何 聿,夏 倩,王文莉,羅 芳,陳金鳳,郭雅婷, 王 建,林振宇,陳國南

(1. 福州大學(xué)食品安全與生物分析教育部重點實驗室, 2. 生物科學(xué)與工程學(xué)院,福州 350116; 3. 中國認(rèn)證檢驗集團福建有限公司,福州 350116)

農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中廣泛使用的農(nóng)藥會隨著雨水和地表水的循環(huán)而遷移到水生環(huán)境中,并對水生生物和環(huán)境產(chǎn)生負(fù)面影響[1]. 由于食物鏈的相互聯(lián)系,殘留農(nóng)藥將通過食物鏈傳播并迅速富集,引起食物鏈頂端的物種中毒,或誘發(fā)某些慢性疾病[2,3]. 迄今,科研人員已對水體中的農(nóng)藥污染進行了大量研究[4,5]. 如,酶抑制率法是用于農(nóng)藥殘留快速檢測最廣泛使用的方法[6],但該方法準(zhǔn)確性不佳,有時會出現(xiàn)誤檢的情況; 色譜法,包括氣相色譜、液相色譜、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用和液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用等,可簡化樣品純化步驟,直接從蔬菜、水果和河水樣品中提取農(nóng)藥殘留,因此常被用于分析各類樣品中的農(nóng)藥殘留. 上述方法多為直接測定水生環(huán)境中農(nóng)藥殘留的含量. 近年來,生物標(biāo)志物開始應(yīng)用于評估污染[7]. 在受污染的水生環(huán)境中,水生生物的生理機制能更敏感地反映環(huán)境變化[8,9],通過觀察水生生物的生理生化反應(yīng),可以了解農(nóng)藥對水生環(huán)境的影響[10],從而防止過度使用農(nóng)藥造成嚴(yán)重水體污染,保護水生生物和水生環(huán)境[11]. 因此,已有越來越多的研究側(cè)重于生物標(biāo)志物的研究和生物監(jiān)測技術(shù)的開發(fā),如有機磷農(nóng)藥[12,13]和氨基甲酸酯農(nóng)藥可以抑制膽堿酯酶的活性[14],導(dǎo)致體內(nèi)乙酰膽堿(Ach)的大量積累. 文獻[15]報道,內(nèi)分泌干擾物質(zhì)(EDC)的混合物會影響幼年水獺的脂肪形成和脂肪沉積. 也有研究[16]表明,金屬污染含量與水生生物的生理反應(yīng)之間具有高度相關(guān)性. 在上述研究中,使用了差異性代謝物反應(yīng)來考察污染物的環(huán)境暴露與生物學(xué)效應(yīng)之間的關(guān)聯(lián)性. 這些差異性代謝物具有高靈敏度,可作為農(nóng)藥污染的早期判斷指標(biāo),也可作為水生生態(tài)系統(tǒng)風(fēng)險評估的生物指標(biāo)[17,18]. 而且,生物標(biāo)記物的變化通常早于個體的表觀生理變化,可作為嚴(yán)重污染的預(yù)警指標(biāo)[19].

本文以成年雄鯽魚為模型,采用UPLC-QTOF-MS法研究了3種不同類型的農(nóng)藥(敵百蟲、高效氯氰菊酯和吡蟲啉)對其生理代謝的影響,篩選并鑒定出TGs等差異性物質(zhì),并研究了這些差異性物質(zhì)的含量變化與暴露時間和暴露濃度的關(guān)系,以發(fā)現(xiàn)反映污染物存在的生物標(biāo)志物. 所鑒定出的TGs可在低濃度暴露2 h內(nèi)產(chǎn)生響應(yīng),而目前關(guān)于農(nóng)藥對水生生物毒性的研究通常需要96 h甚至更長的時間[20].

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

乙腈和甲醇(質(zhì)譜級,德國Merck公司); 甲酸(質(zhì)譜級,美國ACS公司); 氫氧化鈉(純度99.99%,美國Sigma-Aldrich公司); 亮氨酸腦啡肽(美國Waters公司); 甲酸銨(純度≥99.0%)和丁香油(C.P.級)(中國上海阿拉丁公司); 敵百蟲、高效氯氰菊酯及吡蟲啉均為市售產(chǎn)品.

Waters Acquity UPLC型液相色譜儀、Xevo G2 QTOF/MS型質(zhì)譜儀和UPLC BEH HILIC型色譜柱(2.1 mm×75 mm×1.7 μm),美國Waters公司; 超純水來自Direct-Q3 UV系統(tǒng)(18.2 MΩ·cm,德國Merck Millipore公司).

1.2 實驗過程

1.2.1 魚類材料 從當(dāng)?shù)厥袌鲑彽眯迈r鯽魚[(300±50) g]. 實驗前,在玻璃魚缸中飼養(yǎng)7 d,每日定時用商業(yè)飼料喂食一次,正常光照、通氧.

1.2.2 魚類暴露實驗和樣品收集 在考察暴露時間的影響時,將鯽魚分別暴露于20 ng/mL敵百蟲、20 ng/mL高效氯氰菊酯或20 ng/mL吡蟲啉中,取樣時間分別為0,2,4,6,8和10 h(0 h為空白對照組); 在考察濃度的影響時,將鯽魚隨機分成6組(吡蟲啉濃度分別為0,1,2,5,10和20 ng/mL,0 ng/mL為空白對照組),暴露時間均為2 h. 暴露過程中無死亡.

將空白組與暴露組各抽取12個平行樣本(n=12). 取樣時,先用丁香酚麻醉鯽魚,然后在冰上用消毒后的手術(shù)刀解剖,取出腦部和肝臟組織,用0.2%(體積分?jǐn)?shù))甲酸溶液沖洗血跡,在液氮中冷凍并于-80 ℃儲存,備用.

1.2.3 樣品前處理 將組織樣品從-80 ℃冰箱中取出,解凍. 將0.1 g樣品與1 mL甲酸溶液(體積分?jǐn)?shù)0.2%,4 ℃)混合,用細(xì)胞破碎儀打碎得到勻漿液,加入12 mL甲酸-乙腈溶液(體積分?jǐn)?shù)0.2%,4 ℃)以沉淀蛋白. 靜置2 h后,冷凍離心10 min(12000 r/min,4 ℃). 用0.22 μm有機濾膜過濾上層清液,用于UPLC-QTOF-MS分析.

1.2.4 UPLC-QTOF-MS分析 超高效液相色譜分離條件: ACQUITY UPLC BEH HILIC柱(2.1 mm×75 mm×1.7 μm); 流動相A為水(含0.125% 甲酸和10 mmol/L甲酸銨); 流動相B為乙腈/甲醇/水混合溶液(體積比90∶5∶5,含0.125%甲酸和10 mmol/L甲酸銨); 流速0.3 mL/min; 柱溫35 ℃; 流動相以90%B等度洗脫,5 min內(nèi)完成.

質(zhì)譜分析條件: 電噴霧電離源,MSE正模式,離子源溫度120 ℃,輔助噴霧電離與脫溶劑氣為高純氮氣,脫溶劑氣溫度550 ℃,脫溶劑氣流速1000 L/h,錐孔反吹氮氣流速50 L/h,毛細(xì)管電壓1.0 kV,錐孔電壓20 V,碰撞能量10～30 V,碰撞氣為氬氣,質(zhì)量掃描范圍為m/z50～1000,采用亮氨酸-腦啡肽溶液校正,采用甲酸鈉溶液用于創(chuàng)建校準(zhǔn),確保儀器的準(zhǔn)確性<0.5 mDa.

1.2.5 數(shù)據(jù)采集和生物標(biāo)志物鑒定 使用Masslynx軟件采集數(shù)據(jù),所得數(shù)據(jù)用UNIFI軟件分析,根據(jù)其質(zhì)荷比(m/z)、保留時間(Retention time)、二級碎片信息及信號強度篩選差異代謝物[21]. 并根據(jù)上述信息在脂質(zhì)數(shù)據(jù)庫(http://www.lipidmaps.org)、人類代謝組數(shù)據(jù)庫(http://www.hmdb.ca/)和其它開放獲取數(shù)據(jù)庫中進行檢索,鑒定環(huán)境污染的潛在生物標(biāo)志物,其中理論質(zhì)量數(shù)與實際測得的質(zhì)量數(shù)的質(zhì)量誤差閾值設(shè)置為5×10-6.

2 結(jié)果與討論

2.1 不同農(nóng)藥暴露的代謝輪廓比較

應(yīng)用超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(UPLC-QTOF-MS)對分別暴露于敵百蟲、高效氯氰菊酯和吡蟲啉(20 ng/mL)中2 h的鯽魚進行分析. 圖1為3種農(nóng)藥暴露前后,鯽魚腦部和肝臟組織的總離子流(TIC)圖. 可見,空白對照組與暴露組樣品中的代謝產(chǎn)物存在細(xì)微差異,隨后通過UNIFI軟件鑒定了差異性物質(zhì).

Fig.1 Total ion chromatograms(TIC) of brain(A) and liver tissues(B)(A1,B1) Blank; (A2,B2) exposure in trichlorfon; (A3,B3) exposure in β-cypermethrin; (A4,B4) exposure in imidacloprid.

2.2 不同暴露條件下的差異性比較

采用火山圖(圖2)對比分析了敵百蟲暴露組(20 ng/mL,2 h)、高效氯氰菊酯暴露組(20 ng/mL,2 h)和吡蟲啉暴露組(20 ng/mL,2 h)中腦部和肝臟組織的內(nèi)源代謝物的變化. 可見,暴露組的腦部組織[圖2(A1)～(C1)]的差異小于肝臟組織[圖2(A2)～(C2)],這可能是因為肝臟作為生物體最重要的解毒器官,在低濃度農(nóng)藥暴露后其代謝機制的反應(yīng)比腦部靈敏. 此外,由圖2還可見,吡蟲啉暴露組肝臟的差異最為明顯. 因此,重點研究了吡蟲啉暴露組的差異,以篩選不同的差異代謝物.

Fig.2 Volcano plots of endogenous metabolites(n=12,*P<0.05)(A1) Trichlorfon-treated brain; (A2) trichlorfon-treated liver; (B1) β-cypermethrin-treated brain; (B2) β-cypermethrin-treated liver; (C1) imidacloprid-treated brain; (C2) imidacloprid-treated liver.

2.3 生物標(biāo)志物的篩選

使用UNIFI軟件,根據(jù)質(zhì)量誤差≤5 mDa,保留時間誤差≤0.1 min,差異倍數(shù)≥5的篩選原則,通過二元對比篩選出不同樣品之間的差異性物質(zhì),并對其進行鑒定. 圖3示出了吡蟲啉暴露后腦部和肝臟組織的二元對比結(jié)果.

Fig.3 Binary contrast spectra of brain(A) and liver(B) tissues(A1) Base peak intensity(BPI) of brain exposed for 0 and 2 h; (A2) chromatogram of difference in brain; (A3) mass spectrum of difference in brain; (B1) BPI of liver exposed for 0 and 2 h; (B2) chromatogram of difference in liver; (B3) mass spectrum of difference in liver.

表1列出了經(jīng)UNIFI軟件二元對比篩選出的差異性物質(zhì). 篩查結(jié)果顯示,暴露前后腦部組織中差異性物質(zhì)的差異并不顯著,差異倍數(shù)均小于2; 而在肝臟組織中,篩選出一系列差異性物質(zhì),其中差異物質(zhì)m/z146.1175由UNIFI的代謝庫中鑒定為乙酰膽堿(Acetylcholine,Ach),其差異倍數(shù)為1.056,而在m/z800～1000范圍內(nèi)則篩選出較多差異倍數(shù)大于5的差異性物質(zhì).

以UNIFI篩選出的差異性物質(zhì)m/z896.7709為例,圖4(A)示出了對照組(0 h)與暴露組(2,4,6,8和10 h)中該物質(zhì)的保留時間,圖4(B)為對應(yīng)的質(zhì)譜圖. 通過圖4(C)所示色譜峰面積的變化考察了暴露時間對該差異性物質(zhì)含量的影響,可見,其在吡蟲啉暴露2 h后迅速堆積,隨即開始呈下降趨勢,這可能與肝臟的解毒和生物體的自我修復(fù)能力有關(guān). 表1中差異倍數(shù)大于5的其它物質(zhì)(m/z872.7726,874.7867,896.7709,898.7881和900.8013)也存在類似的變化規(guī)律. 因此推測,這些物質(zhì)可能是吡蟲啉暴露的潛在生物標(biāo)記物.

Table 1 Information of representative components with high responses in brain and liver samplesexposed to imidacloprid(0 and 2 h)

Fig.4 Effect of exposure time on endogenous metabolite(m/z 896.7709) (A) BPI of endogenous metabolite(m/z 896.7709). Exposure time/h: a. 0; b. 2; c. 4; d. 6; e. 8; f. 10; (B) mass spectrum of endogenous metabolite(m/z 896.7709); (C) effect of exposure time on peak area of endogenous metabolite(m/z 896.7709)(n=12,*P<0.05).

2.4 生物標(biāo)志物的鑒定

對上述生物標(biāo)記物通過在線數(shù)據(jù)庫(LMSD和HMDB)進一步鑒定. 根據(jù)誤差范圍內(nèi)精確分子量及相應(yīng)的二級碎片信息,可準(zhǔn)確地鑒定其元素組成和結(jié)構(gòu). 表2列出了與數(shù)據(jù)庫匹配的差異代謝物的信息,精確分子量誤差均小于5×10-6. 由表2可知,在吡蟲啉暴露組中,肝臟組織的差異代謝物主要為甘油三酯類(TGs)物質(zhì). 結(jié)合二級質(zhì)譜信息可進一步確認(rèn)該類物質(zhì). 圖5(A)和(B)分別給出了可能生物標(biāo)志物(m/z806.5728和896.7709)的二級質(zhì)譜圖,并將其與HMDB網(wǎng)站數(shù)據(jù)庫中預(yù)測的二級質(zhì)譜圖[圖5(C)和(D)]比較,結(jié)果一致. TGs由脂肪和肝臟合成而成,并儲存在脂肪組織中. 生物體通過分解代謝TGs為其自身的活動提供能量[22]. 當(dāng)鯽魚暴露于農(nóng)藥中時,農(nóng)藥中毒進入生物體并影響脂質(zhì)的動員過程[23,24],通過甘油三酯脂肪酶(ATGL)抑制TGs的特異性水解,導(dǎo)致短時間內(nèi)TGs的積累[25]. 已有研究[26]表明,大部分持久性有機污染物(POPs)和其它內(nèi)分泌干擾物化學(xué)物質(zhì)(EDCs)均可能改變各種脂質(zhì)調(diào)節(jié)水平,包括增加對肝臟膽固醇和TGs合成的刺激,且由POPs引起的脂質(zhì)代謝異常早于葡萄糖代謝異常. 據(jù)文獻[27]報道,吡蟲啉暴露導(dǎo)致脂質(zhì)蓄積引發(fā)肥胖以及相關(guān)疾病.

Table 2 Summary of information on different endogenous metabolites mainly lipids detected inESI positive ion mode of UPLC-QTOF-MS mass spectrometry

Fig.5 Comparison in detected MS/MS spectra and predicted MS/MS spectra in HMDB(A) Detected MS/MS spectrum of m/z 806.5728; (B) detected MS/MS spectrum of m/z 896.7709; (C) predicted MS/MS spectrum of m/z 806.5728; (D) predicted MS/MS spectrum of m/z 896.7709.

2.5 濃度依賴性實驗

Fig.6 Effect of exposure concentration(n=12,*P<0.05)(A) Heatmap of the metabolites in fish liver exposed to different concentrations(0,1,2,5,10,20 ng/mL) of imidacloprid for 2 h. Each concentration is represented in columns,and each metabolites in lines. Blue indicates low content,whereas red indicates high content; (B) Michaelis Menten equation fitting curve of m/z 896.7709 change with exposure concentration.

進一步研究了不同濃度的吡蟲啉對暴露的影響. 總體而言,隨著吡蟲啉暴露濃度的增加,大多數(shù)生物標(biāo)志物均呈現(xiàn)出蓄積的趨勢. 圖6(A)的熱圖示出了吡蟲啉暴露濃度對鯽魚肝臟組織中不同差異性代謝物的影響. 可見,暴露濃度低于5 ng/mL時,TG(52∶4),TG(52∶3),TG(54∶6),TG(54∶5)和TG(54∶4)含量相對穩(wěn)定; 當(dāng)暴露濃度高于5 ng/mL時會產(chǎn)生蓄積. 而磷脂酰膽堿[PC(38∶6),PC(40∶7)]和Ach在考察的暴露濃度范圍(0～20 ng/mL)內(nèi)并沒有明確的變化趨勢. 可見,與Ach和PCs相比,TGs對吡蟲啉暴露更為敏感. 以TG(54∶6)(m/z為896.7709)為例,其增長趨勢符合Origin非線性擬合的Michaelis-Menten方程模型[圖6(B)].

3 結(jié) 論

以鯽魚為模型,采用UPLC-QTOF-MS法研究了不同農(nóng)藥的低濃度暴露對其生理機制的影響,并鑒定出TGs作為吡蟲啉暴露的生物標(biāo)記物. 研究發(fā)現(xiàn),低濃度吡蟲啉暴露將導(dǎo)致鯽魚肝臟中TGs的蓄積,且TGs對于吡蟲啉暴露響應(yīng)非常靈敏,低濃度暴露2 h即可引起鯽魚肝臟中TGs的大量堆積. 該方法比長期大劑量暴露實驗更靈敏且更適用于初步檢測,尤其適用于對水生環(huán)境中農(nóng)藥污染的早期預(yù)警.