程慧，陳園園，朱亞鑫，曹蓉，徐國強，張曉梅，史勁松，許正宏

·工業(yè)生物技術(shù)·

谷氨酸棒桿菌一步法發(fā)酵糖質(zhì)原料生產(chǎn)γ-聚谷氨酸

程慧1,2,3，陳園園1,2,3，朱亞鑫1,2,3，曹蓉1,2,3，徐國強1,2,3，張曉梅4，史勁松4，許正宏1,2,3

1 江南大學(xué) 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點實驗室，江蘇 無錫 214122 2 江南大學(xué) 糧食發(fā)酵與工藝技術(shù)國家工程實驗室，江蘇 無錫 214122 3 江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無錫 214122 4 江南大學(xué) 藥學(xué)院，江蘇 無錫 214122

γ-聚谷氨酸在食品、化妝品、生物醫(yī)藥等領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用，目前主要的生產(chǎn)菌株是谷氨酸依賴型菌株，在生產(chǎn)過程中需要添加谷氨酸作為前體，因而生產(chǎn)γ-聚谷氨酸的成本較高。文中主要研究從糖質(zhì)原料一步法發(fā)酵合成γ-聚谷氨酸的生產(chǎn)工藝。首先，從產(chǎn)γ-聚谷氨酸的菌株枯草芽孢桿菌中克隆γ-聚谷氨酸合成酶的基因簇，在谷氨酸棒桿菌模式菌株ATCC13032中進行誘導(dǎo)型和組成型表達，結(jié)果顯示，僅誘導(dǎo)型表達菌株可以積累γ-聚谷氨酸，產(chǎn)量為1.43 g/L。進一步對誘導(dǎo)條件進行優(yōu)化，確定誘導(dǎo)時間為2 h，IPTG濃度為0.8 mmol/L，γ-聚谷氨酸產(chǎn)量為1.98 g/L。在此基礎(chǔ)上，在一株高產(chǎn)谷氨酸的谷氨酸棒桿菌F343中外源表達，對重組菌進行發(fā)酵，結(jié)果表明，在搖瓶發(fā)酵中γ-聚谷氨酸產(chǎn)量達到10.23 g/L，在5 L發(fā)酵罐中產(chǎn)量達到20.08 g/L；繼而對γ-聚谷氨酸進行分子量測定，結(jié)果顯示，產(chǎn)自F343重組菌的γ-聚谷氨酸的重均分子量比產(chǎn)自枯草芽孢桿菌的提高34.77%。文中構(gòu)建了一步法發(fā)酵糖質(zhì)原料生產(chǎn)γ-聚谷氨酸的新途徑，同時為開發(fā)其潛在應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

γ-聚谷氨酸，谷氨酸棒桿菌，一步法發(fā)酵，糖質(zhì)原料，

γ-聚谷氨酸(γ-PGA) 是一種由L-谷氨酸和D-谷氨酸單體聚合成的生物聚合物，分為γ-L-PGA (僅由L-谷氨酸單體聚合而成)、γ-D-PGA (僅由D-谷氨酸單體聚合而成)、γ-LD-PGA (由D-谷氨酸、L-谷氨酸兩種單體聚合而成)。γ-PGA具有高水溶性、良好的生物降解特性、較強的增稠能力、對高金屬離子具有優(yōu)異的吸收性和結(jié)合能力等性質(zhì)[1]。近年來，γ-PGA廣泛應(yīng)用于食品、化妝品、生物醫(yī)學(xué)、環(huán)境保護等領(lǐng)域。在食品工業(yè)中，γ-PGA可以用作食品補充劑、增強劑、冷凍保護劑和減油劑[2-3]；在醫(yī)藥領(lǐng)域，γ-PGA因其良好的生物兼容性和無細(xì)胞毒性，可以作為重要的生物醫(yī)藥材料(如抗凝血材料和藥物載體)[4]；在環(huán)境保護領(lǐng)域，γ-PGA作為絮凝劑用來除去污水中的重金屬離子[5]。此外，大分子的γ-聚谷氨酸可以提高幼苗的脅迫耐受性，增加種子萌發(fā)率[6]，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中有重要用途。

已報道的γ-PGA合成方法有化學(xué)合成法、肽合成法、生物轉(zhuǎn)化法和微生物發(fā)酵法。與其他方法相比，微生物發(fā)酵法具有許多優(yōu)點，包括廉價的原料、較小的環(huán)境污染、較高的天然產(chǎn)物純度和溫和的反應(yīng)條件[2, 7]。在微生物發(fā)酵法中，目前主要的生產(chǎn)菌株是枯草芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌，兩者均為谷氨酸依賴型菌株，在發(fā)酵過程中需添加外源谷氨酸作為前體物質(zhì)。例如，浙江大學(xué)Huang等[8]在10 L發(fā)酵罐中采用高密度發(fā)酵工藝，利用枯草芽孢桿菌生產(chǎn)γ-聚谷氨酸，最高產(chǎn)量101.1 g/L，但發(fā)酵過程中需添加30 g/L的谷氨酸和40 g/L 酵母浸出物，流加750 g/L的葡萄糖，生產(chǎn)成本較高。為解決上述問題，研究人員嘗試從自然界中篩選非谷氨酸依賴型菌株，Geng等從發(fā)酵食品中分離獲得不依賴于谷氨酸的解淀粉芽孢桿菌LL3[9]，Shin等從非巴氏滅菌的醬油中分離出非谷氨酸依賴型菌株枯草芽孢桿菌C1[10]，但均存在γ-聚谷氨酸產(chǎn)量不高、菌株遺傳背景不清晰、不易進行基因操作等缺點。除此之外，Cao等[11]利用代謝工程手段，從解淀粉芽孢桿菌LL3中克隆γ-PGA合成酶基因，分別在大腸桿菌JM109和谷氨酸棒桿菌ATCC13032中成功表達，但是，其基因工程菌發(fā)酵產(chǎn)γ-PGA產(chǎn)量較低。

在芽孢桿菌sp.中，γ-PGA合成酶是γ-聚谷氨酸合成的關(guān)鍵酶。在枯草芽孢桿菌中已鑒定出γ-PGA合成途徑關(guān)鍵酶編碼基因和，其中PgsB和PgsC是ATP依賴型酶，催化γ-PGA聚合，在PgsA存在下，其活性得到進一步增強[13]，而在無PgsA存在下，枯草芽孢桿菌可以過量產(chǎn)生具有富含L-谷氨酸的單體比率的γ-PGA[14]。在炭疽桿菌中編碼γ-PGA的合成酶基因簇為[7,12]。由編碼的47個氨基酸的肽位于炭疽桿菌膜上，Candela等認(rèn)為CapE與CapA可能存在互動，在γ-聚谷氨酸合成中具介導(dǎo)γ-PGA轉(zhuǎn)運的作用[15-16]，決定合成的γ-PGA被保留或釋放。來源于枯草芽孢桿菌的PgsE也被命名為YwtC，它類似于CapE，有關(guān)PgsE蛋白在γ-PGA合成中的作用報道較少。Ashiuchi等在枯草芽孢桿菌分別敲除，發(fā)現(xiàn)敲除菌株無法合成γ-PGA，由此推斷編碼γ-PGA合酶復(fù)合物的關(guān)鍵基因為。本研究以產(chǎn)L-谷氨酸的谷氨酸棒桿菌為底盤微生物，外源表達來源于.ATCC6051-U γ-PGA合成酶基因簇，以期實現(xiàn)在不添加外源谷氨酸的條件下，直接利用葡萄糖一步法合成γ-聚谷氨酸。

1 材料與方法

1.1 菌株與質(zhì)粒

菌株：從ATCC購買，菌株號為ATCC 6051-U，是γ-聚谷氨酸合成酶的基因簇的來源菌株。谷氨酸棒桿菌F343由江南大學(xué)鄭璞教授提供，谷氨酸棒桿菌ATCC13032由本實驗室保藏。

質(zhì)粒：pZM1由美國倫斯勒理工學(xué)院Mattheos A. G. Koffas教授惠贈。

1.2 培養(yǎng)基與試劑

LB-Glu培養(yǎng)基(g/L)：蛋白胨10，酵母膏5，NaCl 5，葡萄糖1 (LB-Glu平板加入2%的瓊脂)，pH 7.0–7.2。

種子培養(yǎng)基(g/L)：玉米漿35，葡萄糖25，K2HPO41.5，MgSO40.6，F(xiàn)eSO40.005，MnCl2·4H2O 0.005，尿素2.5 (分消，過濾除菌)，pH 7.2–7.3，每250 mL三角瓶中裝液25 mL。

發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖120，玉米漿10，K2HPO41.0，MgSO40.6，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.002，MnCl2·4H2O 0.002，尿素7.0 (分消，過濾除菌)，硫胺素7.5×10–5，pH 7.2–7.3，500 mL三角瓶裝液量為50 mL。

三乙胺乙腈：三乙胺1.4 mL，乙腈8.6 mL，混勻(現(xiàn)配現(xiàn)用)。

PITC乙腈：PITC 25 μL，乙腈2 mL (不超過7 d)。

1.3 培養(yǎng)條件

1) 活化培養(yǎng)條件：從保菌管中吸取菌液 2–5 μL，在LB-Glu培養(yǎng)基中進行劃線，谷氨酸棒桿菌及本文所涉及的所有谷氨酸棒桿菌基因工程菌株32 ℃下培養(yǎng)32 h，枯草芽孢桿菌30 ℃下培養(yǎng)12 h。

2) 種子培養(yǎng)條件：從活化平板上挑取單菌落，接入種子培養(yǎng)基，谷氨酸棒桿菌及其基因工程菌株在往復(fù)式搖床中，120 r/min、32 ℃培養(yǎng)24 h，枯草芽孢桿菌在回旋式搖床中30 ℃下培養(yǎng)12 h。

3) 發(fā)酵培養(yǎng)條件：

谷氨酸棒桿菌及枯草芽孢桿菌：從種子培養(yǎng)基中取1.0 mL于50 mL發(fā)酵培養(yǎng)基中，在往復(fù)式搖床中120 r/min 37 ℃培養(yǎng)至發(fā)酵結(jié)束。

本文所涉及的所有谷氨酸棒桿菌基因工程菌：從種子培養(yǎng)基中取2.5 mL于發(fā)酵培養(yǎng)基中，在往復(fù)式搖床中120 r/min、32 ℃培養(yǎng)，添加誘導(dǎo)劑IPTG后32 ℃下培養(yǎng)1 h，將溫度調(diào)為37 ℃。

5 L發(fā)酵罐的培養(yǎng)條件：5 L發(fā)酵罐裝液量為3.5 L，用25%氨水和25%稀鹽酸流加調(diào)節(jié)初始pH為7.2，發(fā)酵罐轉(zhuǎn)速為300 r/min，到發(fā)酵穩(wěn)定期將轉(zhuǎn)速設(shè)置成與溶氧關(guān)聯(lián)，使溶氧維持在30%，通氣量為1 vvm，接種量為10%，36 ℃下發(fā)酵 12 h，在39 ℃培養(yǎng)至48 h。

1.4 構(gòu)建重組質(zhì)粒pZM1-pgsB、pZM1-pgsC、pZM1-pgsA

以ATCC 6051-U的基因組為模板，分別以ⅠFHⅠRⅠF/HⅠRⅠF/HⅠR為引物(序列見表1)，PCR擴增出帶酶切位點的目的基因、、片段。將酶切的目的基因片段與雙酶切(Ⅰ、HⅠ) 線性化的載體pZM1用T4 DNA連接酶進行過夜連接，并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌JM109感受態(tài)細(xì)胞中，在含有25 mg/L的卡那霉素(Kan) LB-Glu抗性平板上進行篩選，獲得的轉(zhuǎn)化子經(jīng)菌落PCR驗證及酶切驗證，得到正確的轉(zhuǎn)化子，再用同樣的方法將、分別連接到載體pZM1中。

1.5 RT-PCR

分別培養(yǎng)攜帶組成型和誘導(dǎo)型質(zhì)粒的谷氨酸棒桿菌基因工程菌株(ATCC 13032 pZM1 (P)、ATCC 13032 pZM1 (P))，收集兩者對數(shù)生長期(8 h、16 h、24 h) 的菌體，液氮研磨并用Trizol?試劑提取出總RNA，以Revert Aid First Strand cDNA Synthesis Kit (TaKaRa) 逆轉(zhuǎn)錄出的cDNA為模板，以ATCC 13032的16S rRNA用作內(nèi)部參考基因，以相應(yīng)的基因引物(表1) 進行熒光定量PCR。

1.6 分析方法

1.6.1 生物量的檢測

將各個取樣點的樣品稀釋至600值為0.2–0.8，量取200 μL，用核酸蛋白儀在波長600 nm處測取吸光度。

1.6.2 谷氨酸含量的檢測

1) 氨基酸的衍生化

將不同取樣點的樣(或氨基酸標(biāo)樣) 12 000 r/min離心10 min取上清200 μL，置于1.5 mL離心管中，12 000 r/min離心5 min，加入三乙胺乙腈和PITC乙腈各100 μL，混勻，反應(yīng)1–2 h，加入任己烷400 μL，劇烈振蕩后放置10 min，取下層PITC-氨基酸溶液，用0.45 μm針式過濾器過濾，取濾液100 μL加入到400 μL的水中，稀釋混勻，加入進樣瓶[17]。

表1 本研究中所用的引物序列

2) 高效液相色譜(HPLC)分析

流動相A(2 L)：15.2 g乙酸鈉，加入1 850 mL超純水溶解后用冰醋酸調(diào)pH至6.5，0.45 μm過濾膜抽濾，然后加入140 mL HPLC級乙腈，混勻，超聲30 min。

流動相B：80%乙腈水溶液。

柱溫40 ℃，波長250 nm。

色譜柱：Hypersil ODS-C18 4 mm×125 mm。

1.6.3 γ-聚谷氨酸含量的檢測

樣品處理：將發(fā)酵液12 000 r/min離心15 min，取上清，稀釋適當(dāng)倍數(shù)，用0.45 μm過濾膜過濾，取500 μL于2 mL進樣瓶中，待測[18]。

色譜柱：TSKgel super Aw 4000、TSKgel super Aw 5000。

流動相：0.3 mol/L Na2SO4，用冰醋酸調(diào)節(jié)流動相pH至4.0左右[18]。

柱溫：35 ℃，進樣量50 μL。

檢測器：Waters液相RID示差檢測器。

1.6.4 葡萄糖含量的檢測

通過HPLC檢測分析，HPLC儀器為Waters 1515，檢測器為示差檢測器。

1.6.5 NMR的檢測條件

1H-NMR用VARIAN-300核磁共振儀測定，工作頻率為299.95 MHz，以D2O為溶劑，50 ℃下采樣2 s，延遲時間10 s。

2 結(jié)果與分析

2.1 以菌株C. glutamicum ATCC13032為底盤微生物外源表達pgsBCA

2.1.1 γ-PGA生產(chǎn)菌株的構(gòu)建

為研究谷氨酸棒桿菌一步法發(fā)酵糖質(zhì)原料生產(chǎn)γ-聚谷氨酸，根據(jù)方法1.4構(gòu)建了誘導(dǎo)型表達載體pZM1(P)、pZM1(P)、pZM1 (P)。隨后用酶Ⅱ、Ⅰ酶切質(zhì)粒pZM1(P)獲得元件P--RBS--T7 (圖1)，同時以酶Ⅰ、Ⅰ雙酶切獲得的線性質(zhì)粒pZM1(P)為載體，由于Ⅰ與Ⅱ為一對同尾酶，故用T4 DNA連接酶將上述元件和載體于4 ℃過夜連接，得到重組質(zhì)粒pZM1(P)。在此質(zhì)?；A(chǔ)上用相同方法連接上元件P--RBS--T7，得到重組質(zhì)粒pZM1(P)，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌JM109后，提取質(zhì)粒作為模板，并用酶Ⅱ和Ⅰ進行雙酶切驗證。條帶大小與理論大小(3 500 bp) 相符，pZM1(P)全長8 304 bp，條帶驗證結(jié)果與理論大小相符，為正確重組質(zhì)粒(圖2)。

圖1 重組質(zhì)粒pZM1 (Ptac) pgsBCA的構(gòu)建過程

用酶Ⅱ和Ⅰ雙酶切質(zhì)粒pZM1(P)獲得含有γ-PGA合成酶基因的元件，同時以酶Ⅰ、Ⅰ雙酶切獲得組成型線性載體pZM1(P)，將上述所得元件和線性載體用T4 DNA連接酶于4 ℃過夜連接，構(gòu)建攜帶組成型表達載體的重組質(zhì)粒pZM1(P)，所得兩個質(zhì)粒經(jīng)金唯智生物技術(shù)有限公司測序，結(jié)果正確。將上述驗證正確的組成型和誘導(dǎo)型重組質(zhì)粒分別電轉(zhuǎn)入ATCC 13032中，在含有25 μg/L的卡那霉素抗性平板中進行篩選，挑取轉(zhuǎn)化子進行菌落PCR，驗證正確。

2.1.2 產(chǎn)物核磁共振鑒定

圖3A是純化得到發(fā)酵產(chǎn)物的1H核磁共振譜，從圖中可見譜峰的化學(xué)位移。其中水的化學(xué)位移為4.810 ppm；化學(xué)位移為H 2.056–2.203 ppm的是γ-聚谷氨酸分子式(圖3B) 中2號質(zhì)子的特征譜峰，2號H質(zhì)子由于與1號α位手性碳原子上的H質(zhì)子相耦合而生成雙峰；圖3B中3號(γ位) 氫質(zhì)子的個數(shù)與2號(β位) 的氫質(zhì)子個數(shù)相同，因此是一個峰面積為2號雙峰面積之和的單峰，其化學(xué)位移為H 2.480 ppm (圖3A)；1號處氫質(zhì)子與手性碳原子相連，受羧基的影響而使其向低磁場移動，化學(xué)位移為H 3.985 ppm (圖3A)。從圖3A可以看出，該化合物的氫譜信號峰并不多，α位的羧基向高磁場位移，說明發(fā)酵產(chǎn)物中存在γ-酰胺鍵，產(chǎn)物為γ-聚谷氨酸，這與陳雄等[19]的研究結(jié)果保持一致。

圖2 重組質(zhì)粒pZM1(Ptac/eftu)pgsBCA的酶切驗證

通過對產(chǎn)自重組菌ATCC 13032 pZM1(P)的發(fā)酵產(chǎn)物的NMR檢測，γ-聚谷氨酸中的γ-酰胺鍵上的特殊氫峰1、2、3號峰都能被檢測到，說明ATCC 13032 pZM1(P)發(fā)酵的聚合物是通過γ位上的羧基形成的肽鍵，是γ-聚谷氨酸。說明已成功在谷氨酸棒桿菌中異源表達合成酶基因，發(fā)酵生成γ-聚谷氨酸。

圖3 發(fā)酵產(chǎn)物的核磁共振鑒定 (A: 產(chǎn)自C. glutamicum ATCC13032 pZM1(Ptac)pgsBCA的γ-PGA的核磁共振氫譜圖；B: γ-PGA的結(jié)構(gòu)式)

2.1.3 搖瓶發(fā)酵特性評價

將重組菌ATCC 13032 pZM1 (P)按方法1.3進行發(fā)酵，結(jié)果如圖4所示，發(fā)酵到16 h，菌株由對數(shù)生長期進入到穩(wěn)定期，生物量在24 h達到60012.33(圖4A)。發(fā)酵進行到48 h，γ-聚谷氨酸產(chǎn)量最高，達到1.43 g/L (圖4C)，同時(48 h)谷氨酸含量達到10.63 g/L (圖4D)，葡萄糖剩余量為47.0 g/L (圖4B)。發(fā)酵液中谷氨酸含量較多，這可能與γ-聚谷氨酸的合成機制有關(guān)。Ashiuchi等[20]認(rèn)為由編碼的γ-聚谷氨酸合酶由催化部位定位在細(xì)胞膜上，因此發(fā)酵液中谷氨酸含量較多可能是因為在ATCC 13032中的胞內(nèi)谷氨酸大量外排，而未被聚合。也有學(xué)者認(rèn)為L-谷氨酸在聚合之前需在L-谷氨酸激酶的催化下被活化，以獲得聚合的額外能量，L-谷氨酸激酶較少或酶活不夠高也可能是原因之一。

將驗證正確的重組子ATCC 13032 pZM1(P)在上述發(fā)酵培養(yǎng)基(添加25 μg/L卡那霉素) 中發(fā)酵，發(fā)酵液無明顯粘度，通過HPLC在檢測方法1.6.3下測γ-聚谷氨酸含量，并未檢測到目標(biāo)產(chǎn)物。

2.1.4 IPTG添加時間及濃度的優(yōu)化

異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)和乳糖均是乳糖操縱子的有效誘導(dǎo)劑。乳糖有雙效作用，既能作為誘導(dǎo)劑，又可以作碳源，在誘導(dǎo)過程中很不穩(wěn)定；IPTG由于不被菌體代謝，誘導(dǎo)效率高，誘導(dǎo)效果持續(xù)穩(wěn)定而受到廣泛應(yīng)用，然而IPTG對于細(xì)胞具有潛在的毒性，因此適宜的誘導(dǎo)時間對重組菌發(fā)酵產(chǎn)γ-PGA較為重要。因此，采用單因素實驗優(yōu)化IPTG的誘導(dǎo)時間(0 h、2 h、3 h、4 h、5 h)和誘導(dǎo)濃度(0 mmol/L、0.2 mmol/L、0.4 mmol/L、0.6 mmol/L、0.8 mmol/L、1.0 mmol/L、1.2 mmol/L)，探究其對γ-PGA產(chǎn)量的影響。

圖4 C. glutamicum ATCC 13032 pZM1(Ptac)pgsBCA搖瓶發(fā)酵性能

由圖5A可知，在0 h進行誘導(dǎo)時，谷氨酸棒桿菌基因工程菌不能積累γ-PGA，隨著誘導(dǎo)時間的延長，γ-PGA的產(chǎn)量先上升后下降，在2 h誘導(dǎo)時，γ-PGA的產(chǎn)量最高，為1.76 g/L，較3 h添加IPTG時的產(chǎn)量(1.48 g/L) 上升了18.92%。在此基礎(chǔ)上，通過單因素實驗優(yōu)化IPTG的添加濃度，結(jié)果如圖5B所示。隨著IPTG濃度的增加，γ-PGA的產(chǎn)量先上升后下降，當(dāng)IPTG的濃度為0.8 mmol/L時，γ-PGA的產(chǎn)量最高，為1.98 g/L，較添加濃度為1.0 mmol/L時的產(chǎn)量增加了12.50%。因此通過對誘導(dǎo)條件的優(yōu)化，確定其較優(yōu)的誘導(dǎo)條件為：在發(fā)酵2 h時進行誘導(dǎo)，誘導(dǎo)濃度為0.8 mmol/L。

圖5 誘導(dǎo)條件的優(yōu)化(A：誘導(dǎo)時間的優(yōu)化；B：誘導(dǎo)濃度的優(yōu)化)

2.2 以工業(yè)菌株C. glutamicum F343為底盤微生物外源表達pgsBCA

ATCC 13032作為谷氨酸棒桿菌的模式菌株，具有清晰的遺傳背景，但其谷氨酸產(chǎn)量較低。因此，我們選用一株高產(chǎn)谷氨酸的工業(yè)菌株F343作為底盤微生物，以期提高γ-聚谷氨酸產(chǎn)量。

將上述驗證正確的重組質(zhì)粒pZM1(P)轉(zhuǎn)化到谷氨酸棒桿菌F343感受態(tài)中，以含有25 μg/L卡那霉素的LB-Glu抗性平板進行篩選，挑出轉(zhuǎn)化子進行菌落PCR，驗證結(jié)果正確。

2.2.1 底盤微生物.F343發(fā)酵產(chǎn)L-谷氨酸的發(fā)酵特性研究

谷氨酸作為γ-聚谷氨酸的前體物質(zhì)，提高出發(fā)菌株F343的谷氨酸產(chǎn)量是高產(chǎn)γ-聚谷氨酸的重要基礎(chǔ)。因此我們首先進行F343菌株發(fā)酵產(chǎn)谷氨酸的研究，在發(fā)酵過程中，分別每4 h、8 h用pH試紙檢測發(fā)酵液pH，并用1%的無菌尿素調(diào)節(jié)pH在7.2–7.3之間。分別測定了菌體生物量、葡萄糖消耗量和谷氨酸產(chǎn)量，結(jié)果如圖6所示。

從圖6C可知，從12 h到36 h，谷氨酸含量迅速增加，相同時間點上，通過每4 h調(diào)節(jié)一次pH的谷氨酸含量比每8 h調(diào)節(jié)一次pH的谷氨酸含量顯著提高，在36 h時，通過每4 h調(diào)節(jié)一次pH的谷氨酸含量達到11.05 g/L，相比8 h調(diào)節(jié)一次pH，提高了60.72%。說明F343產(chǎn)谷氨酸的發(fā)酵過程中，實時調(diào)控pH是谷氨酸高產(chǎn)的關(guān)鍵。從糖耗的曲線圖6B中可以看出，在每4 h調(diào)節(jié)一次pH與每8 h調(diào)節(jié)一次pH的條件下，F(xiàn)343菌株對碳源的利用無明顯差異。不同的pH調(diào)節(jié)對菌株生長的影響如圖6A所示，從圖中可已看出，在不同的pH調(diào)節(jié)時菌體生長都呈S型曲線，在0 h到8 h之間，兩種pH調(diào)節(jié)對生物量無顯著影響，但在12 h到36 h之間，每4 h調(diào)節(jié)一次pH的生物量提高顯著。其中，在36 h時，每4 h調(diào)節(jié)一次pH的生物量達到600為27.58，相比每8 h調(diào)節(jié)一次pH的生物量(600為23.02) 提高19.80%。說明F343菌體的生長對pH很敏感，這與Zheng等[21]的研究結(jié)果保持一致。

圖6 C. glutamicum F343搖瓶發(fā)酵性能

為進一步提高F343的谷氨酸產(chǎn)量，作者在實驗方法1.3的5 L發(fā)酵罐的培養(yǎng)條件下開展了谷氨酸棒桿菌的罐上發(fā)酵實驗。結(jié)果如圖7所示，F(xiàn)343菌體在16 h達到生長穩(wěn)定期，生物量600達到50.00，較搖瓶發(fā)酵水平的生物量600(26.00)提高了92.30%，同時葡萄糖在16 h時被迅速消耗，剩余量為27.60 g/L。谷氨酸在12 h之后開始積累，到32 h間積累迅速，在32 h達到44.61 g/L，在發(fā)酵結(jié)束時(48 h)，谷氨酸含量達到47.61 g/L，較搖瓶水平(11.08 g/L)提高了3.29倍。以上結(jié)果顯示，谷氨酸棒桿菌F343是一株對發(fā)酵液pH敏感的菌株，通過對發(fā)酵pH的實時控制顯著提升了谷氨酸的產(chǎn)量，為谷氨酸棒桿菌發(fā)酵生產(chǎn)γ-PGA提供了充足的前體物質(zhì)。Zheng等通過兩階段控制F343發(fā)酵過程中的pH，在最初的26 h內(nèi)，pH值控制在7.3和7.5之間，在最后4 h內(nèi)，pH值控制在7.2和7.5之間，使谷氨酸含量顯著提高，說明F343對發(fā)酵pH較為敏感。本實驗結(jié)果與其結(jié)果一致[21]。

圖7 C.glutamicum F343在5 L發(fā)酵罐水平的發(fā)酵性能

2.2.2 F343重組菌搖瓶發(fā)酵性能評價

在方法1.3的培養(yǎng)條件下，考察了菌株F343 pZM1(P)的發(fā)酵特性。如圖7A所示，發(fā)酵進行到24 h時，菌株F343 pZM1(P)已經(jīng)進入穩(wěn)定期，菌體生物量600達到11.46，同時，谷氨酸和γ-聚谷氨酸的產(chǎn)量也迅速增加，分別達到6.90 g/L (圖8D) 和8.79 g/L (圖8C)，同一時間點上(24 h)，葡萄糖含量由最初的120.0 g/L下降到77.6 g/L。隨著發(fā)酵時間的延長，谷氨酸和γ-聚谷氨酸進一步積累，發(fā)酵進行到48 h時，γ-聚谷氨酸的產(chǎn)量達到最高10.23 g/L (圖8C)，較ATCC 13032 pZM1(P)的產(chǎn)量(1.98 g/L) 提高了4.16倍，這可能是因為底盤微生物F343較ATCC13032的產(chǎn)谷氨酸能力更強，在搖瓶水平上，F(xiàn)343的谷氨酸產(chǎn)量約為ATCC 13032的10倍(數(shù)據(jù)未顯示)，為γ-聚谷氨酸的合成提供了較為充足的前體物質(zhì)。在36 h時谷氨酸積累達到最高11.10 g/L (圖8D)，隨著發(fā)酵時間的延長，谷氨酸和γ-PGA均有部分下降，在96 h時，谷氨酸、γ-PGA以及葡萄糖含量分別為7.86 g/L、9.07 g/L和49.6 g/L。

圖8 C. glutamicum F343 pZM1(Ptac)pgsBCA搖瓶發(fā)酵性能

γ-聚谷氨酸產(chǎn)量較48 h的產(chǎn)量下降11.34%，此實驗結(jié)果分別與Huang等[8]在.和Regestein等[22]在.中的研究保持一致，即在發(fā)酵過程中γ-PGA的含量受環(huán)境和微生物生長等影響而減少，這也可能是因為谷氨酸棒桿菌里存在一種類似于CWlO的細(xì)胞壁水解酶，這種酶廣泛存在于各種細(xì)菌中，且其調(diào)控機理不清晰[23]。

在方法1.3條件下，考察了F343 pZM1(P)發(fā)酵罐水平的發(fā)酵性能，結(jié)果如圖9所示，由圖可以看出，菌株在24 h進入穩(wěn)定期，生物量在48 h達到60027.00，與搖瓶水平上的生物量600(11.46) 相比，提高了1.35倍，與5 L發(fā)酵罐水平上的F343的生物量(600為50.00) 相比，下降了46%；谷氨酸產(chǎn)量在16 h之前迅速增加，在16 h之后產(chǎn)量相對穩(wěn)定，在40 h谷氨酸的積累量最大，為18.00 g/L，較搖瓶水平上的谷氨酸積累量(6.90 g/L) 提高了1.61倍；γ-PGA的產(chǎn)量先上升后下降，在24 h達到最高產(chǎn)量20.08 g/L，較搖瓶水平上的產(chǎn)量(10.23 g/L) 提高了1.03倍；葡萄糖的含量在發(fā)酵過程中逐漸降低，在48 h時，其葡萄糖剩余量為12.0 g/L，γ-PGA產(chǎn)物得率為0.19 g/g。

圖9 C. glutamicum F343 pZM1(Ptac)pgsBCA發(fā)酵罐水平的發(fā)酵性能

2.3 產(chǎn)物分子量的測定

分別對產(chǎn)自菌株ATCC6051-U和F343 pZM1(P)的γ-PGA進行醇沉，低溫烘干，加水溶解后用20 kDa的透析袋進行透析后冷凍干燥，獲得白色純化樣品，用流動相稀釋至適當(dāng)倍數(shù)，采用凝膠滲透色譜(GPC) 法分別檢測其分子量，兩者的數(shù)均分子量(n) 分別為9.24×105(±21.60%) Da和1.01×106(±6.31%) Da。重均分子量(w) 分別為1.20×106(±11.17%) Da和1.61×106(±2.48%) Da。產(chǎn)自F343 pZM1(P)的γ-PGA分子量較的相比較，重均分子量提高了34.77%。峰頂處分子量的大小由p表征，結(jié)合表2中的數(shù)據(jù)，產(chǎn)自谷氨酸棒桿菌F343重組菌的γ-PGA的p(1.80×106(±1.14%) Da) 較對照菌株的p(1.19×106(±4.97%) Da) 提高了51.26%。

從圖10A中，我們可以看出.ATCC 6051-U所產(chǎn)的γ-PGA的GPC峰圖有2個峰，在12 min存在1個峰使峰圖不成正態(tài)分布曲線，說明其分子量的分布不均一，而由圖10B可知，其峰型接近正態(tài)分布圖，無叉開的小峰，較圖10A相比，其γ-PGA分子量的分散性較差，即F343 pZM1(P)所產(chǎn)的γ-PGA均一性較ATCC6051-U好。

表2 產(chǎn)自B. subtilis ATCC6051-U和C. glutamicum F343 pZM1(Ptac)pgsBCA的γ-PGA分子量比較

圖10 凝膠滲透色譜檢測(A：產(chǎn)自B. subtilis ATCC6051-U的γ-PGA的凝膠滲透色譜；B：產(chǎn)自C. glutamicum F343 pZM1(Ptac)pgsBCA的γ-PGA的凝膠滲透色譜)

3 討論

γ-聚谷氨酸在現(xiàn)代農(nóng)業(yè)、生物醫(yī)藥、化妝品行業(yè)、環(huán)保行業(yè)及食品行業(yè)有著廣泛的應(yīng)用，目前主要生產(chǎn)菌株為谷氨酸依賴型菌株，發(fā)酵過程中需添加外源谷氨酸，具有生產(chǎn)成本較高的問題。目前，對γ-聚谷氨酸合成酶的異源重組表達獲得的γ-聚谷氨酸產(chǎn)量仍處于較低水平。

本研究首次利用合成生物學(xué)技術(shù)構(gòu)建了兩株重組菌株，分別是誘導(dǎo)型菌株ATCC13032 pZM1 (P)和組成型菌株ATCC13032 pZM1(P)。進一步發(fā)酵結(jié)果表明，僅誘導(dǎo)型菌株可以成功產(chǎn)γ-PGA。為探究其原因，采用qRT-PCR技術(shù)，比較了組成型和誘導(dǎo)型重組菌株中基因轉(zhuǎn)錄水平上的差異，如圖11所示，基因在誘導(dǎo)型菌株中的轉(zhuǎn)錄強度較組成型相比較弱，在8 h、16 h、24 h分別下降了57.05%、66.27%、45.28%。導(dǎo)致組成型菌株不生產(chǎn)γ-PGA的可能原因是基因的過早或過強表達不利于γ-PGA的合成。在對IPTG的誘導(dǎo)時間的優(yōu)化結(jié)果(圖5A)也支持這一假設(shè)，即在0 h開始誘導(dǎo)時，誘導(dǎo)型菌株不生產(chǎn)γ-PGA，在2 h之后誘導(dǎo)，γ-PGA的產(chǎn)量下降，即γ-PGA的產(chǎn)量對誘導(dǎo)時間較為敏感，誘導(dǎo)時間不同的表達時間也有所差異，這與枯草芽孢桿菌中的誘導(dǎo)表達機制一致[10]。在γ-PGA生產(chǎn)菌株枯草芽孢桿菌中，操縱子的完全啟動需要SwrAA和磷酸化形式的DegU(DegU~P)共存[24]，DegU (DegU~P)或SwrAA單獨存在僅對操縱子的轉(zhuǎn)錄和γ-PGA的生成有微弱影響[25]，因此，γ-PGA合成酶是需要在菌體特定的生長期啟動表達。通過NMR定性檢測發(fā)酵產(chǎn)物結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)發(fā)酵產(chǎn)物是具有γ酰胺鍵的γ-PGA。將誘導(dǎo)型菌株F343 pZM1(P)發(fā)酵到48 h，γ-聚谷氨酸達到最高產(chǎn)量1.43 g/L (圖4C)。2010年，Cao等[26]在ATCC13032中外源表達來自NK-03的γ-聚谷氨酸合成酶基因，產(chǎn)量達到0.69 g/L，與之相比，本研究達到的產(chǎn)量提高了約2倍。

圖11 組成型及誘導(dǎo)型工程菌株pgsBCA基因轉(zhuǎn)錄水平的比較

為進一步提高γ-PGA的產(chǎn)量，本研究提出通過提高底盤微生物的產(chǎn)谷氨酸能力來提高γ-PGA產(chǎn)量的策略，選用一株高產(chǎn)谷氨酸的谷氨酸棒桿菌F343為底盤微生物，構(gòu)建重組菌F343 pZM1 (P)。通過對底盤微生物F343谷氨酸發(fā)酵性能的探究，發(fā)現(xiàn)F343菌株是一株對發(fā)酵pH較敏感的菌株。在本文的發(fā)酵條件下γ-PGA產(chǎn)量大幅度提高，最終搖瓶產(chǎn)量達到10.23 g/L，耗糖56.62 g/L (48 h)，5 L發(fā)酵罐的產(chǎn)量達到20.08 g/L，耗糖108.0 g/L。在枯草芽孢桿菌的生產(chǎn)菌株中，目前γ-PGA最高產(chǎn)量為101.1 g/L[8]，發(fā)酵過程中需添加30 g/L的谷氨酸和40 g/L 酵母浸出物，流加750 g/L的葡萄糖；在地衣芽孢桿菌中γ-PGA最高的產(chǎn)量是45.73 g/L[27]，但其消耗糖80 g/L，添加外源谷氨酸和檸檬酸各20 g/L、18 g/L，而谷氨酸的成本價約為工業(yè)葡萄糖的4倍，因此如果通過發(fā)酵優(yōu)化等策略進一步提高菌株F343 pZM1(P)直接利用葡萄糖發(fā)酵產(chǎn)γ-PGA的產(chǎn)量，將有望節(jié)約γ-PGA的發(fā)酵成本。除此之外，地衣芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌主要原料為甘油，因此本研究在直接利用葡萄糖為原料生產(chǎn)γ-PGA上具有很大優(yōu)勢。

最后，本研究純化出產(chǎn)自F343 pZM1(P)和ATCC6051-U的γ-PGA，測得其重均分子量較ATCC6051-U產(chǎn)的天然γ-PGA的相比提高了34.77%，推測可能由于在枯草芽孢桿菌中存在γ-PGA降解基因、[28-29]。不同的相對分子質(zhì)量的γ-聚谷氨酸的用途也各不相同，例如相對分子質(zhì)量在2 kDa時常應(yīng)用在現(xiàn)代農(nóng)業(yè)中[30-31]，在45-60 kDa的γ-PGA是良好的藥物載體[32]，化妝品級的集中在80–120 kDa[33]，200 kDa左右的主要用作抑菌劑和絮凝劑[34]，目前已經(jīng)可以通過各類酶解法、堿水解法等方法控制其相對分子質(zhì)量[35]。因此我們發(fā)酵所獲得的高分子量的γ-PGA具有很大的應(yīng)用潛力，為其在化妝品、醫(yī)藥等各個行業(yè)的應(yīng)用奠定了良好的基礎(chǔ)。

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γ-Polyglutamic acid production inusing sugar by one-step fermentation

Hui Cheng1,2,3, Yuanyuan Chen1,2,3, Yaxin Zhu1,2,3, Rong Cao1,2,3, Guoqiang Xu1,2,3, Xiaomei Zhang4, Jinsong Shi4, and Zhenghong Xu1,2,3

1 Key Laboratory of Industrial Biotechnology of Ministry of Education, Jiangnan University,Wuxi 214122, Jiangsu, China 2 National Engineering Laboratory for Cereal Fermentation Technology,Jiangnan University, Wuxi 214122, Jiangsu, China 3 School of Biotechnology, Jiangnan University,Wuxi 214122, Jiangsu, China 4 School of Pharmaceutical Sciences, Jiangnan University,Wuxi 214122, Jiangsu, China

γ-polyglutamic acid (γ-PGA) is widely used in food processing, cosmetic production, medicinal industry, etc. Currently, the production strains used in fermentation process are commonly glutamic acid-dependent, which results in extra cost. In this study, away of producing γ-PGA from sugars was reported. To this end, the γ-polyglutamate synthase gene clusterwas cloned from the natural γ-PGA-producing strain(ATCC 6051-U), and was constitutively and inducibly expressed inATCC 13032. Only inducible expression ofcan lead to the generation of γ-PGA with a titer of 1.43 g/L from glucose, without any supplementation of glutamic acid. The production was further elevated to 1.98 g/L upon optimization of the induction conditions with the induction time at 2 h post-inoculation and the IPTG concentration of 0.8 mmol/L. Moreover, to achieve a higher titer of γ-PGA,was inducibly expressed inF343, which shows a paramount glutamate production capacity. The final γ-PGA production reached 10.23 g/L in shake flasks and 20.08 g/L in a 5-L fermentor using glucose as the substrate. The weight-average molecular weight (w) of γ-PGA from recombinant strain F343 showed 34.77% higher than that produced by.. This study provides a novel way of producing γ-PGA from sugars directly and potentiates new applications of γ-PGA in the future.

γ-polyglutamate,, one-step fermentation, sugar,

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February 22, 2019;

July 2, 2019

Supported by:Program of National First-class Discipline Program of Light Industry Technology and Engineering (No. LITE2018-11), Program of Introducing Talents of Discipline to Universities (No. 111-2-06), International Joint Research Laboratory for Engineering Synthetic Biosystems for Intelligent Biomanufacturing at Jiangnan University, the Six Talent Peaks Project in Jiangsu Province (No. 2015-SWYY-006), Top-notch Academic Programs Project of Jiangsu Higher Education Institutions (TAPP).

Guoqiang Xu. Tel: +86-510-85327353; E-mail: xuguoqiang@jiangnan.edu.cn

10.13345/j.cjb.190071

輕工技術(shù)與工程國際一流學(xué)科建設(shè)項目(No. LITE2018-11)，高等學(xué)校學(xué)科創(chuàng)新引智計劃 (No. 111-2-06)，江南大學(xué)合成生物系統(tǒng)與生物智造國際聯(lián)合實驗室項目，江蘇省六大人才高峰項目 (No. 2015-SWYY-006)，江蘇高校品牌專業(yè)建設(shè)工程項目 (TAPP) 資助。

2019-12-11

http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1998.Q.20191210.1052.002.html

(本文責(zé)編 陳宏宇)