陳燕君，張澤鴻，謝曉琪，羅純娜，彭 程，周 欣

(廣東藥科大學(xué)藥學(xué)院，廣東 廣州 510006)

近年來，我國化妝品總體消費(fèi)水平已超歐盟、日本，僅次于美國，成為世界上化妝品消費(fèi)第二大國。隨著人們消費(fèi)能力的增強(qiáng)，人們也越來越關(guān)注化妝品的使用安全，趙康峰等[1]對8大類化妝品進(jìn)行急性皮膚刺激性試驗(yàn)，結(jié)果表明各類受試化妝品均出現(xiàn)不同程度的急性皮膚刺激性損害效應(yīng)。這主要是因?yàn)榛瘖y品在生產(chǎn)、使用和保存過程中多種因素都可造成微生物污染，防止化妝品二次污染主要靠添加防腐劑[2-5]，但防腐劑種類繁多且均具一定毒性，過量頻繁接觸會(huì)導(dǎo)致人體過敏反應(yīng)，大多數(shù)防腐劑對人皮膚會(huì)產(chǎn)生不同程度的刺激[6-9]。因此，監(jiān)控化妝品中防腐劑的種類和含量尤為重要，我國《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》2015年版規(guī)定了51種準(zhǔn)用防腐劑的使用限量[10]。

實(shí)驗(yàn)中選取了使用較為廣泛的化妝水進(jìn)行檢測，目前化妝水中防腐劑測定方法有高效液相色譜法[11-15]、氣相色譜法[16-17]、氣質(zhì)法[18]、液質(zhì)法[19]、膠束電動(dòng)色譜法和毛細(xì)管電泳法[20-21]等，以高效液相色譜法為主，但這些方法流動(dòng)相復(fù)雜，樣品保留時(shí)間長，所以需要一種簡單、快速、穩(wěn)定、環(huán)保的測定方法，微乳色譜的出現(xiàn)正好可以解決這些問題。

微乳液相色譜(Microemulsion Liquid Chromatography，MELC)法，是由水、油、表面活性劑和助表面活性劑按適當(dāng)比例混合，自發(fā)形成的各向同性、透明或半透明、低粘度、熱力學(xué)穩(wěn)定的分散體系[22]。最常用的水包油型微乳是以十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfate，SDS)做表面活性劑，烷烴(庚烷、辛烷等)為油相，短鏈醇(丁醇、戊醇等)做助表面活性劑和一定量的水或緩沖液組成的體系。與常規(guī)高效液相不同，微乳中的表面活性劑與固定相表面吸附，使溶質(zhì)在修飾后的固定相、微乳液滴、水相之間進(jìn)行分配轉(zhuǎn)移達(dá)到平衡，改變組分在高效液相中兩相間的分配特性。因此，本研究建立同時(shí)測定化妝水中常用防腐劑的微乳色譜法，以期為化妝水中防腐劑的快速檢測提供技術(shù)支持。

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 試劑與儀器

十二烷基硫酸鈉(SDS，w=99.5%，生物技術(shù)級)，上海麥克林生化科技有限公司；對羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸乙酯、對羥基苯甲酸丙酯和對羥基苯甲酸丁酯(w>99.5%)，迪馬公司；甲基異噻唑啉酮、苯氧乙醇、碘丙炔醇丁基氨甲酸酯、山梨酸鉀(w>99.5%)，麥克林公司；氯苯甘醚(w>99.5%)，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；甲醇、正丁醇、正辛烷、磷酸均為分析純，廣州化學(xué)試劑廠；水為屈臣氏蒸餾水；檢測樣品為市售化妝品，樣品信息見表1。

表1 化妝水樣品信息

高效液相色譜儀1260系列，G1311A系列四元泵，G1314A系列DAD檢測器，Chem32工作站，安捷倫科技公司；KQ-250DE超聲波清洗器(頻率(35±5) kHz，功率250 W)，昆山市超聲儀器有限公司；Anke TDL80-2B離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠；TX223L電子天平，SHIMADZU。

1.2 色譜條件

色譜柱:Diamonsil C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，柱溫30 ℃，檢測波長254 nm，流量0.7 mL/min，進(jìn)樣體積20 μL；流動(dòng)相3.0%(W/V)十二烷基硫酸鈉SDS-6.0%(V/V)正丁醇-0.4%(V/V)正辛烷-90.6%(V/V)0.1%磷酸水。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液的配制

分別精密稱取甲基異噻唑啉酮、苯氧乙醇、對羥基苯甲酸甲酯、山梨酸鉀、氯苯甘醚、對羥基苯甲酸乙酯、對羥基苯甲酸丙酯、碘丙炔醇丁基氨甲酸酯、對羥基苯甲酸丁酯403 mg、245.5 mg、25.5 mg、129.5 mg、103.2 mg、4.5 mg、10.5 mg、499.92 mg、10.6 mg于10 mL、50 mL、25 mL、100 mL、25 mL、100 mL、50 mL、10 mL、50 mL容量瓶，用甲醇溶解定容至刻度，搖勻，經(jīng)0.22 μm濾膜過濾，得質(zhì)量濃度分別為40.3 mg/mL、4.91 mg/mL、1.02 mg/mL、1.30 mg/mL、4.13 mg/mL、0.045 mg/mL、0.21 mg/mL、50.0 mg/mL、0.21 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。

1.4 樣品預(yù)處理

取樣品1 g，精密稱定，置于25 mL具塞三角瓶，精密加入甲醇10 mL，稱重，振搖，超聲提取30 min，補(bǔ)足失重，經(jīng)0.22 μm濾膜過濾，取續(xù)濾液為供試溶液。

2 結(jié)果與討論

2.1 專屬性

空白、混合標(biāo)準(zhǔn)溶液、樣品色譜圖如圖1～圖3所示，9種防腐劑保留時(shí)間分別為3.386 min，7.788 min，8.583 min，9.439 min，10.340 min，11.421 min，14.776 min，16.356 min，17.929 min。在選定色譜條件下，化妝水樣品G17中無雜質(zhì)干擾測定。

圖1 空白樣品色譜圖

圖2 9種防腐劑混合標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖

圖3 樣品(G17)色譜圖

2.2 提取溶劑

考察水、甲醇及兩種溶液混合后作提取溶劑，結(jié)果表明9種防腐劑在甲醇中提取效果最好，經(jīng)甲醇提取后濾液澄清且穩(wěn)定性高，目標(biāo)防腐劑峰面積大且雜質(zhì)峰少；用水或混合液提取后樣品不穩(wěn)定且濾液渾濁。故以甲醇為提取溶劑。

2.3 提取方法

實(shí)驗(yàn)考察超聲30 min、2500 r/min離心15 min、超聲30 min后以2500 r/min離心15 min三種提取方法，第二種方法提取后溶液渾濁，第一、三種方法提取后溶液澄清，但第三種方法提取后溶液底部有絮狀沉淀，最終采取超聲30 min作為樣品提取方法。

2.4 微乳色譜優(yōu)化

2.4.1 表面活性劑

表面活性劑指加入少量能使其溶液體系界面狀態(tài)發(fā)生明顯變化的物質(zhì)，通過降低溶液表面張力構(gòu)成界面膜，形成穩(wěn)定的微乳。目前微乳最常用的表面活性劑為十二烷基硫酸鈉(SDS)，一種無毒的陰離子表面活性劑，可作乳化劑，其生物降解度大于90%，降解速度快，是環(huán)保性能較好的表面活性劑。實(shí)驗(yàn)用SDS作表面活性劑。

2.4.2 助表面活性劑

助表面活性劑主要影響體系的熱力學(xué)性質(zhì)，起協(xié)助表面活性劑降低界面張力、增加界面流動(dòng)性、增加微乳的膜強(qiáng)度及減少微乳形成時(shí)的界面彎曲，使微乳自發(fā)形成并穩(wěn)定存在的作用。實(shí)驗(yàn)考察異丙醇和正丁醇對分離的影響。以異丙醇為助表面活性劑時(shí)，色譜峰出現(xiàn)拖尾及分叉。支鏈的異丙醇對微乳形成無明顯的促進(jìn)作用，可能因支鏈增加導(dǎo)致醇空間位阻增大，使其插入界面膜的阻力增大[23]。故以正丁醇為助表面活性劑。

2.4.3 油 相

在微乳色譜中，油相的加入增加了流動(dòng)相中有機(jī)相比例，縮短保留時(shí)間；另一方面，油相分子分配到固定相上，使固定相的極性變小，使化合物的保留和選擇性變化更復(fù)雜[24]。實(shí)驗(yàn)考察環(huán)己烷、正庚烷和正辛烷對分離選擇性的影響，以環(huán)己烷為油相時(shí)出現(xiàn)色譜峰分叉，環(huán)己烷增溶及洗脫能力均較弱，與溶劑的洗脫能力差異較大，易出現(xiàn)色譜峰分叉；以正庚烷為油相時(shí)，分離度好，但出現(xiàn)前沿峰，可能是流動(dòng)相局部洗脫能力增強(qiáng)，樣品未被流動(dòng)相充分稀釋，也有色譜峰分叉，且保留時(shí)間變長。故選擇正辛烷為油相。

2.4.4 流動(dòng)相配制順序

實(shí)驗(yàn)對比以表面活性劑-水相-助表面活性劑-油相以及表面活性劑-助表面活性劑-水相-油相為順序配制流動(dòng)相，發(fā)現(xiàn)前者色譜峰保留時(shí)間變短，且流動(dòng)相更穩(wěn)定，在色譜柱中更易達(dá)到平衡，實(shí)驗(yàn)中以此順序配制流動(dòng)相。

2.4.5 流動(dòng)相比例考察

實(shí)驗(yàn)考察時(shí)通過調(diào)節(jié)SDS與水的比例，來確定SDS的范圍；采用稀釋法考察將SDS比例調(diào)低對分離的影響，即先按照3.0%SDS(W/V)-6.6%正丁醇(V/V)-0.8%正辛烷(V/V)-89.6%水(V/V)配制原溶液，量取一定量配制好的原溶液后，再加水使成400 mL。原溶液：水的比例為390:10、380:20、370:30比例下，苯氧乙醇峰形不佳，對羥基苯甲酸甲酯、乙酯、丙酯、丁酯色譜峰均拖尾，360:40比例下，以上四種防腐劑仍拖尾；350:50比例下，以上四種防腐劑基本分離，但其他組分不分離。實(shí)驗(yàn)又考察固定正丁醇(6.6%，V/V)、正辛烷(0.8%，V/V)的比例，對比SDS(W/V)為3.0%、3.5%、4.0%時(shí)的色譜圖，發(fā)現(xiàn)比例為3.5%、4.0%時(shí)，保留時(shí)間較3.0%的均延后，4.0%的延后更明顯，且樣品均不能很好分離。最終確定流動(dòng)相的比例為3.0%(W/V)十二烷基硫酸鈉(SDS)-6.0%(V/V)正丁醇-0.4%(V/V)正辛烷-90.6%(V/V)(0.1%磷酸)水。

2.5 方法學(xué)驗(yàn)證

2.5.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

分別吸取一定量的9種防腐劑對照品貯備液，加甲醇稀釋成不同濃度梯度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，依次進(jìn)樣，以相應(yīng)的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，組分的峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，線性回歸方程和相關(guān)系數(shù)見表2，9種防腐劑在0.945～4999.2 μg/mL濃度范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系且相關(guān)系數(shù)均大于或等于0.9996，可用于定量分析。

表2 9種防腐劑的線性范圍、回歸方程和相關(guān)系數(shù)

2.5.2 精密度實(shí)驗(yàn)

取混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的對照品溶液(甲基異噻唑啉酮、苯氧乙醇、對羥基苯甲酸甲酯、山梨酸鉀、氯苯甘醚、對羥基苯甲酸乙酯、對羥基苯甲酸丙酯、碘丙炔醇丁基氨甲酸酯和對羥基苯甲酸丁酯的質(zhì)量濃度分別為2015 μg/mL、245.5 μg/mL、25.5 μg/mL、9.065 μg/mL、206.4 μg/mL、6.75 μg/mL、10.5 μg/mL、2499.6 μg/mL、10.6 μg/mL)進(jìn)樣20 μL，連續(xù)測定6次，記錄峰面積，計(jì)算得RSD均小于1.88%，表明該方法精密度良好。

2.5.3 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

取化妝水G17樣品 6份，每份1 g，按“2.5.2”項(xiàng)下方法處理，依次進(jìn)樣20 μL，樣品所含防腐劑的峰面積RSD皆小于1.99%(n=6)，表明該分析方法重復(fù)性良好。

2.5.4 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

取化妝水樣品G17 1 g，按“2.5.2”項(xiàng)下方法處理，在0、2、4、6、8、10、12 h，分別進(jìn)樣20 μL，記錄峰面積。結(jié)果樣品中所含防腐劑的RSD 皆小于0.97%，表明該化妝水樣品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.5.5 加樣回收率

精密稱取化妝水樣品G17 0.5 g共9份，分別加入相應(yīng)量的低(80%)、中(100%)、高(120%)濃度的9種防腐劑對照品，每個(gè)質(zhì)量濃度水平平行制備3份，按“2.5.2”項(xiàng)下方法處理，依次進(jìn)樣20 μL，計(jì)算回收率，平均回收率為95.1%～104.6%，RSD為0.57%～5.30%，說明樣品回收率良好。

表3 樣品加樣回收結(jié)果

2.6 樣品測定

實(shí)驗(yàn)前以調(diào)查問卷形式收集化妝水使用情況，測定使用人數(shù)較多的具一定代表性的29份市售化妝水樣品(其中6份為化妝水配套的乳液)。結(jié)果顯示，有9份化妝水同時(shí)含2種防腐劑，有7份化妝水同時(shí)含3種防腐劑；化妝水和其配套的乳液中添加的防腐劑并不完全一樣；部分化妝水成分表與本實(shí)驗(yàn)實(shí)際檢出結(jié)果不一致。

根據(jù)實(shí)驗(yàn)檢出結(jié)果，9種防腐劑在29份化妝水中的檢出率見圖4，其中標(biāo)示率是按29份化妝水標(biāo)簽成分表中含有的防腐劑計(jì)算所得。有13份化妝水樣品成分表中未標(biāo)示含對羥基苯甲酸甲酯但卻檢出含有該防腐劑；已標(biāo)示有對羥基苯甲酸乙酯的樣品全部檢出，但還有7份樣品未標(biāo)示仍檢出該防腐劑；另外，9種防腐劑中，苯氧乙醇和對羥基苯甲酸甲酯都是檢出率較高的防腐劑成分，這兩種防腐劑也是化妝水中添加較為普遍的兩種成分，作為比較溫和的苯氧乙醇防腐體系，其檢出率和標(biāo)示率相對比較接近，但是刺激度較高的對羥基苯甲酸甲酯，其檢出率卻是標(biāo)示率的2倍，說明化妝水使用過程中造成過敏、炎癥等情況有可能是因?yàn)槌煞直碇形礈?zhǔn)確標(biāo)出全部的防腐劑造成，因此也提示消費(fèi)者在購買化妝水時(shí)不能完全依賴成分表上的標(biāo)示。

圖4 9種防腐劑檢出結(jié)果

3 結(jié) 論

近年來，化妝品中新型防腐劑發(fā)展迅速，使用頻率不斷增加[25]，本實(shí)驗(yàn)中部分化妝水成分表標(biāo)示的防腐劑與檢出結(jié)果不一致，對化妝水的監(jiān)督檢驗(yàn)與質(zhì)量控制需引起重視，以保障人們使用的安全性。

本研究建立了同時(shí)測定化妝水中9種防腐劑的微乳色譜法并進(jìn)行了系統(tǒng)研究，彌補(bǔ)了常規(guī)高效液相色譜法出峰時(shí)間較長的缺點(diǎn)[26-27]，分離效率高且速度快，前處理簡單，有機(jī)溶劑用量少，成本低，毒性低，環(huán)境污染小，更為綠色環(huán)保，可滿足市售化妝水中防腐劑的定性和定量分析要求。