAT3-Nluc報告基因系統(tǒng)構建驗證

2.3 STAT3-NLuc信號通路篩選中藥單體化合物

Raw264.7-STAT3細胞經(jīng)IL-6 (10 ng/mL) 及十余種中藥單體刺激12 h后，取培養(yǎng)液上清檢測NLuc發(fā)光值，同時用CCK8法檢測細胞活性。結果表明 (圖4) 藥品代號為Y8 (楊梅素)、L1 (辣椒素)、X5 (小檗堿)、T4 (石斛堿)、T6 (粉防己堿)、T7 (川續(xù)斷皂苷乙)、T8 (虎杖苷)、A9 (木犀草素)等8種中藥單體化合物對STAT3轉錄活性有一定的下調作用，其中L1、X5、T4、T6、T7、T8、A9對STAT3轉錄活性的下調作用具有顯著統(tǒng)計學差異 (*<0.05；**<0.01；***<0.001)。下調作用最強的兩個中藥單體T4 (石斛堿，50 μmol/L) 及T6 (粉防己堿，5 μmol/L) 對IL-6刺激STAT3轉錄活性的降低程度均超過50%，因此被選取用于開展后續(xù)研究。

2.4 篩選獲得的中藥單體化合物對IL-6/STAT3通路抑制效果的驗證

IL-6以及中藥單體化合物T4 (石斛堿) 和T6 (粉防己堿) 作用于Raw264.7細胞16 h后，收集細胞利用Western blotting檢測STAT3及其下游蛋白Bcl-2及Bcl-x的含量變化。結果表明 (圖5及圖6)，IL-6刺激可顯著提高STAT3、P-STAT3、Bcl-2及Bcl-x的含量。與單獨IL-6刺激組相比，加入不同濃度的T4及T6均可顯著下調IL-6對STAT3、P-STAT3、Bcl-2及Bcl-x的增加量，且作用呈濃度依賴性 (*<0.05；**<0.01)。

用Real-time PCR檢測中藥單體化合物T4 (石斛堿)、T6 (粉防己堿) 對Raw264.7細胞Bcl-2及Bcl-x的mRNA表達水平的影響。結果表明 (圖7)，IL-6刺激可顯著提高Bcl-2及Bcl-x的mRNA表達水平。相比于單獨IL-6刺激組，不同濃度的T4 (石斛堿) 及T6 (粉防己堿) 的加入均能顯著降低IL-6對Bcl-2及Bcl-x的mRNA表達的刺激作用 (***<0.001)，且作用也呈一定的濃度依賴性。該結果與蛋白水平的檢測結果相一致。以上結果說明篩選獲得的T4 (石斛堿)、T6 (粉防己堿)具有抑制IL-6/STAT3信號通路，進而下調STAT3轉錄的腫瘤存活相關基因Bcl-2和Bcl-x表達的作用。

圖4 Raw264.7-STAT3細胞系中藥單體化合物篩選

圖5 中藥單體化合物T4 (石斛堿)對Raw264.7細胞系的Western blotting分析

圖6 中藥單體化合物T6 (粉防己堿)對Raw264.7細胞系的Western blotting分析

3 討論

本研究通過對實驗室原有重組質粒pQCXIP-NF-κB-NLuc改造，將設計的STAT3增強子序列替代原有的NF-κB增強子序列，成功構建重組逆轉錄病毒載體pQCXIP-STAT3-NLuc，并將該載體轉染及包裝得到的逆轉錄病毒侵染Raw264.7細胞，通過嘌呤霉素藥物篩選最終得到能穩(wěn)定有效表達STAT3-NLuc的Raw264.7- STAT3細胞株。利用STAT3信號通路刺激物IL-6對構建細胞的熒光素酶活性變化進行檢測，10 ng/mL及20 ng/mL組酶活性可達0 ng/mL組酶活性的18倍和23倍，明顯高于其他研究構建的STAT3轉錄系統(tǒng)[21]，差異極具有統(tǒng)計學意義 (***<0.001)，而IL-6對NF-κB的轉錄活性基本無影響，該結果表明Raw264.7-STAT3細胞系可以高效及特異地檢測STAT3的轉錄活性 (圖3)，該系統(tǒng)可成為篩選調控STAT3轉錄活性的藥物的有力工具。

研究表明，IL-6及其受體(IL-6R) 在許多腫瘤中呈高表達[22]。在生理狀況下，IL-6可通過磷脂酰肌醇-3-激酶 (PI3K)、Janus激酶 (JAK) 等不同的激酶級聯(lián)過程發(fā)揮其功能，而其通過JAK直接激活STAT1和STAT3，在腫瘤的形成過程中也扮演了重要角色[23]。大量機制研究也證明在慢性炎癥介導的腫瘤形成以及腫瘤生存和發(fā)展中，IL-6/STAT3信號通路發(fā)揮重要作用[14,24]。因此，尋找適當?shù)乃幬镆种艻L-6/STAT3信號通路的活化從而抑制腫瘤的生長和惡化具有重要意義及發(fā)展前景。我國中草藥資源豐富，運用中藥治療腫瘤也具有良好的臨床療效，目前已有很多關于中藥單體可通過抑制IL-6/STAT3信號通路發(fā)揮抗癌作用的報道[25-27]。本研究進一步利用構建的STAT3轉錄因子報告基因系統(tǒng)篩選抑制IL-6/STAT3信號通路的中藥單體。進行一系列的中藥單體篩選后，得到8種能下調IL-6激活的STAT3轉錄活性的中藥單體，其中效果較強的石斛堿(50 μmol/L) 及粉防己堿 (5 μmol/L) 對IL-6刺激STAT3轉錄活性的降低程度均超過50%。我們隨后以P-STAT3、STAT3、Bcl-2和Bcl-x為指標，利用Western blotting和Real-time PCR技術驗證粉防己堿及石斛堿對IL-6/STAT3信號通路的抑制效果。研究表明，Raw264.7細胞經(jīng)粉防己堿及石斛堿作用后，IL-6刺激導致的STAT3、P-STAT3含量及其下游蛋白Bcl-2和Bcl-x的表達量均隨中藥濃度的增加而降低，且呈劑量依賴性，并具有顯著統(tǒng)計學差異 (圖5–7)。這些結果表明利用我們構建的STAT3轉錄因子報告基因系統(tǒng)可以快速、便捷地篩選到可抑制IL-6/STAT3信號通路的中藥單體，雖然已有研究通過免疫印跡實驗發(fā)現(xiàn)粉防己堿能夠抑制STAT3信號通路，從而抗膠質瘤增殖[28]，但本研究采用IL-6/STAT3報告基因系統(tǒng)更加準確地說明了粉防己堿對于STAT3轉錄水平的干預。同時，本研究首次發(fā)現(xiàn)了石斛堿對STAT3信號通路的調控作用，基于以往對于石斛堿抗腫瘤的報道，其作用機制是否與STAT3信號通路的抑制相關，尚未可知，有待深入研究。

綜上，本研究將目的基因表達調控序列 (STAT3) 與編碼熒光素酶報告基因序列(NLuc) 連接，共轉染Raw264.7細胞，構建了一套可快速、便捷篩選抑制IL-6/STAT3信號通路的藥物的工具系統(tǒng)，可簡單通過檢測細胞內(nèi)熒光素酶活性反映藥物對STAT3轉錄活性的調控作用，最終篩選和驗證了粉防己堿及石斛堿這兩種可用于IL-6/STAT3信號通路相關的腫瘤防治的中藥單體。該工具系統(tǒng)靈敏度高、檢測方便，不僅能特異性地篩選出對目的基因具有靶向調控活性的藥物，還有助于發(fā)現(xiàn)其作用的具體靶位及作用機理，在靶向藥物篩選中具有極大的優(yōu)越性，在藥物篩選中有廣闊的應用前景。該工具系統(tǒng)可應用于今后更多、更廣泛的藥物篩選，同時篩選獲得的藥物有可能進一步發(fā)展成腫瘤防治的候選藥物，因此研究具有一定的理論及應用價值，可用于發(fā)掘更多、更有效的藥物，為癌癥的攻克帶來新的突破。

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Construction of IL-6/STAT3 reporter gene system for screening and validation of traditional Chinese medicine monomers inhibiting IL-6/STAT3 signaling pathway

Lulu Zhang, Jingzhe Li, Yanyan Ma, Tengfei Shang, Ziyi Wang, and Changzhen Liu

,,,100700,

It is important to find monomers of traditional Chinese medicine that can inhibit the activation of IL-6/STAT3 signaling pathway to suppress the growth and deterioration of tumors. A novel expression vector containing STAT3 enhancer sequence and NanoLuc (NLuc) reporter gene sequence was constructed by gene recombination technology, then a cell line expressing NLuc luciferase and regulated by STAT3 was further established. The cell line was used to quantitatively detect the regulatory effects of various traditional Chinese medicine monomers on the IL-6/STAT3 signal pathway. The effects of the traditional Chinese medicine monomers inhibiting the IL-6/STAT3 signal pathway were verified by Western blotting immunoassay and Real-time PCR analysis. By enzyme digestion and DNA sequencing analysis, it showed that the reporter gene expression vector pQCXIP-STAT3-Nluc was constructed successfully. The addition of Interleukin-6 (IL-6), a stimulator of STAT3 transcription factor, to the constructed cell line specifically enhanced the luciferase enzymatic reaction in a dose dependent manner. These results demonstrated that the cell line expressing NLuc luciferase and regulated by STAT3 has been constructed successfully. We used the the cell line screened out dendrobiine and tetrandrine which could significantly inhibit IL-6/STAT3 signal pathway and down-regulated the expression of Bcl-2 and Bcl-x in a dose-dependent manner. In conclusion, we have constructed an efficient reporter gene system to detect the transcriptional activity of STAT3, by which the Chinese medicine monomers inhibiting IL-6/STAT3 signaling pathway were successfully screened out, which has some potential theoretical and practical values.

IL-6/STAT3 signaling system, NLuc luciferase, dendrobiine, tetrandrine

張露露, 李晶哲, 馬琰巖, 等. IL-6/STAT3報告基因系統(tǒng)的構建及抑制IL-6/STAT3信號通路的中藥單體的篩選及驗證. 生物工程學報, 2020, 36(2): 353–361.

Zhang LL, Li JZ, Ma YY, et al. Construction of IL-6/STAT3 reporter gene system for screening and validation of traditional Chinese medicine monomers inhibiting IL-6/STAT3 signaling pathway. Chin J Biotech, 2020, 36(2): 353–361.

September 16, 2019;

December 18, 2019

Supported by:National Natural Science Foundation of China (Nos. 31170829, 81171762, 81550017), Beijing Natural Science Foundation (No. 7172150), the Research Project of CACMS (Nos. zz2015015, zz2018006).

Changzhen Liu. Tel: +86-10-64089526; E-mail: lcz0220@163.com

國家自然科學基金 (Nos. 31170829, 81171762, 81550017)，北京自然科學基金 (No. 7172150)，中國醫(yī)科院研究項目(Nos. zz2015015, zz2018006)資助。

10.13345/j.cjb.190413

(本文責編 陳宏宇)