杜憲超,郝紅霞,秦安軍,唐本忠,3

(1. 華南理工大學(xué)發(fā)光材料與器件國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣東省分子聚集發(fā)光重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,聚集誘導(dǎo)發(fā)光研究中心,廣州 510640;2. 中國(guó)政法大學(xué)證據(jù)科學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,2011計(jì)劃司法文明協(xié)同創(chuàng)新中心,北京 100088;3. 香港科技大學(xué)化學(xué)系,國(guó)家人體組織重建工程技術(shù)研究中心香港分中心,香港)

目前非法藥物的濫用已經(jīng)成為全球性的公共安全衛(wèi)生問(wèn)題之一[1～3]. 其中可卡因作為一種全球禁用的非法藥物,長(zhǎng)期濫用會(huì)對(duì)人體造成許多不良的影響,如精神疾病、失眠、抑郁和暴力傾向等,甚至威脅生命,同時(shí),吸食可卡因還會(huì)導(dǎo)致出現(xiàn)各種社會(huì)問(wèn)題[4,5]. 因此實(shí)現(xiàn)對(duì)可卡因的快速檢測(cè)成為打擊毒品犯罪、維護(hù)社會(huì)穩(wěn)定的關(guān)鍵. 目前對(duì)于可卡因的檢測(cè)主要采用氣相色譜/質(zhì)譜(GC/MS)和液相色譜/質(zhì)譜(LC/MS)等大型儀器. 雖然能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)可卡因檢測(cè),但大多需要專業(yè)人員操作且耗時(shí)較長(zhǎng),因此開發(fā)一種簡(jiǎn)便、高效且可靠的可卡因檢測(cè)方法成為研究的熱點(diǎn)[6～8]. 其中,基于熒光探針的檢測(cè)手段由于具有高效、靈敏及便捷等優(yōu)勢(shì)而備受關(guān)注,但傳統(tǒng)的熒光探針面臨聚集導(dǎo)致發(fā)光猝滅(ACQ)的難題[9,10],即這類分子在溶液中發(fā)光非常強(qiáng),一旦聚集或在固體中發(fā)光顯著減弱,非常不利于實(shí)際應(yīng)用.

聚集誘導(dǎo)發(fā)光(AIE)[11～13]可從根本上解決ACQ的難題,是設(shè)計(jì)熒光傳感材料和顯像劑的理想選擇[14～16]. AIE是我們團(tuán)隊(duì)提出的一個(gè)科學(xué)概念,是指在溶液狀態(tài)不發(fā)光或者發(fā)光微弱的分子聚集后或在固態(tài)下發(fā)光顯著增強(qiáng)的現(xiàn)象,但利用AIE探針對(duì)非法藥物的檢測(cè)鮮見報(bào)道. 本文基于AIE探針?lè)肿娱_展了對(duì)非法藥物可卡因的檢測(cè)研究,同時(shí)為進(jìn)一步提高檢測(cè)的靈敏度和選擇性,引入適配體與外切酶Ⅰ(Exo Ⅰ)進(jìn)行協(xié)同(反應(yīng)過(guò)程見Scheme 1).

適配體是一種通過(guò)體外指數(shù)富集技術(shù)(SELEX)合成的具有特定序列的寡聚核苷酸[17,18],可以與特定的靶標(biāo)物進(jìn)行高選擇性和高特異性結(jié)合,形成特殊的三級(jí)結(jié)構(gòu). 由于這些獨(dú)特的功能,使適配體在生物傳感器的開發(fā)中具有巨大的潛力[19～24]. 核酸外切酶Ⅰ(Exo Ⅰ)作為一種特殊的核酸酶,能夠從末端或內(nèi)部裂解核酸核苷酸之間的磷酸二酯鍵,將單鏈DNA分解成磷酸和單個(gè)核苷酸,而Exo Ⅰ對(duì)雙鏈DNA或是特殊三維結(jié)構(gòu)的DNA沒(méi)有效果. 基于Exo Ⅰ優(yōu)異的選擇性,目前其已經(jīng)被應(yīng)用到小分子、蛋白質(zhì)和無(wú)機(jī)鹽離子的檢測(cè)中[25,26].

Scheme 1 Schematic illustration of detection of cocaine by the system of AIEgen,aptamers and exonuclease Ⅰ

研究結(jié)果表明,以AIE分子4,4′,4″,4″′-四(4-丁氧基三乙基溴化銨)四苯基乙烯(TPE-TTA)作為熒光探針?lè)肿?適配體作為識(shí)別單元,Exo Ⅰ作為輔助,可成功實(shí)現(xiàn)對(duì)水相及尿液中可卡因的快速檢測(cè),其最低檢出限可分別達(dá)0.66和1.0 μmol/L.

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器 4,4′-二羥基二苯甲酮、1,4-二溴丁烷和四氯化鈦購(gòu)于阿拉丁試劑有限公司; 可卡因適配體及Exo Ⅰ由上海生工生物工程股份有限公司合成,適配體經(jīng)高效液相色譜(HPLC)純化,其堿基序列為5′-GGGAGACAAGGATAAATCCTTCAATGAAGTGGGTCGACA-3′; 其它試劑及無(wú)機(jī)鹽均為市售分析純.

Bruker AV 400/500 MHz核磁共振波譜(NMR)儀,德國(guó)Bruker公司; Horiba Fluoromax-4型熒光光譜儀,日本HORIBA公司; SENS-9000型分子熒光光度儀,北京卓立漢光儀器有限公司; 島津UV-2600型紫外-可見(UV-Vis)吸收光譜儀,日本島津公司; Hamamatsu C11347型絕對(duì)熒光量子產(chǎn)率光譜儀,日本濱松光子學(xué)株式會(huì)社; Malvern MicroCal型等溫滴定量熱(ITC)儀,英國(guó)馬爾文儀器公司.

1.2 實(shí)驗(yàn)過(guò)程 如Scheme 2所示,參照文獻(xiàn)[27]方法合成4,4′-二(4-溴丁氧基)二苯甲酮(1)和4,4′,4″,4″′-四(4-溴丁氧基)四苯基乙烯(2)(1H 和13C NMR譜圖見圖S1～圖S6,見本文支持信息).

Scheme 2 Synthetic routes of TPE-TTA

根據(jù)Scheme 2的路線合成探針TPE-TTA. 將0.3 g(0.32 mmol)化合物2和15 mL三乙胺置于圓底燒瓶中,加入50 mL四氫呋喃(THF),加熱回流72 h; 緩慢加入10 mL水; 反應(yīng)結(jié)束后,通過(guò)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去四氫呋喃,得到黏稠的油狀粗產(chǎn)物; 用THF洗滌多次,得到0.369 g透明的油狀化合物TPE-TTA,產(chǎn)率86%.1H NMR(400 MHz,DMSO-d6),δ: 6.84(d,J=8.7 Hz,8H),6.71(d,J=8.7 Hz,8H),4.01～3.84(m,8H),3.30～3.17(m,32H),1.78～1.65(m,16H),1.17(t,J=6.8 Hz,36H).13C NMR(125 MHz,DMSO-d6),δ: 157.19,138.52,136.81,132.46,114.21,66.98,56.16,52.52,26.04,18.51,7.67.

將可卡因適配體離心后溶于去離子水中,配成濃度為100 μmol/L的母液,并存放在4 ℃冰箱中; 將可卡因溶解于Tris-HCl(25 mmol/L Tris-HCl,0.15 mol/L NaCl,2 mmol/L MgCl2,pH=8.0)緩沖溶液中,配成1 mmol/L的母液儲(chǔ)存于4 ℃冰箱中備用.

2 結(jié)果與討論

2.1 AIE性質(zhì) 首先測(cè)試了探針?lè)肿覶PE-TTA的光物理性質(zhì),由圖S7(見本文支持信息)可見,TPE-TTA在甲醇溶液中具有較好的溶解性,幾乎不發(fā)光(熒光量子產(chǎn)率為0.8%). 隨著不良溶劑甲苯的增加,TPE-TTA發(fā)生聚集,導(dǎo)致分子內(nèi)苯環(huán)旋轉(zhuǎn)受到限制,從而產(chǎn)生熒光(95%甲苯/甲醇溶液熒光量子產(chǎn)率為25.4%). 同時(shí),測(cè)得TPE-TTA在固態(tài)時(shí)熒光量子產(chǎn)率為62.7%,由此證明其是一個(gè)AIE分子.

2.2 傳感平臺(tái)可行性分析 采用ITC測(cè)試了可卡因與適配體之間的作用力. 由圖S8(見本文支持信息)可見,可卡因與適配體具有很好的結(jié)合能力,為實(shí)驗(yàn)的可行性提供了重要的依據(jù). 為了證實(shí)帶正電荷的探針?lè)肿涌梢耘c適配體相互結(jié)合,進(jìn)行了熒光光譜監(jiān)控下適配體對(duì)探針?lè)肿拥牡味▽?shí)驗(yàn). 由圖1(A)可見,隨著適配體的加入,探針?lè)肿覶PE-TTA在480 nm處的熒光強(qiáng)度逐漸增強(qiáng). 這是由于探針?lè)肿优c適配體相互結(jié)合導(dǎo)致TPE-TTA內(nèi)苯環(huán)的旋轉(zhuǎn)受到限制[28],因此熒光增強(qiáng),這也可以通過(guò)加入適配體前后的吸收變化得以證實(shí)(圖S9,見本文支持信息).

Fig.1 Photoluminescence(PL) spectra of TPE-TTA in Tris-HCl solution upon addition of anticocaine aptamer from 0 to 0.2 μmol/L(A) and exonuclease-mixture treated and untreated anticocaine aptamer in the presence or absence of cocaine(B)λex=340 nm; c(TPE-TTA)=5 μmol/L. (B) c(anticocaine aptamer)=0.2 μmol/L.

可卡因適配體在可卡因存在下可使單鏈適配體盤旋折疊成Y型雙鏈三維結(jié)構(gòu)[29],加入Exo Ⅰ后,將無(wú)法切割適配體,因此在加入TPE-TTA后熒光點(diǎn)亮,而沒(méi)有作用的適配體將被分解,且對(duì)探針的熒光發(fā)射不產(chǎn)生影響. 基于上述原理,我們將可卡因與適配體共同孵育一段時(shí)間后,加入Exo Ⅰ,再孵育一段時(shí)間,向溶液中加入探針?lè)肿覶PE-TTA,與未加入可卡因的適配體進(jìn)行對(duì)比,發(fā)現(xiàn)只有在加入可卡因時(shí)探針熒光增強(qiáng),進(jìn)一步證實(shí)該傳感器可以實(shí)現(xiàn)對(duì)可卡因的檢測(cè)[圖1(B)].

2.3 最佳實(shí)驗(yàn)條件的選擇 為了確定檢測(cè)可卡因的最優(yōu)條件,進(jìn)行了一系列的條件優(yōu)化實(shí)驗(yàn),包括Exo Ⅰ用量、Exo Ⅰ與適配體孵育時(shí)間及可卡因與適配體孵育的溫度和時(shí)間. 為了獲取Exo Ⅰ的最佳降解濃度,對(duì)酶活性進(jìn)行了考察. 固定適配體的濃度為0.2 μmol/L,TPE-TTA濃度為5 μmol/L,將不同濃度的Exo Ⅰ(0,3,6,9,12,15,18和21 U)添加到緩沖溶液中,測(cè)試其熒光光譜[圖2(A)]. 隨著Exo Ⅰ濃度的提高,越來(lái)越多的適配體被切割成單個(gè)的核苷酸和磷酸,導(dǎo)致TPE-TTA周圍的苯環(huán)無(wú)法被限制運(yùn)動(dòng),溶液的熒光強(qiáng)度逐漸下降,當(dāng)Exo Ⅰ濃度到達(dá)15 U時(shí),熒光強(qiáng)度達(dá)到最小,表明適配體完全被降解. 因此,選定15 U的Exo Ⅰ作為最佳濃度進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)以優(yōu)化參數(shù).

Fig.2 PL spectra of anticocaine aptamer/TPE-TTA in buffer with addition of Exo Ⅰ(A) and plots of relative PL intensity of sensing system versus incubation time of Exo Ⅰ with anticocaine aptamer(B),cocaine incubation temperature with anticocaine aptamer(C) and incubation time of anticocaine aptamer with cocaine(D)λex=340 nm,c(anticocaine aptamer)=0.2 μmol/L; c(TPE-TTA)=5 μmol/L.

以15 U的Exo Ⅰ考察Exo Ⅰ與適配體孵育時(shí)間對(duì)體系的影響[圖2(B)]. 由圖2(B)可見,隨著時(shí)間的延長(zhǎng),熒光強(qiáng)度降低明顯并慢慢趨于平緩,30 min后熒光強(qiáng)度基本不再變化,因此,選擇30 min作為最佳反應(yīng)時(shí)間.

溫度對(duì)可卡因與適配體結(jié)合的影響不大. 由圖2(C)可見,在不同溫度下(20,25,30,35,40 ℃),熒光強(qiáng)度隨溫度變化產(chǎn)生微小的變化,在25 ℃下熒光強(qiáng)度達(dá)到最大,因此選擇25 ℃作為適配體的最佳孵育溫度.

對(duì)可卡因與適配體的孵育時(shí)間進(jìn)行了考察. 由圖2(D)可見,隨著可卡因孵育時(shí)間的延長(zhǎng),體系熒光強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)并慢慢趨于穩(wěn)定,說(shuō)明可卡因與適配體逐漸趨于平穩(wěn)飽和,進(jìn)而熒光變?yōu)槠椒€(wěn). 因此選擇45 min作為可卡因與適配體最佳的孵育時(shí)間.

2.4 靈敏度檢測(cè) 在最優(yōu)條件下,研究了傳感器對(duì)可卡因檢測(cè)的靈敏度. 探針體系熒光強(qiáng)度隨不同濃度可卡因的變化[圖3(A)]表明,與空白樣品相比,隨著可卡因量的增加,其熒光強(qiáng)度不斷增強(qiáng),并且在0～100 μmol/L范圍內(nèi)表現(xiàn)出很好的線性關(guān)系. 由圖3(B)推導(dǎo)出檢出限(LOD)為0.66 μmol/L(S/N=3).

Fig.3 PL spectra of sensing system upon addition of cocaine in buffer solution(A) and the plot of relative intensity versus cocaine concentration(B)Inset of (B): the plot with cocaine concentration from 0 to 100 μmol/L. λex=340 nm; c(anticocaine aptamer)=0.2 μmol/L; c(TPE-TTA)=5 μmol/L.

選取不同種類的其它非法藥物(嗎啡、咖啡因、美沙酮、甲基苯丙胺、氯胺酮和MDPA)與可卡因進(jìn)行對(duì)照實(shí)驗(yàn)(圖S10,見本文支持信息). 結(jié)果表明,在同等條件下,由于其它非法藥物無(wú)法與適配體形成Y型雙鏈結(jié)構(gòu),在加入Exo Ⅰ后被降解. 因此只有可卡因在加入TPE-TTA后熒光強(qiáng)度明顯增強(qiáng),其它干擾物幾乎沒(méi)有引起TPE-TTA熒光的變化,表明該傳感器可以實(shí)現(xiàn)對(duì)可卡因的選擇性識(shí)別.

為了驗(yàn)證該傳感器可以對(duì)實(shí)際樣品中的可卡因進(jìn)行檢測(cè),選擇實(shí)際尿液作為檢測(cè)對(duì)象,在相同條件下,將實(shí)際尿液進(jìn)行稀釋,向其中摻入不同濃度的可卡因進(jìn)行熒光光譜測(cè)試. 由圖S11(見本文支持信息)可見,隨著可卡因摻入量的增加,熒光強(qiáng)度不斷增強(qiáng). 在一定范圍內(nèi)呈現(xiàn)線性增強(qiáng),通過(guò)計(jì)算得到最低檢出限為1.0 μmol/L. 為了驗(yàn)證該熒光傳感器在實(shí)際樣品中同樣具有很好的選擇性(圖S12,見本文支持信息),對(duì)其它的非法藥物進(jìn)行了選擇性檢測(cè),發(fā)現(xiàn)只有在可卡因存在下其熒光強(qiáng)度才能增強(qiáng),證實(shí)該傳感器具有在實(shí)際樣品中檢測(cè)可卡因的潛在應(yīng)用價(jià)值.

值得指出的是,與傳統(tǒng)的熒光探針?lè)肿酉啾?本文采用的AIE探針具有絕對(duì)的優(yōu)勢(shì). 由圖S13(見本文支持信息)可見,在相同的條件下,選取了2種常用的熒光探針?lè)肿恿_丹明B與吖啶橙進(jìn)行適配體滴定的熒光測(cè)試. 結(jié)果表明,TPE-TTA在極微量的適配體存在下即可以引起較大的熒光變化,而其它探針?lè)肿踊緵](méi)有響應(yīng). 另外,與可卡因檢測(cè)試劑盒相比,本文的檢測(cè)方法與其具有類似的檢出限且具有很好的選擇性[30,31]; 而與應(yīng)用較為廣泛的儀器分析及電化學(xué)傳感相比,該熒光傳感器在保證較低檢出限的前提下可以有效地避免大型儀器不利于即時(shí)檢測(cè)及價(jià)格昂貴的問(wèn)題,同時(shí)還避免了電化學(xué)傳感中時(shí)間穩(wěn)定性差導(dǎo)致的頻繁校準(zhǔn)和電極結(jié)垢問(wèn)題[32～35]. 上述結(jié)果說(shuō)明,AIE探針及檢測(cè)手段具有較大的商業(yè)化應(yīng)用潛力,有利于快速打擊毒品犯罪和維護(hù)社會(huì)穩(wěn)定.

綜上所述,本文開發(fā)了一種基于AIE分子/適配體/外切酶Ⅰ體系的檢測(cè)手段,通過(guò)熒光強(qiáng)度的變化可實(shí)現(xiàn)對(duì)可卡因的高靈敏、高選擇性檢測(cè). 該體系不僅能在緩沖溶液中,而且能在尿液中實(shí)現(xiàn)對(duì)可卡因的檢測(cè),其檢測(cè)限可分別低至0.66和1.0 μmol/L,且不受其它非法藥物的干擾. 與其它檢測(cè)方法相比,這種熒光傳感器大大節(jié)省了實(shí)際樣品前處理的時(shí)間,為現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)可卡因提供了依據(jù). 同時(shí)該傳感器設(shè)備簡(jiǎn)易,操作簡(jiǎn)單,具有實(shí)現(xiàn)小型化檢測(cè)的潛質(zhì).

支持信息見http://www.cjcu.jlu.edu.cn/CN/10.7503/cjcu20190681.